GCMS op een apotheeklaboratorium

A
Extr ct
GCMS op een apotheeklaboratorium
Erik Olyslager
Apotheek Gelre ziekenhuizen
Klin. Farm. & Tox. Laboratorium
Postbus 9014
7300 DS Apeldoorn
[email protected]
www.docfrog.nl
1. Inleiding
De laatste jaren is de LCMS met triple quadropole heel
gebruikelijk in veel apotheek laboratoria. De massaspectrofotometer is echter al een jaar of 25 geleden voorzichtig
binnengedrongen in het laboratorium van de apotheek.
Deze massaspectrometers waren toen nog gekoppeld aan
een gaschromatograaf (GCMS). De koppeling van een MS
(die onder vacuüm werkt) aan GC is namelijk veel eenvoudiger dan die aan een vloeistofchromatograaf (HPLC).
Bij de eerste zijn eluens en componenten al in gasvorm en
deze komen met een laag debiet (b.v. 1 ml per minuut) het
vacuüm binnen waardoor de detector gemakkelijk op
vacuüm gehouden kan worden. Bij LCMS moet veel vloeistof verdampt worden en de componenten in ion vorm worden gebracht in een ionenbron. Deze ontwikkeling heeft een
tijdje geduurd. Pas toen de prijzen van de triple quadropoles
binnen het budget van de wat grotere apotheek laboratoria
kwamen is het snel gegaan met de LCMSMS .
Sindsdien lijkt de GCMS wel haast vergeten. Helaas is het
succes van de GCMS in de apotheek laboratoria nooit zo
groot geweest als nu de LCMS. Toch kan een GCMS een
toegevoegde waarde hebben naast de LCMS.
2. GCMS versus LCMS
Niet alle componenten kunnen gemakkelijk met een GCMS
bepaald worden. Sommige stoffen zijn thermisch niet stabiel
of niet vluchtig genoeg en vaak is een derivatiseringsstap
nodig. Kortom de GCMS is minder breed inzetbaar dan de
LCMS. Ook lijkt het alsof GC in het algemeen wat moeilijker
wordt gevonden dan HPLC. Toch heeft de GCMS met single
quadropole enkele voordelen t.o.v. LCMSMS.
LCMSMS wordt in het algemeen in de Multiple Reaction
Monitoring (MRM) mode gebruikt. Hierbij wordt meestal
het molecuul ion geselecteerd en deze wordt vervolgens
gefragmenteerd. Eén of enkele fragmenten worden dan
gemeten. Dit is gevoelig en zeer selectief, zo selectief
4
dat alle componenten, waarvan de parameters niet in de
methode staan, worden gemist.
Er kan ook een compleet dochter spectrum worden opgenomen, maar dit dochterspectrum is nogal afhankelijk van
andere parameters zoals de collision energie. Ook in dit
geval moet er in de eerste quadropole een moeder ion
worden geselecteerd met als gevolg dat de rest wordt gemist.
De triple quadropole LCMS kan ook als single quadropole
worden gebruikt welke je alle ionen kunt laten meten.
In dat geval wordt er een compleet massaspectrum opgenomen worden. Aangezien de ionisatie van de LCMS
veel zachter is dan die bij de GCMS, zie je dan meestal
een massaspectrum met alleen het molecuul ion met wat
isotopen. Om toch nog wat fragmenten te produceren wordt
dan de spanning in de bron (cone voltage) hoger gekozen
waardoor er fragmentatie in de bron optreedt. Dit geeft
dan een massaspectrum met daarin meerdere pieken.
Dit proces is nogal apparaat afhankelijk waardoor de
bibliotheken ook weer apparaat afhankelijk zijn. Deze
manier van onbekenden screening kan wel werken als de
mengsels schoon zijn en de matrix niet te ingewikkeld. In
de praktijk van ons laboratorium met screeningen in serum
en urine blijkt deze methode toch niet goed te werken.
Vaak krijg, je zeker bij urine, door achtergrond en storende
piekjes mengspectra, wat het zoeken in een bibliotheek
welhaast onmogelijk maakt.
De GCMS met een enkele quadrople (of ion trap) heeft deze
problemen veel minder. De Electron Ionization (EI) waarbij in
het geval van GCMS meestal gebruikt van gemaakt wordt,
zorgt voor apparaat onafhankelijke massaspectra. Deze
spectra bevatten in het algemeen weinig molecuulmassa,
maar wel meerdere fragmenten. Het zoeken in de bibliotheek wordt zo heel gemakkelijk. Deze bibliotheken zijn
heel uitgebreid en commercieel verkrijgbaar. Doordat de
MS is gekoppeld aan een GC zijn de pieken heel smal
en het scheidend vermogen dus enorm. Er is daardoor
minder snel last van storende pieken en daardoor vervuilde
massaspectra.
Een GCMS is ook niet zo heel duur meer en heel snel te
gebruiken want er zijn geen eluens of kolomwisselingen
nodig. Kortom de GCMS is altijd klaar voor gebruik.
3. Vals positieve amfetamine uitslagen
Naast farmaceutische analyses, toxixologie, TDM en enkele
klinisch chemische bepalingen zoals vitaminen, worden op
ons lab voor diverse instellingen drugs in urine bepaald.
A
3. Vals positieve amfetamine uitslagen
Extr ct
Naast farmaceutische analyses, toxixologie, TDM en enkele klinisch chemische bepalingen zoals vitaminen,
worden op ons lab voor diverse instellingen drugs in urine bepaald. De laatste tijd kwam het met enige
regelmaat voor dat de urine van sommige patienten met immunoassayscreening voor amfetamine positief
scoorden. De cliënten beweerden pertinent dat ze niet gebruikt hadden. Ook onze XTC test met
immunoassay scoorde 100% negatief. Na bevestiging op LCMSMS werden telkens geen amfetamineachtigen teruggevonden. Dit zat ons toch niet helemaal lekker. We wisten namelijk nog steeds niet waar
deze positieve uitslagen vandaan kwamen. Was het misschien een hoge tyramine concentratie wat deze
kwamen.
Wasonze
het misschien
een hogeimmuno
tyramine test, moest
uitslag veroorzaakte? Gezien de kruisreactiviteit van daan
tyramine
voor
amfetamine
concentratie
wat
deze
uitslag
veroorzaakte?
Gezien
de kruisdeze dan wel heel hoog zijn. Dit bleek na meten van tyramine met LCMSMS ook niet het geval.
reactiviteit
van
tyramine
voor
onze
amfe-tamine
immuno
Tijd om de GCMS in te zetten. Een aantal vals positieve urines hadden we inmiddels verzameld. test,
Deze
deze dan
wel heel hoog zijn. Dit bleek naDe
meten
van
werden opgewerkt met een gecombineerde basische moest
extractiederivatiseringsmethode.
derivatisering
tyramine met LCMSMS ook niet het geval.
wordt gedaan met HeptaFluorBoterzuurAnhydride (HFBA).
Al deze monsters gaven een chromatogram met
Tijd om de GCMS in te zetten. Een aantal vals positieve
voorin een heel grote piek (zie figuur 1). Deze piek komt
nog vroeger dan amfetamine in het GCMS
urines hadden we inmiddels verzameld. Deze werden opDe laatste tijd kwam het met enige regelmaat voor dat de
chromatogram. Het massaspectrum is best specifiek en bij alle monsters hetzelfde maar kon niet door onze
gewerkt met een gecombineerde basische extractieurine van sommige patienten met immunoassayscreening
bibliotheken worden geïdentificeerd.
derivatiseringsmethode. De derivatisering wordt gedaan met
voor amfetamine positief scoorden. De cliënten beweerden
Dit chromatogram en massaspectrum kwam me overigens bekend voor. Hetzelfde had ik al eerder gezien in
HeptaFluorBoterzuurAnhydride (HFBA). Al deze monsters
pertinent dat ze niet gebruikt hadden. Ook onze XTC test met
2002 bij mijn toenmalige werkgever. Ook toen hetzelfde verhaal. Cliënt beweert pertinent niet gebruikt te
gaven een chromatogram met voorin een heel grote piek (zie
immunoassay scoorde 100% negatief. Na bevestiging op
hebben en bevestiging (met GCMS) gaf aan dat de cliënt
gelijk had. Net als nu werd de grote piek voorin het
figuur 1). Deze piek komt nog vroeger dan amfetamine in het
LCMSMS werden telkens geen amfetamine-achtigen terugchromatogram
van
de
vals
positieve
uitslag
verdacht.
Door
de plaats in het chromatogram verwacht je een
GCMS chromatogram. Het massaspectrum is best specifiek
gevonden. Dit zat ons toch niet helemaal lekker. We wisten
klein
molecuul
met
een
vrije
amine
die
gederivatiseerd
wordt
door HFBA.
en bij alle monsters
hetzelfde maar kon niet door onze
namelijk nog steeds niet waar deze positieve uitslagen van-
Figuur 1 : GCMS chromatogram van een urine monster positief op amfetamine na derivatisering met HFBA.
Door de zeer grote vroege piek vallen overige pieken bijna weg. ▼
Figuur 1 : GCMS chromatogram van een urine monster positief op amfetamine na derivatisering met HFBA. Door de zeer
grote vroege piek vallen overige pieken bijna weg.
5
De component die de vals positieve amfetamine veroorzaakt bleek uiteindelijk cyclohexylamine te zijn. Dit is
een metaboliet van cyclamaat (figuur 2)
atogram van een urine monster positief op amfetamine na derivatisering met HFB
overige pieken bijna weg.
A
Extr ct
Figuur 1 : GCMS chromatogram van een urine monster positief op amfetamine na derivatisering m
grote vroege piek vallen overige pieken bijna weg.
vals positieve amfetamine veroorzaakt bleek uiteindelijk cyclohexylami
yclamaat (figuur
2)
De component die de vals positieve amfetamine veroorzaakt bleek uiteindelijk cyclohex
een metaboliet van cyclamaat (figuur 2)
Figuur 2 : natriumcyclamaat
Figuur
2 : natriumcyclamaat
Figuur 3 : Cyclohexylamine
Figuur 3 : Cyclohexylam
lamaat
Figuur
3 : Cyclohexylamine
Cyclamaat is het natrium- of calciumzout van
cyclaamzuur.
Het is 30-50 keer zoeter da
bibliotheken
worden
geïdentificeerd.
4. Conclusie
geen
calorieën.
Cyclamaat wordt toegevoegd
aan light producten zoals sommige frisdra
Dit chromatogram
en massaspectrum
kwam me
overigens
fruitdranken.
Normaal
wordt
cyclamaat maar voor een klein deel opgenomen door het
bekend voor. Hetzelfde had ik al eerder gezien in 2002 bij
De besproken casus geeft duidelijk de meerwaarde aan van
onveranderd door de nieren uitgescheiden.
Het grootste deel echter verlaat ons lichaam
mijn toenmalige werkgever. Ook toen hetzelfde verhaal.
GCMS. Omdat alles wat uit de GC komt gezien wordt door
ontlasting.
Bij
7-11%
van
de
mensen
wordt
echter
een
deel
van
de
cyclamaat
in de
da
ium- ofCliënt
calciumzout
vante hebben
cyclaamzuur.
is er30-50
keer
zoeter
sac
beweert pertinent niet gebruikt
en
deHet
MS, worden
geen
componenten
gemist.
Ook al stonddan
bevestiging
(met GCMS) gaf aan omgezet
dat de cliënt gelijk
had.
cyclohexylamine.HFB niet in onze bibliotheek, de grote piek
darmbacteriën
in cyclohexylamine.
maat wordt
toegevoegd
aan
light
producten
zoalshebben
sommige
frisdranken
Net als nuOm
werd
de
grote
piek
voorin
het
chromatogram
van
voorin
het chromatogram
heeft
ons inwe
actie aan
gebracht
al te veel bevestigingsonderzoeken
te voorkomen
dewat
immunoassay
de vals positieve uitslag verdacht. Door de plaats in het
uiteindelijk tot de oplossing heeft geleid. In eerste instantie
l wordtchromatogram
cyclamaat
maar
voor
een
klein
deel opgenomen
door hetmet
lichaa
gedaan
door
in geval
van een
positieve
amfetamine
nogmaals te analyseren
een a
verwacht je een klein molecuul met een vrije
hebben we alle positieve amfetamine urines verzameld
assay
welke
minder
gevoelig
is
voor
cyclohexylamine.
amine die gederivatiseerd wordt door HFBA.
en standaard bevestigd met LCMS. Dit leverde regelmatig
nieren uitgescheiden. Het grootste deel
echter verlaat ons lichaam onve
uitslagen op waarin amfetamines niet werden aangetoond.
voor een
analist
niet altijd bevredigendin
en dede
klant darmen
component die de wordt
vals positieve echter
amfetamine veroorzaakt
van deDemensen
een deelDit isvan
de
cyclamaat
4. Conclusie
stelde soms terecht de vraag: “maar wat veroorzaakt dan
bleek uiteindelijk cyclohexylamine te zijn. Dit is een
geeft duidelijk de de
meerwaarde
aan
van
Omdat
zet in cyclohexylamine.
positieve uitslag dan
wel?”
Het GCMS.
liefst wil je altijd
preciesalles wat uit
metabolietDe
vanbesproken
cyclamaat (figuurcasus
2)
wordt door de MS, worden er geen componenten
gemist.
al stondis.cyclohexylamine
aangeven welke stof
waar voorOok
verantwoordelijk
gingsonderzoeken
tecalciumzout
voorkomen
hebben
we aan
deons
immunoassay
kant
Dit lukt echter niet altijd.
Een GCMS
kan
zo’n geval
een
Cyclamaat
is het natrium- of de
cyclaamzuur.
bibliotheek,
grotevan
piek
voorin het chromatogram
heeft
in in
actie
gebracht
wat uite
nuttige hulp
Het ispositieve
30-50
keer zoeter dan
sacharose
en levert
geennogmaals
van een
amfetamine
tezijn.analyseren
met
een andere
oplossing
heeft
geleid.
In eerste
instantie
hebben
we alle positieve
amfetamine
urines
calorieën. Cyclamaat wordt toegevoegd aan light producten
standaard
bevestigd
met LCMS. Dit leverde regelmatig uitslagen op waarin amfetamine
frisdranken
en fruitdranken. Normaal wordt
evoeligzoals
issommige
voor
cyclohexylamine.
aangetoond. Dit is voor een analist niet altijd bevredigend en de klant stelde soms tere
cyclamaat maar voor een klein deel opgenomen door het
lichaam en
onveranderd
door de nieren
Het uitslag
wat
veroorzaakt
danuitgescheiden.
de positieve
dan wel?” Het liefst wil je altijd precies aangev
Referenties
grootste deel
echter
verlaat
ons
lichaam
onveranderd
via
voor verantwoordelijk is. Dit lukt echter niet altijd. Een GCMS kan in zo’n geval een nu
de ontlasting. Bij 7-11% van de mensen wordt echter een
1) A.Kankaanpää et al; Single-step procedure for
deel van de cyclamaat in de darmen door darmbacteriën
gas chromatography-mass spectrometry
omgezet in cyclohexylamine.
screening and quantitative determination of
Om al te veel bevestigingsonderzoeken te voorkomen hebamphetamine-type stimulants and related drugs
ben we aan de immunoassay kant een aanpassing gedaan
in blood, serum, oral ﬂuid and urine samples;
1) A.Kankaanpää et al; Single-step procedure
for gas chromatography-mass spectrome
door in geval van een positieve amfetamine nogmaals te
Journal of Chromatography B, 810 (2004) 57-68.
quantitative
determination
ofminder
amphetamine-type stimulants and related drugs in blood
analyseren
met een andere amfetamine
assay welke
urine
samples; Journal of Chromatography
B, 810 (2004) 57-68.
gevoelig is
voor cyclohexylamine.
2) http://www.zoetstoffen.nl/zoetstof/cyclamaat-e952
geeft duidelijk
de meerwaarde aan van GCMS. Omdat alles wat uit de G
Referenties
orden er geen componenten gemist. Ook al stond cyclohexylamine.HFB
piek voorin het chromatogram heeft ons in actie gebracht wat uiteindeli
. In eerste instantie hebben we alle positieve amfetamine urines verzam
2) http://www.zoetstoffen.nl/zoetstof/cyclamaat-e952
met LCMS. Dit leverde regelmatig uitslagen op waarin amfetamines niet
or een analist niet altijd bevredigend en de klant stelde soms terecht de
de positieveColistine
uitslag dan
Het liefst wil
je altijd
aangeven w
– wel?”
een doorstart
van
een precies
oud middel
k is. Dit lukt echter niet altijd. Een GCMS kan in zo’n geval een nuttige h
6

Download Report