Effect van microburst nervus vagus stimulatie op
limbische aanvallen in het acuut pilocarpinemodel
Wouter VAN LYSEBETTENS
Verhandeling ingediend tot
het verkrijgen van de graad van
Master in de Biomedische Wetenschappen
Promotor:
Prof.
Dr.
Kristl
Vonck
Begeleidster: Lies Mollet, MSc, PhD student
Vakgroep Inwendige ziekten, neurologie
Academiejaar 2013-2014
ii
Effect van microburst nervus vagus stimulatie op
limbische aanvallen in het acuut pilocarpinemodel
Wouter VAN LYSEBETTENS
Verhandeling ingediend tot
het verkrijgen van de graad van
Master in de Biomedische Wetenschappen
Promotor:
Prof.
Dr.
Kristl
Vonck
Begeleidster: Lies Mollet, MSc, PhD student
Vakgroep Inwendige ziekten, neurologie
Academiejaar 2013-2014
iii
“De auteur en de promotor geven de toelating deze masterproef voor consultatie beschikbaar
te stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de
beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting
uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het aanhalen van resultaten uit deze masterproef.”
Datum
(handtekening student)
(handtekening promotor)
(Naam student)
(Naam promotor)
iv
Voorwoord
Graag wil ik mijn promotor, Prof. Dr. Kristl Vonck, bedanken voor mij de kans te geven te
proeven van wetenschappelijk onderzoek, alsook voor de opvolging en verbetering van deze
thesis, steeds op een geduldige en altijd vriendelijke wijze.
Ook bedank ik mijn begeleidster Lies Mollet, die vele kostbare uren besteed heeft aan het
aanleren van de nodige technieken en het beantwoorden van vragen.
In het bijzonder bedank ik Prof. Dr. Robrecht Raedt voor de kritische inbreng ondanks hij
hiertoe niet verplicht was.
Als laatste wil ik mijn ouders bedanken, voor mij de kans te geven deze richting in te slaan, voor
de steun tijdens de examenperiodes en voor de vele spellingscontroles van deze thesis.
v
Inhoudstafel
Samenvatting
Summary
1 Inleiding
1.1 Epilepsie
1.2 Gegeneraliseerde epilepsieën
1.2.1 Absence epilepsie
1.2.2 Gegeneraliseerde epilepsieën met ion-kanaal mutaties.
1.3 Partiële epilepsieën
1.3.1 Mesiale temporale kwab epilepsie (MTLE)
1.4 Behandeling
1.5 Nervus vagus
1.5.1 De anatomische component van de n. vagus
1.5.2 De functionele component van de n. vagus
1.6 VNS
1.6.1 De achtergrond van VNS
1.6.2 Vezeltypes en elektrische stimulatie van de n. vagus
1.6.3 De neurochemische gevolgen van VNS
1.6.4 Vagale-NTS synaps
1.6.5 De rol van de LC in VNS
1.6.6 Invloed NE op HC
1.6.7 Parameters VNS
1.6.8 Standaard VNS vs. Microburst VNS
1.6.9 De rationale van microburst VNS
1.7 Diermodel
1.7.1 Het focale pilocarpine model
1.7.2 Werkingsmechanisme pilocarpine
1.8 Intracerebrale microdialyse
1.9 LMEP
1.10 Probleemstelling en doelstelling
2 Materiaal en methoden
2.1 Proefdieren
2.2 Chemicaliën en reagentia
2.3 Samenstelling elektroden
2.3.1 VNS elektrode
2.3.2 Scalp-, cannula/- en aardingselektroden
2.4 Operatie
2.5 Registratie van de laryngeale motor-evoked potentialen (LMEP)
2.6 EEG monitoring, VNS en intracerebrale microdialyse
2.7 Protocol van het experiment
2.8 Aanvalsernst en EEG analyse
2.9 Microdialysaat analyse
2.10 Histologie
2.11 Data analyse
3 Resultaten
3.1 Meten van de LMEP
3.2 Effect van microburst VNS op limbische epileptische aanvallen en hippocampale
noradrenaline concentratie
vi
1
2
2
2
4
4
4
4
4
6
7
7
8
8
8
10
11
12
15
16
18
20
21
22
24
24
26
26
27
27
27
27
28
28
28
29
30
30
31
32
33
33
34
34
34
35
3.3 Post mortem verificatie microdialyse probe
4 Discussie
5 Algemeen besluit
6 Referenties
Bijlage I: Lijst van afkortingen
Bijlage II: Neurochemische analyse
vii
38
39
46
47
I
III
Samenvatting
Epilepsie is een van de meest voorkomende neurologische aandoeningen. 3% van de bevolking
zal ooit een epileptische aanval krijgen. Focale epilepsie is de meest voorkomende vorm
waarbij complex partiële aanvallen vaak ontstaan in de mesiale temporale regio (mTLE) van het
limbische systeem. Patiënten die refractair zijn aan anti-epileptische medicatie en geen
epilepsiechirurgie kunnen ondergaan zijn kandidaat voor neurostimulatie zoals diepe
hersenstimulatie en nervus vagus stimulatie (VNS). Bij deze laatste wordt via een subcutaan
thoracaal geïmplanteerd apparaat de 10e craniaalzenuw elektrisch gestimuleerd. Het
werkingsmechanisme van VNS is nog niet volledig gekend, maar geweten is dat de stimulatie
leidt tot een activiteitsstijging in de locus coeruleus, wat op zijn beurt leidt tot een verhoogde
concentratie aan noradrenaline in de hippocampus. Deze noradrenalinestijging is gecorreleerd
met een daling in aanvalsernst, -duur en -frequentie, en is een biomerker voor VNS efficaciteit
met standaard parameters. Optimalisatie van deze parameters zou kunnen leiden tot een verdere
verbetering van de aanvalscontrole, een daling van de neveneffecten en een stijging van de
levensduur van de geïmplanteerde batterij. Hiertoe werd een stimulatieprotocol met nieuwe
parameters opgezet, waarbij de elektrische pulsen in korte hoogfrequente uitbarstingen werden
toegediend, microbursts genaamd. De efficaciteit van deze microburst VNS werd getest in een
ratmodel voor limbische epileptische aanvallen uitgelokt door intrahippocampale perfusie van
het proconvulsief product pilocarpine. De duur, ernst en frequentie van epileptische aanvallen
werd bestudeerd via gedrags- en EEG analyse, en de concentratie noradrenaline werd gemeten
via in vivo microdialyse gevolgd door chromatografie. Hieruit bleek dat microburst geen
significante vermindering van epileptische activiteit teweegbracht, noch resulteerde in een
stijging van de hippocampale noradrenalineconcentratie. We hypothetiseren dat standaard VNS
een depressie uitlokt van de synaps tussen de n.vagus en de nucleus tractus solitarius (NST) op
een frequentie afhankelijke manier, wat leidt tot een desinhibitie van de LC. Het is reeds
bewezen dat microburst VNS aanvalsonderdrukkend werkt bij een frequentie van 100 Hz. Bij
een stimulatiefrequentie van 250 Hz zoals in deze studie echter was geen positief effect op de
epileptische activiteit waarneembaar. De reden hiervoor kan gevonden worden in een mogelijke
facilitatie van de n.vagus-NST synaps, wat in beperkte mate beschreven staat als mogelijk
gevolg van hoogfrequente stimulatie. Verder onderzoek is nodig om deze hypothese te
onderzoeken en om de microburst VNS parameters verder te optimaliseren.
1
Summary
Background. Vagus nerve stimulation (VNS) is an effective adjunctive treatment for medically
refractory epilepsy. VNS leads to an increased activity in the locus coeruleus (LC), the main
noradrenergic source of the brain, including the hippocampus. Hippocampal norepinephrine
increase is a biomarker for VNS. A new modality of VNS wherein the electrical pulses are
administered in a burstlike fashion has been proposed to increase VNS efficacy. This study
evaluates whether microburst VNS would result in an increased hippocampal norepinephrine
concentration in an animal model for limbic seizures
Methods. In vivo intracerebral microdialysis was used to measure the effect of microburstVNS
(250 µs, 250 Hz, 0.5mA, 4 pulses/burst, 0.5s interburst interval, 60s ON/5min OFF) on
hippocampal extracellular norepinephrine concentrations and pilocarpine-induced limbic
seizures in freely moving, male Wistar rats.
Results. Microburst VNS did not produce a significant increase in hippocampal noradrenaline
concentration, nor did it increase the latency between pilocarpine infusion and the onset of
epileptiform discharges, or reduce the duration and severity of limbic seizures. No correlation
was found between the noradrenergic and anticonvulsive effects of microburst VNS.
Conclusions. We hypothesize that standard VNS depresses the n.vagus-nucleus tractus
solitarius(NST) synaps in a frequency dependent manner, leading to a disinhibition of the LC.
Microburst VNS has been shown to be efficacious at 100 Hz frequency, yet our results show no
seizure parameter reduction nor hippocampal norepinephrine rise at 250 Hz. This might be due
to a possible facilitation of the n.vagus-NST synaps which has been shown to occur at high
frequencies.
1 Inleiding
1.1 Epilepsie
Epilepsie is een aandoening met als kenmerk de aanwezigheid van een abnormale verhoogde
voorbeschiktheid voor epileptische aanvallen. Dit gaat gepaard met neurobiologische,
cognitieve, psychologische en sociale gevolgen. Een epileptische aanval wordt gedefinieerd als
een transiënt voorkomen van tekenen of symptomen opgewekt door een abnormaal
overvloedige of synchrone neuronale activiteit in de hersenen (2). Per definitie wordt pas
gesproken van epilepsie bij het vervullen van een van de volgende condities: 1. Het voorkomen
2
van minstens twee niet uitgelokte (spontane) epileptische aanvallen gescheiden door meer dan
24u, 2. Een spontane epileptische aanval en een probabiliteit voor volgende aanvallen gelijk aan
het algemene herhalingsrisico (minstens 60%) na twee spontane aanvallen, voorkomend in een
tijdsspan van de volgende 10 jaar of 3. De diagnose van een epilepsie syndroom(3).
Een epileptische aanval is ‘transiënt’, afgebakend in de tijd, met een duidelijk begin en einde.
Dit laatste is soms minder evident vanwege een mogelijke maskering door de symptomen van
het postictaal stadium (tijdelijke verwardheid na de aanval). Een status epilepticus is een
speciaal (en uitzonderlijk) stadium met verlengde of wederkerende epileptische aanvallen.
Epileptische aanvallen presenteren zich onder verschillende klinisch waarneembare vormen
afhankelijk van de locatie waaruit de aanval ontstond (epileptische focus), het
propagatiepatroon van de epileptische activiteit, de mate van volgroeidheid van de hersenen
(maturiteit), simultaan aanwezige aandoeningen, slaap-waak cyclus, medicatie en andere
factoren. Epileptische aanvallen beïnvloeden sensorische, motorische en autonome functies,
alsook het bewustzijn, emotionele toestand, geheugen, cognitie en gedrag. Niet elke soort
epileptische aanval beïnvloedt al deze factoren, maar steeds minstens één (2).
De cerebrale cortex is de belangrijkste speler in het genereren van epileptische aanvallen, maar
niet de enige. Onder sommige omstandigheden kunnen epileptische aanvallen ontstaan vanuit
thalamocorticale interagerende systemen of vanuit de hersenstam (2).
Epilepsie is de tweede meest voorkomende neurologische aandoening na cerebrovasculaire
aandoeningen (4). Wereldwijd zijn minstens 65 miljoen mensen gediagnosticeerd met epilepsie
(5). De gerapporteerde cijfers van het voorkomen van epilepsie variëren aanzienlijk afhankelijk
van de bestudeerde populatie, maar over het algemeen vindt men een incidentie van 50 per 100
000 inwoners en een prevalentie van 0.7% (6). De cumulatieve incidentie, zijnde de proportie
van de populatie die epilepsie ontwikkelt over een bepaalde tijd, bedraagt 1% voor 20-jarigen
en 3% bij een leeftijd van 75 jaar (7).
Men kan de epilepsieën onderverdelen in twee grote categorieën; de gegeneraliseerde en
partiële (of focale) syndromen. In gegeneraliseerde epilepsieën begint het merendeel van de
epileptische aanvallen gelijktijdig in beide cerebrale hemisferen. De meeste van deze
syndromen hebben een sterk genetische component. Bij partiële epilepsie echter, beginnen de
3
aanvallen in één of meerdere gelokaliseerde foci. Deze kunnen nog uitbreiden naar de andere
hersenhelft en aldus het gehele brein aantasten, wat men secundaire generalisatie noemt. Er
wordt verondersteld dat aan de basis van de meeste partiële epilepsiesyndromen een of
meerdere trauma’s aan het centraal zenuwstelsel liggen, echter in vele gevallen kan de precieze
oorzaak niet achterhaald worden (5).
1.2 Gegeneraliseerde epilepsieën
1.2.1 Absence epilepsie
Absence epilepsie is een gegeneraliseerd epilepsiesyndroom dat ontstaat op de leeftijd van 4 tot
8 jaar en zich presenteert als absence- aanvallen, en in zeldzame gevallen gegeneraliseerde
tonisch-clonische aanvallen. Tijdens de absence-aanvallen staren de patiënten en stoppen ze
met de normale handelingen voor enkele seconden, gevolgd door het onmiddellijk verderzetten
van deze activiteiten zonder geheugensporen van deze gebeurtenis (5).
1.2.2 Gegeneraliseerde epilepsieën met ion-kanaal mutaties.
Alhoewel de meeste gegeneraliseerde epilepsieën een complex overervingspatroon hebben, zijn
sommigen geassocieerd met een mendeliaans overervingspatroon en single-gene mutaties.
Bijna al deze mutaties werden gevonden in genen die encoderen voor ion-kanaalproteïnen
leidend tot hyperexciteerbaarheid van de corticale neuronen. Gezien deze genen tot expressie
gebracht worden in het volledige brein wordt verondersteld dat een mutatie leidt tot een diffuus
effect en een algemene verhoogde susceptibiliteit voor een gegeneraliseerd epilepsiesyndroom
(5).
1.3 Partiële epilepsieën
1.3.1 Mesiale temporale kwab epilepsie (MTLE)
Partiële epileptische aanvallen zijn de meest voorkomende vorm van epilepsie bij volwassenen,
vaak afkomstig van een focale laesie zoals hoofdtrauma (trauma capitis), beroertes of tumoren.
De meest prevalente van deze syndromen is MTLE, waarbij complex partiële epileptische
aanvallen ontstaan vanuit de mesiale temporaalkwab, meer bepaald structuren zoals de
hippocampus, amygdala en de aansluitende parahippocampale cortex. De epileptische
aanvallen kunnen beginnen met olfactorische of gustatoire hallucinaties, een epigastrische
sensatie of psychische symptomen zoals déjà vu’s of depersonalisatie. Eens de aanval evolueert
naar bewustzijnsverlies kan de patiënt wezenloos voor zich uitstaren, onsamenhangend spreken
4
of automatismen vertonen zoals orofaciale bewegingen (smakken met de mond) of onbewust
kleren oprapen (5).
De meest voorkomende laesie
die kan gevonden worden bij
patiënten
met
MTLE
is
hippocampale sclerose (HS)
(figuur
1).
gekenmerkt
Dit
door
wordt
selectief
neuronaal verlies in de hilus
van de gyrus dentatus en de
pyramidale cellaag, met een
relatief
behouden
van
de
granulaire gyrus dentatus cellen
Figuur 1: postmortem coupe van de hippocampus van een
en een kleine zone in de
neurologisch
pyramidale cellen in het cornu
hippocampale sclerose door mTLE. (B) De cornu ammonis regio’s
ammonis veld 2 (CA2) van de
CA1 tot CA4 zijn aangeduid + het subicculum (SC). Een duidelijke
hippocampus. De dense gliose
die gepaard gaat met het
gezonde
persoon
(A)
en
een
persoon
met
gescleroseerde CA1 regio met een abrupte overgang van CA1 naar
SC is zichtbaar. Figuur C toont de normale granulaire cellaag
(GCL)van de
gyrus dentatus, terwijl bij (D) er een duidelijke
neuronaal verlies veroorzaakt
granulaire dispersie aanwezig is die de grenzen van de cellagen
verharding en inkrimping van
overschrijd. Figuur overgenomen van malmgren et al. (1)
het weefsel. Vaak is er ook neuronaal verlies in de naburige entorhinale cortex en amygdala, wat
gedefinieerd wordt als mesiale temporale sclerose. Of HS een oorzaak of gevolg is van
epileptische aanvallen is niet geweten. Het is mogelijk dat HS een finale pathologische
gemeenschappelijke pathway representeert waarbij een aantal verschillende oorzaken leiden tot
MTLE (5).
De best beschreven verandering in het epileptogeen mechanisme is het ontspruiten van
mosvezel axonen van de granulaire cellen in de gyrus dentatus (mossy-fiber sprouting).
Normaal komt de excitatoire input vanuit de naburige entorhinale cortex de hippocampus
binnen langs de granulaire gyrus dentatus cellen. Inhibitoire input ontstaat lokaal vanuit de
interneuronen in de binnenste moleculaire laag. Vanuit de granulaire dentaatcellen ontstaan
mosvezelaxonen die uitlopen naar de pyramidale neuronen als deel van de hippocampale output
5
pathway. Normaal gezien zijn deze granulaire dentaatcellen relatief resistent tegen
hypersynchrone activatie en zijn ze zelf in staat de propagatie van epileptische aanvallen tegen
te gaan. In de situatie van HS echter ontstaan vanuit deze cellen mosvezels die
teruggeprojecteerd worden naar de binnenste moleculaire laag, waarschijnlijk omdat de
neuronen waar ze normaal synaps op nemen verloren gegaan zijn. Er is bewijs dat deze
aberrante ontspruitingen een wederkerend excitatoir circuit vormen door synaps te nemen op
naburige granulaire dentaatcellen. Alhoewel dit een plausibele verklaring is voor
hyperexciteerbaarheid is de causatieve rol van mossy fibersprouting in epileptogenese nog sterk
speculatief. Er is namelijk duidelijk bewijs dat deze vezels ook synaps nemen met de inhibitoire
interneuronen als deel van een feedback mechanisme (5).
1.4 Behandeling
Meer dan 60% van de patiënten met focale aanvallen worden aanvalsvrij door therapie met
anti-epileptische drugs (AED). Het falen van de eerste AED om de aanvallen onder controle te
houden is de krachtigste predictor voor drug-resistentie, met minder dan 10 % van de patiënten
die aanvalsvrij worden bij overschakeling naar een tweede AED. Indien AED’s inefficiënt
blijken kan voor resectieve epilepsiechirurgie geopteerd worden, waarbij temporale lobectomie
voor drugresistente focale epilepsiesyndromen 2/3 van de neurochirurgische procedures
beslaat. Chirurgisch ingrijpen leidt tot een aanvalsvrijheid van 70% (8).
Neurostimulatie is een vorm van therapie die gekozen kan worden indien chirurgie geen optie
is. Ondanks de opkomst van nieuwe AED’s, de grotere beschikbaarheid aan resectieve epilepsie
chirurgie en het heropkomen van het ketogeen dieet, behoudt neurostimulatie zijn unieke rol in
de behandeling van refractaire MTLE. Deze therapie bestaat uit het toedienen van elektrische
pulsen op of in de nabijheid van neuraal weefsel. Een vorm van neurostimulatie is stimulatie
van de nervus vagus (9). De nervus vagusstimulator is geen curatieve behandeling met minder
dan 10% van de behandelden die aanvalsvrij worden. Een gemiddelde reductie in
aanvalsfrequentie van 25% tot 28% op 3 maand evolueert naar 40% bij 1 jaar behandeling.
Andere vormen van neurostimulatie omvatten thalamische diepe hersenstimulatie en de
responsieve neurostimulator. Deze laatste gebruikt subdurale of diepte-elektroden op één of
twee vooraf gedetermineerde epileptische foci. De stimulator wordt geprogrammeerd om een
individu’s abnormale elektrocorticografische activiteit te leren herkennen en hierop te
antwoorden met een gepaste elektrische stimulatie om de aanvalsfrequentie te reduceren (8).
6
1.5 Nervus vagus
1.5.1 De anatomische component van de n. vagus
De nervus vagus is de tiende en langste craniaalzenuw. Door zijn lange weg van de hersenstam
naar het abdomen werd hij vagus genoemd wat zwerver betekent in het Latijn. De nervus vagus
ontstaat vanuit de medulla en verlaat de schedel via het foramen jugulare, waar het een kleine
verdikking vormt, het zogenaamde ganglion jugulare. Net onder het foramen jugulare
expandeert de vagus opnieuw om het ganglion nodosum te vormen. Hierna daalt de vagus af in
de nek gelegen in het kapsel van de a. carotis. Op het niveau van het ganglion nodosum springen
de faryngeale takken af die samen met de faryngeale takken van de nervus glossopharyngeus en
het superior cervicaal sympathisch ganglion de faryngeale plexus vormen. Op hetzelfde niveau
takt de nervus laryngeus superior af van de vagus om de larynx te bezenuwen. Verder zijn er
nog vertakkingen naar de cardiale, pulmonaire, oesophagale en lienale plexi (8).
1.5.2 De functionele component van de n. vagus
De n. vagus bestaat uit 80% afferente sensorische vezels die informatie vanuit hoofd, nek,
thorax en abdomen naar de hersenen voeren, en 20 % efferente. De n. vagus bestaat uit A-, B-,
en C-vezels gebaseerd op hun geleidingssnelheid die, in perifere gemyeliniseerde vezels,
proportioneel is met de grootte. De drie vezeltypes spelen een verschillende fysiologische rol.
De vagale A-vezels zijn de grootste en gemyeliniseerd en dragen afferente viscerale en
motorische informatie. De B- vezels zijn kleine gemyeliniseerde vezels die parasympatische
input dragen. De C-vezels zijn klein, ongemyeliniseerd en dragen afferente viscerale
informatie. De vagale vezels zijn verbonden met 4 nuclei gelegen in de hersenstam (medulla):
de spinale nucleus van de nervus trigeminus, de nucleus tractus solitarius (NST), de nucleus
ambiguus (NA) en de dorsale motore nucleus van de nervus vagus (DMN) (8).
De nervus vagus draagt algemene viscerale afferenten van thoracale en abdominale viscera en
van baroreceptoren en chemoreceptoren vanuit de aortaboog. Deze afferenten spelen een
cruciale rol in de reflexregulatie van respiratoire, digestieve en cardiovasculaire functies. De
cellichamen van de primaire sensorische neuronen zijn gelegen in het ganglion nodosum en
signaleren naar het caudaal gedeelte van de NST (8).
7
1.6 VNS
1.6.1 De achtergrond van VNS
Nervus vagus stimulatie werd voorgesteld in de late 19e eeuw voor de behandeling van
epilepsie door de Amerikaanse neuroloog Corning. Dit was gebaseerd op het idee dat
epileptische aanvallen hun oorsprong vonden in veranderingen van de cerebrale bevloeiing. Zo
werd transcutane stimulatie van de nervus vagus voorgesteld om het hartritme te verlagen en de
cardiale output te verminderen (8).
Pas in 1952 werd door Zanchetti et al. een eerste duidelijke demonstratie gegeven van de rol van
centrale vagale afferenten in de directe modulatie van corticale activiteit. Gebruik makend van
een elegante experimentele aanpak onderzochten ze de effecten van vagale afferente stimulatie
op de EEG-patronen van de kat. Corticale potentiaalverschillen werden gemeten tijdens
afferente vagusstimulatie in gevagotomizeerde “encéphale isolées”, waardoor veranderingen in
systemische bloeddruk werden uitgesloten. Hieruit bleek dat 1. een breed spectrum van
frequenties van stimulatie van de nervus vagus (2-300 Hz) een EEG-desynchronisatie
veroorzaakt, 2. deze hoogfrequente stimulaties in staat waren epileptische activiteit na focale
strychninetoediening te onderdrukken en 3. deze effecten afhankelijk waren van het bereik van
de stimulatiefrequenties. Deze resultaten waren niet terug te vinden indien het proximale einde
van de nervus vagus afgesnoerd werd, wat de secundaire effecten van de bloeddruk uitsloot en
de corticale activiteitsverandering rechtstreeks koppelde aan de vagale afferenten. Hier
demonstreerden Zanchetti et al. voor het eerst dat de corticale effecten van nervus vagus
stimulatie neurogeen zijn en dat de vagale effecten mogelijks de cortex bereikten via
subcorticale associatieve mechanismen. Dit laatste werd bevestigd door Grastyan et al. die
bewezen dat de nervus vagus de cerebrale cortex beïnvloedt via het reticulair activerend
systeem in de hersenstam (8).
Het is geweten dat verschillende patronen van VNS leiden tot verschillende effecten. Zo blijkt
VNS met een frequentie lager dan 70 Hz te leiden tot EEG-desynchronisatie, terwijl een
frequentie hoger dan 70 Hz leidt tot EEG-synchronisatie. Ook ziet men een vertraagd effect in
de cerebrale cortex en thalamische nuclei, terwijl de hippocampale cortex veel sneller reageert
(8).
8
Het klinische potentieel voor VNS bij de behandeling van epilepsie werd voorgesteld door
Zabara et al. Specifiek werd in hondmodellen een anti-epileptisch effect van VNS vastgesteld
op aanvallen geïnduceerd door strychnine en pentyleentetrazol (PTZ). Dit effect werd ook
bekomen in aap- en knaagdiermodellen, waarbij zowel een daling in aantal aanvallen
(frequentie) als een vermindering van de ernst van deze aanvallen bekomen werd na VNS (8).
Initieel werd gedacht dat het effect van VNS te verklaren was door een vrijstelling van
inhibitoire neurotransmitters zoals GABA en glycine in de hersenstam en cerebrale cortex en
dat dit anti-epileptisch potentieel rechtstreeks afhankelijk was van het aantal gestimuleerde
vagale C-vezels. Destructie van de perifere C-vezels in een ratmodel lijkt echter geen invloed
hebben op de VNS-geïnduceerde aanvalsonderdrukking (8).
De eerste beschrijving van de implantatie van een
VNS-apparaat (Figuur 2) in mensen voor de
behandeling van drugresistente epilepsie verscheen in
de literatuur omtrent 1990. Verdere informatie rond de
rol van VNS in de behandeling van epilepsie werd
geleverd door experimentele studies op diermodellen.
Zo vond men in werk op honden dat VNS een
langdurige inhibitie veroorzaakte die vergrootte bij
aangehouden periodes van stimulatie om zo aanvallen
te reduceren. Uit het feit dat VNS zowel door
penicilline geproduceerde focale interictale spikes
beïnvloedt
alsook
secundair
gegeneraliseerde
Figuur 2: Het VNS apparaat bestaande
aanvallen door PTZ blijkt dat VNS een krachtige maar
uit een puls generator verbonden aan
niet specifieke methode is om corticale epileptiforme
helicale elektroden via een bipolaire
activiteit te reduceren (8).
flexibele draad.
Ook heeft VNS een duidelijk anticonvulsief effect op spontane aanvallen in volledig amygdala
gekindlede ratten (een model voor spontane focale limbische aanvallen). Het totaal aan
experimentele data en de verschillende clinical trials leidden tot de goedkeuring van het FDA
(food and drug administration) voor het gebruik van VNS als een adjunctieve behandeling voor
9
volwassen en kinderen vanaf 12 jaar met epileptische aanvallen van focale oorsprong die
refractair zijn aan anti-epileptische medicatie (8).
VNS heeft dus een significante invloed op verschillende soorten epileptische aanvallen van
sterk verschillende anatomische en neurofysiologische oorsprong. Het anticonvulsieve effect is
zichtbaar in species die fylogenetisch gezien sterk verschillen, zoals primaten, ratten, honden,
katten en de mens. Ook is het effect gevalideerd in verschillende bevolkingsgroepen zoals
kinderen, adolescenten, volwassenen, bejaarden en personen met een laag IQ of residenten van
een verzorgingscentrum (10). Het anticonvulsieve mechanisme is dus sterk gepreserveerd, met
een invloed op verschillende hersendelen en neuronale subklassen (8).
1.6.2 Vezeltypes en elektrische stimulatie van de n. vagus
De meest voorkomende vezels in de nervus vagus zijn de C-vezels, die 65% tot 80% van de
zenuw uitmaken. De A-vezels hebben de laagste amplitude-duur drempel die nodig is vooraleer
VNS in staat is een actiepotentiaal uit te lokken (gaande van 0.02 mA tot 0.2 mA). De B-vezels
hebben een hogere excitatiedrempel (0.04 mA tot 0.6 mA) terwijl de hoogste excitatiedrempel
(meer dan 2.0 mA) toebehoort aan de smalle ongemyeliniseerde C-vezels (8). Verdere
karakteristieken zijn weergegeven in tabel 1 (11).
Tabel 1: Karakteristieken van de vezeltypes in de n. vagus.
A-vezels
B-vezels
C-vezels
Diameter
5-20 mm
< 3 mm
0.4-2 mm
Hoofdfunctie
Snelle pijn,
Vasomotorisch,
Vasomotorisch,
temperatuur, tast,
visceromotorisch
visceromotorisch,
spiertonus
trage pijn, temperatur,
tast
Geleidingssnelheid (m/s)
30-90 m/s
Amplitude drempel (mA) 0.02-0.2
10-20 m/s
0.3-6 m/s
0.04-0.6
>2.0
mA = milliampere, m/s = meter per seconde, mm = millimeter.
Voor klinisch gebruik van VNS worden frequenties gaande van 20 Hz tot 30 HZ gebruikt
aangezien frequenties van 50 Hz en hoger ernstige en irreversibele schade aan de n. vagus
kunnen veroorzaken. Verschillende EEG-patronen kunnen uitgelokt worden bij stimulatie van
10
verschillende vezels van de n. vagus. Zo zal rekrutering van de A- en B-vezels door een zwakke
stimulatie een EEG-synchronisatie veroorzaken, terwijl bij een hogere stimulatie ook C-vezels
gerekruteerd worden, leidend tot een EEG-desynchronisatie. Onderdrukking van epileptische
aanvallen resulteert van A- en B-vezelactivatie aangezien therapeutische VNS onder de
drempel voor C-vezel excitatie stimuleert, en C-vezelvernietiging geen effect heeft op de
aanvalsonderdrukking (cfr supra) (8). Deze bevinding is belangrijk aangezien hoge intensiteit
en hoge pulsduur niet noodzakelijk zijn voor een anticonvulsief effect, gegeven dat C-vezels,
die een hogere stimulatie-intensiteit nodig hebben voor activatie, niet centraal staan in het
anticonvulsief mechanisme. Ervaring uit de praktijk suggereert dat als intensiteit stijgt, de
tolerantie daalt. Neveneffecten zoals verandering van de stem, hoesten, nauwheid van de keel,
kortademigheid verergeren ook bij een stijging in de intensiteit (12).
1.6.3 De neurochemische effecten van VNS
In de laatste decennia is VNS de meest gebruikte niet farmacologische behandeling van
refractaire epilepsie. Ook werd VNS reeds voorgesteld om stemmings- en cognitieve
stoornissen te behandelen, zoals majeure depressie en de ziekte van Alzheimer. Een mogelijk
werkingsmechanisme dat aan de basis kan liggen van de effecten van VNS op epileptische
aanvallen en stemming is de verandering van norepinephrine(NE)vrijstelling gemoduleerd door
de projecties van de NST naar de locus coeruleus (LC). De NST is een groot complex van
kernen, gesitueerd in het dorsale tegmentum. Zowel bij de mens als bij dieren gebruikt voor
experimenteel onderzoek, ontvangt de NST input van de tractus solitarius, een sterk
gemyeliniseerde vezelbundel die van het niveau van de nucleus facialis in de caudale pons tot
de spinomedullaire junctie loopt. In de volgroeide hersenen bestaat de tractus solitarius uit
vezels die de speciale en algemene viscerale afferente informatie van de corresponderende
componenten van de zevende, negende en tiende craniaalzenuwen dragen. De NST krijgt ook
informatie vanuit diverse somatische en viscerale sensorische afferente projecties van
verschillende bronnen, zoals het ruggenmerg (tractus spinosolitarius), verschillende
hersenstamstructuren (area postrema, periaqueductal grey, nucleus parabrachialis, nucleus van
Kölliker-Fuse) en cerebrale structuren ( regio’s van de hypothalamus en de centrale nucleus van
de amygdala). De NST projecteert op zijn beurt sensorische informatie naar verschillende delen
van de hersenen, waaronder de amygdala, cerebellum, hypothalamus, thalamus, nucleus
parabrachialis, de raphe nuclei (bron van 5-ht, niet gerefereerd) en de LC (8).
11
De n. vagus projecteert dus sensorische informatie via de NST naar NE en serotonine systemen,
die geassocieerd zijn met de regulatie van stemming, angst, emotie en epileptische
aanvalsactiviteit ( figuur 3).
Figuur 3: Projectie van vagale vezels naar de NTS en de upstream projectieregio's van de NTS. (HC =
hippocampus, LC = locus coeruleus, DRN = dorsale raphe nucleï ).
1.6.4 Vagale-NTS synaps
Informatie over de activiteit van de viscerale organen wordt doorgegeven van de vagale A- en
B-vezels naar de mediale, ventrale en laterale NTS via de vrijstelling van glutamaat (13, 14).
Deze glutamaterge synaps kan gemoduleerd worden door presynaptische metabotrope
glutamaatreceptoren (figuur 4). Zo kan glutamaat binden op presynaptische autoreceptoren,
waardoor verdere glutamaatvrijstelling geïnhibeerd wordt (15). Vrijgesteld glutamaat kan ook
12
binden op de metabotrope glutamaatreceptoren van lokale GABA-erge uiteinden, leidend tot
vrijstelling van GABA (16). Dit leidt tot de modulatie van glutamaatvrijstelling vanuit de
vagale vezels door GABAA-receptor gemedieerde activatie enerzijds en GABAB metabotrope
receptor gemedieerde inhibitie anderzijds. Een in vitro studie toonde aan dat GABAA-receptor
gemedieerde excitatoire effecten op de EPSPC (excitatoire post synaptische stroom) dominant
waren, zelfs bij lage concentraties van GABA, en dus de GABAB-receptor gemedieerde
inhibitoire effecten overstijgen. Ook werd geconcludeerd dat vagale presynaptische GABAA
receptor
activatie
de
presynaptische
depolarisatie
induceert
via
activatie
van
spanningsafhankelijke ionkanalen wat de glutamaatvrijstelling faciliteert. Bij hoge
concentraties van een selectieve GABAA receptor agonist (muscimol) werd geen stijging in
EPSC-frequentie
bekomen
wat
suggereert
dat
een
sterke
depolarisatie
deze
spanningsafhankelijke ionkanalen inactiveert en glutamaatvrijstelling blokkeert (een fenomeen
gekend als terminale depolarisatieblock) (13).
Figuur 4: Schematische voorstelling van de relatie tussen vagale A en B vezels en de lokale GABAerge
neuronen die de glutamaterge signalisatie naar de NTS beï nvloeden. (glutamaat: zwarte bolletjes, GABA:
grijze
bolletjes).
Afferente
vagale
activiteit
activeert
de
NTS.
Presynaptische
metabotrope
glutamaatreceptoren (mGluR) type II en III inhiberen transmittervrijstelling, terwijl mGluR type I de lokale
GABAerge neuronen stimuleert tot vrijstelling. GABAA receptoren stimuleren glutamaatvrijstelling terwijl
GABAB receptoren vrijstelling inhiberen.
Deze complexe heterosynaptische interacties tussen presynaptisch glutamaat en GABA
beïnvloeden het netto effect van excitatie van de NTS-neuronen. Wij hypothetiseren dat
elektrische stimulatie van de cervicale vagale afferente A- en B-vezels zal leiden tot een
13
frequentie-afhankelijke inhibitie van de mediale, ventrale en laterale NTS-neuronen. Bij een
lage afferente stimulatiefrequentie zou de glutamaatvrijstelling niet voldoende zijn om de
presynaptische metabotrope glutamaatreceptoren te activeren, waardoor er geen vermindering
van synaptische transmissie optreedt. Bij hogere afferente stimulatiefrequenties echter wordt
voldoende glutamaat vrijgesteld om deze presynaptische receptoren te activeren wat een
verdere glutamaatvrijstelling inhibeert en zo de synaptische transmissie reduceert. Deze
hypothese wordt gestaafd door in vivo en in vitro studies waarbij vagale afferente stimulatie aan
1 Hz een excitatoire postsynaptische respons uitlokt in de NTS, terwijl vagale afferente
stimulatie aan 20 Hz een synaptische depressie uitlokt (17-19). Aangezien VNS in de kliniek
meestal een frequentie van 30 Hz bedraagt, hypothetiseren we dat VNS met klinische
parameters de mediale, ventrale en laterale NTS inhibeert.
Het is geweten dat veranderingen in GABAerge en glutamaterge transmissie in de NST de
susceptibiliteit voor epileptische aanvallen kan reguleren. Zo zal een stijging in
GABA-transmissie en een daling in glutamaattransmissie in de NST de susceptibiliteit voor
limbische convulsies uitgelokt door systemische en focale bicuculline en systemische PTZ
verlagen bij ratten (8).
De activatie van de LC na VNS impliceert een direct effect op de cerebrale cortex gezien de
wijdverspreide connecties die de LC-axonen vormen. De LC vormt de grootste groep NE
neuronen in het menselijk brein. De LC heeft een cruciale rol voor waakzaamheid, specifiek
voor selectieve aandacht
en flexibiliteit
in
het
gedrag of “scanningsaandacht”.
De LC innerveert bijna alle delen van het centraal zenuwstelsel, en het is de enige noradrenerge
innervatie van de cerebrale en cerebellaire cortices. De projecties afkomstig van de LC maken
geen gebruik van de thalamische nuclei als schakelstation en zorgen hierdoor voor een sneller
effect op de EEG-activiteit. De projecties afkomstig van de LC vertonen diverse diffuse
boutons/verdikkingen wat leidt tot een paracriene invloed op de geïnnerveerde structuren. Dit
ziet men duidelijk in de allocortex van het limbische systeem, waar de aanwezigheid van NE
veel groter is dan deze in vergelijking met isocortex. Dit leidt tot de hypothese dat de regulatie
van de corticale synchronisatie binnen de allocortex meer afhankelijk is van monoaminerge
controle dan van thalamische afferenten. Opvallend is dat de meest duidelijke effecten van VNS
als een anti-epileptische behandeling zijn gerelateerd aan limbische aanvallen. De grootste
input naar de LC is te vinden in de nucleus paragigantocellularis (PGi) en de perifasciculaire
14
area van de nucleus prepositus hypoglossi (PrH), twee structuren gelegen in de rostrale medula.
De vagale afferenten schakelen door van de NST naar de LC via disynaptische pathways; een
via excitatoire aminozuren bevattende vezels van de PGi en een via GABA-erge vezels vanuit
de PrH (8). De LC staat dus onder inhibitoire GABA-erge controle vanuit de PrH in de medulla.
Het inhibitoire effect wordt vooral gemedieerd door het hyperpolariserende effect van GABAA
receptor activatie. Er zijn verschillen in de GABAA receptor subtypes als we mensen
vergelijken met knaagdieren wat de translatie van dierexperimenten bemoeilijkt (20).
Een tweede inhibitoire regulatie van de NTS op de LC vindt men terug in een derde indirecte
disynaptische pathway. Hierbij connecteert de NTS naar een populatie GABA-erge neuronen in
de perifere regio rond de LC (peri-LC) die een regulatoire controle over de LC uitvoeren via
projecties naar de nucleus proper enerzijds en synaptische input naar de extranucleaire
dendrietenboom van de LC anderzijds (21).
Ook is er een directe monosynaptische verbinding van de NST naar de LC (in de rat), meer
specifiek van de caudale NTS naar de rostrolaterale peri-LC. Deze verbinding komt tot stand
door beide types synaptische verbinding, alhoewel excitatoire synapsen meer frequent
geobserveerd worden dan inhibitoire (22).
De NTS heeft gebaseerd op deze bevindingen een netto inhiberend effect op de LC. Volgens
onze hypothese reduceert VNS de activiteit van NTS op een frequentie afhankelijke manier. Zo
zou de NTS meer geinhibeerd worden naarmate de vagale afferente activiteit stijgt. Dit zou
leiden tot een desinhibitie van de LC gevolgd door een stijging in de noradrenerge modulatie
van de hersendelen geïnnerveerd door de LC.
1.6.5 De Rol van de LC in VNS
Het eerste bewijs voor een prominente rol van de LC in het anticonvulsief effect van VNS
dateert van 1998, toen Krahl et al. demonstreerden dat het anticonvulsief effect van VNS
geblokkeerd werd bij laesie van de LC in ratten. De LC blijkt van kritiek belang in het beperken
van de verspreiding en duur van epileptische aanvallen, gezien schade aan de LC spontane
sporadische
epileptische
aanvallen
kan
converteren
naar
status
epilepticus.
Dit
aanvalsmodifiërend effect lijkt gebonden aan de activiteit/effect van de LC neuronen op
corticale exciteerbaarheid via modulatie van de synaptische plasticiteit en geheugen (8).
15
Zo lijkt VNS via LC activatie de plasticiteit van het epileptisch circuit te moduleren, waardoor
verondersteld wordt dat er lang aanhoudende corticale veranderingen optreden door VNS. Dit
wordt ook teruggevonden in de belangrijke rol van de LC in de modulatie van epilepsie
gerelateerde plasticiteits afhankelijke genexpressie. Deze LC afhankelijke synaptische
plasticiteit kan een verklaring zijn voor een aantal van de beschreven effecten na VNS-therapie,
zoals het antidepressieve effect, de cognitieve verbetering en het verbeteren van het geheugen,
alsook het bizarre tijdsschema en temporeel patroon van VNS. Dit wordt nog gestaafd door de
redenering dat indien VNS enkel een stimulatie-afhankelijke EEG-desynchronisatie zou
veroorzaken, de efficaciteit van VNS op corticale activiteit slechts te merken zou zijn tijdens de
stimulatie. Dit is echter niet zo aangezien epileptische patiënten een intermittente stimulatie
onafhankelijk van de mogelijke aanwezigheid van een aanval ontvangen (8).
Het is geweten dat VNS leidt tot een stijging in de vuursnelheid van 5-HT en NE-neuronen.
Deze stijging is ook relatief afhankelijk van de lengte van de behandeling, de vuursnelheid van
5-HT en NE-neuronen stijgt naarmate de VNS-therapie aanhoudt. Zo is de basale vuursnelheid
in zowel de dorsale raphe nucleus (DRN) als de LC significant verhoogd na een langetermijnsbehandeling met VNS, terwijl een korte periode van VNS enkel de vuursnelheid van de LC
significant verhoogde (bij 1u en 3 dagen). De NE-neuronen van dieren 90 dagen behandeld met
VNS vertonen een burstpatroon dubbel zoveel als controleratten. De lengte van de bursts stijgt
met 110% en het gemiddelde aantal spikes per burst stijgt met 80 % (8).
Gezien de LC, maar niet de DRN, rechtstreekse input van de NST ontvangt, werd gepostuleerd
dat VNS initieel en vooral via de LC werkt, en indirect via afferenten van de LC de DRN
activeert. De combinatie van een aanzienlijke stijging in noradrenerge en serotonerge
neurotransmissie en de afwezigheid van een verlies aan sensitiviteit van de 5-HT1A receptoren
is een mogelijk mechanisme voor de antidepressieve werking van VNS (8).
1.6.6 Invloed NE op HC
De exciteerbaarheid van neuronale netwerken wordt gemoduleerd door diffuse subcortical
projecties die neuromodulatoren zoals acetylcholine, dopamine en NE vrijstellen.
Neuromodulatoren bepalen de algemene neuronale activiteitsstatus en kunnen bepaalde
oscillatie frequenties bevorderen of beperken zowel in vivo als in vitro. Verschillende studies
tonen aan dat de normale NE-activiteit kritiek is voor het modificeren van interstructurele
activatie en dient als anticonvulsant bij VNS patiënten. NE moduleert grotendeels de
16
theta-frequenties in vivo, maar de exacte modulatoire mechanismen tijdens VNS zijn
ongeweten. Studies suggereren dat het NE effect op theta-ritmes hoofdzakelijk gemoduleerd
wordt via beta-adrenoreceptoren (AR). Activatie van beta-AR reduceert de propagatiesnelheid
van synchrone bursts tussen CA3 en CA1 regio’s leidend tot een potentiële desynchronisatie
van de distale verbonden circuits en een sterkere lokale activiteit. De beperking van de spatiale
omvang van de spontane synchrone bursts gaat gepaard met een stijgende variabiliteit en
desynchronisatie van zowel enkelvoudige cellen als onderling verbonden regions of interest.
Ook werd aangetoond dat elektrisch geïnduceerde repetitieve sharp wave-ripple (SPW-R)
activiteit in de hippocampus gemoduleerd wordt door NE. Zo zal NE het voorkomen van
SPW-R’s verlagen. Hoog frequentie oscillaties (zoals SPW-R’s) bij zowel mens als dier
worden verondersteld essentiële schakels te zijn in snelle epileptiforme netwerksynchronisatie
(23).
Op moleculaire basis toonden verschillende studies aan dat de acties van beta-adrenoreceptor
(beta-AR) signalisatie gemedieerd wordt door zowel cyclische AMP proteïnekinase A (PKA)afhankelijke als of –onafhankelijke moleculaire signalering. Beide pathways activeren mitogen
geactiveerd proteïne kinase en leiden zo tot verhoogde fosforylatie van het extracellulair signaal
gereguleerd kinase (pERK), een molecule cruciaal voor verschillende vormen van leren en
geheugen. 4-aminopyridine (4-AP), een ictogene stof, zorgt ook via ongekende cellulaire
mechanismen tot een verhoogde ERK-fosforylatie, wat een oorzaak-gevolg relatie tussen
pERK-concentratie en ictogenese impliceert. Er wordt verondersteld dat de regulatie van het
moleculaire ERK via beta-AR-cascades ook de netwerksynchroniciteit en neurale
activiteitspropagatie reguleert. Deze fundamentele intracellulaire signaalcascade staat dus op
het kruispunt van ictogenese, synchroniciteit en synaptische plasticiteit. Zo werd geconcludeerd
dat beta-AR activatie de ruimtelijke en temporele activiteitspatronen in hyperexciteerbare
circuits hervormt door het ontstaan van het ritme in een netwerk (network rhythmogenesis), de
propagatiesnelheid en de intercellulaire en regionale synchronisatie aan te passen (23).
Het effect van NE moet echter genuanceerd worden, gezien NE zowel proconvulsieve als
anti-epileptische effecten uitoefent afhankelijk van de bestudeerde hersenregio en het gebruikte
epilepsiemodel. Ook schrijven verschillende contradictorische studies het anti-epileptische
effect van NE aan alpha1 of alpha2 activatie toe. Zo is er farmacologisch bewijs voor een alpha2
adrenoreceptor gemedieerde inhibitie van hippocampaal CA3 netwerk activiteit. Deze studie
17
toonde ook bifasische concentratiegerelateerde effecten van NE op hippocampale CA3
epileptiforme burst activiteit aan. Zo werd een stijging in het aantal burst ontladingen gevonden
bij lage NE concentraties (<1µM) en een daling van de frequentie bij hogere NE concentraties
(>1µM). Hun resultaten suggereerden dat deze bifasische effecten gemedieerd werden via beta(excitatoire) en alpha- (inhibitoire) AR (24).
1.6.7 Parameters VNS
In tegenstelling tot AED’s is een exacte dosis-respons relatie voor VNS-therapie nog steeds te
bepalen. De drie volgende punten duiden op het bestaan van deze relatie. Als eerste hebben
twee RCT’s reeds bewezen dat “hoge” parameters (30s ON, 5 min OFF, 30 Hz, 0.25 mA tot 3.5
mA) significant efficiënter zijn dan lage parameters (30s ON, 180 min OFF, 1 Hz, 0.25 mA tot
3.5 mA). Ten tweede, indien patiënten die initieel gerandomiseerd waren voor lage
parameterinstellingen overgedragen werden naar de hoge stimulatieparameters, was een
significante stijging in efficaciteit op te merken. Ten derde, indien de arbeidscyclus opgedreven
wordt tot boven 22% of als de OFF tijd gereduceerd wordt tot minder dan 1.1 minuten is ook
een significante efficaciteitsstijging te zien. De hoeveelheid energie toegediend aan de n. vagus
kan gedefinieerd worden als de amplitude*puls breedte per tijdseenheid. De hoeveelheid
energie hangt af van de intensiteit en stijgt met hoge stimulatieparameters en daalt met lage
parameterinstellingen. Hieruit kan men concluderen dat de apparaatinstellingen een duidelijke
invloed hebben op de respons. Gezien de meeste patiënten niet aanvalsvrij worden met
standaard parameters, is een zoektocht naar alternatieve instellingen voor nonresponders van
groot belang (12).
Bij de mens hangt veilige en efficiënte VNS-therapie af van de output-stroom, frequentie,
pulsduur en arbeidscyclus (ON/OFF time). De volgende sectie bespreekt deze componenten. De
output-stroom moet boven het minimale niveau dat voor effectieve stimulatie zorgt blijven, en
onder het niveau dat leidt tot bradycardie, vernauwing van de keel en ademnood. Een veilig
stimulatiebereik gaande van 0.25 tot 3.5 mA werd gebruikt voor alle RCT’s en de FDA keurde
de stimulatie goed voor output-stroom van 3.5 mA of minder. Het is niet geweten of hogere
output-stroom, indien ze getolereerd wordt, de efficaciteit zou verbeteren (12). Recent werd in
een ratstudie aangetoond dat VNS op het laagste stroomniveau (0.25 mA), wat net onder het
niveau voor een stijging in de vuursnelheid van de LC te bekomen (0.3 mA) ligt, niet in staat
18
was een significante verandering in de NE-concentratie in hippocampus of cortex te
veroorzaken (10). Om deze reden wordt 0.5 mA gekozen voor deze studie.
Klinisch gezien kan de pulsduur de tolereerbaarheid beïnvloeden. Zo kan een reductie van de
standaard 500 µs naar 250µs leiden tot een verhoogde tolerantie voor VNS. Dierstudies hebben
getoond dat de efficaciteit onaangetast blijft bij deze verlaging. Humane intra-operatieve data
indiceren dat een pulsduur van minder dan 200 µs leidt tot een stijging van de threshold van
elektrische stroom die nodig is voor n. vagusactivatie. Weinig exacte data zijn beschikbaar voor
pulsduren minder dan 250 µs in de mens. Deze lage pulsduren worden daarom niet aangeraden
tenzij de patiënt de laagste intensiteit niet kan tolereren bij een pulsduur van 250 µs.
Preklinische studies toonden aan dat de optimale stimulusfrequentie tussen 20 Hz en 30 Hz ligt.
De n.vagus geëvokeerde potentialen zijn maximaal bij een lage stimulatiefrequentie van 20 Hz
en verminderen bij frequenties vanaf 200 Hz. Interessant is dat EEG-desynchronisatie (een
merker voor anticonvulsieve werking) versterkt is bij lage frequenties (25 Hz). Men vond dat
het maximale anticonvulsieve effect plaatsvindt bij frequenties tussen 20 Hz en 30 Hz en dat
frequenties groter dan 60 Hz leiden tot een daling in efficaciteit.
De VNS RCT’s toonden aan dat een arbeidscyclus van 30 seconden On en 5 minuten OFF
veilig en efficiënt was, wat leidde tot de goedkeuring van de FDA in 1997. Bij patiënten waarbij
de standaard arbeidscyclus ineffectief is kan een vermindering van de OFF tijd tot 1.1 minuten
of minder of een stijging in arbeidscyclus van meer dan 22% leiden tot een verbeterde respons
(12).
In deze studie zal gebruik gemaakt worden van een bifasische golfpuls, doch studies op de
n.vagus van honden toonden aan dat de stimulatiegolfvorm (monofasisch vs. asymetrische
ladingsgebalanceerde bifasische stimulatie) de drempel voor vagale vezelrecrutering niet
beïnvloedt (25).
De resultaten van prospectieve gerandomiseerde studies tonen aan dat standaardarbeidscycli
van 30 seconden ON/ 5 minuten OFF, 20 tot 30 Hz met intensiteit gaande van 0.25 mA tot 3.5
mA veilig en efficiënt zijn. Neveneffecten zijn vooral een gevolg van intensiteit, en in mindere
19
vorm van pulsduur en arbeidscyclus. De efficaciteit van VNS verbetert na het eerste jaar van
therapie. Dit kan gelegen zijn aan een stijging in intensiteit, een stijging van de arbeidscyclus
(daling van de OFF tijd) of zoals ook gezien bij proefdieren door de cumulatieve blootstelling
(12).
1.6.8 Standaard VNS vs. Microburst VNS
Enhanced of versterkte VEP’s (eVEP’s) refereren in deze context naar de elektrische
potentialen uitgelokt in de voorhersenen door neurostimulatie die hoger zijn dan deze
geproduceerd door conventionele neurostimulatie, meer specifiek de conventionele VNS met
een interpuls frequentie van 20-30 Hz (resulterend in 140-1800 pulsen per burst met een burst
duur van 7-60 s). Het elektrisch signaal voor deze verbeterde therapie (figuur 6) is fundamenteel
verschillend van de elektrische signalen in conventionele VNS (figuur 5).
Figuur 5. ON/OFF Standaard VNS: grafische voorstelling van het elektrische signal voor intermitterende
standard stimulatie (s= seconden, min = minuten, A = amplitude, t = tijd).
Zo wordt het namelijk gekarakteriseerd door een zeer korte ‘uitbarsting’ van een beperkt aantal
elektrische pulsen. Deze korte uitbarstingen van minder dan een seconde noemt men
‘microbursts’. Door het toedienen van een elektrisch signaal bestaande uit een serie van
microbursts aan de n.vagus worden eVEP’s uitgelokt in therapeutisch significante delen van de
hersenen. Deze eVEP’s worden niet geproduceerd door conventionele VNS. De
interburstperiode, zijnde het tijdsinterval waarin een serie van microburst van elkaar gescheiden
wordt, laat een refractoir interval toe waarin de zenuw kan herstellen van de vorige microburst
en opnieuw receptief kan worden voor eVEP stimulatie door een volgende microburst. De
aansluitende pulsen in een microburst zijn van elkaar gescheiden door een tijdsinterval dat het
‘interpulsinterval’ genoemd wordt. Het interpuls interval, samen met het aantal pulsen en de
pulsbreedte bepaalt de microburstduur, zijnde de lengte van een microburst vanaf het begin van
de eerste puls tot het einde van de laatste puls (en dus het begin van een nieuwe
20
interburstperiode). De parameters die geselecteerd kunnen worden om de microburstefficaciteit
te altereren zijn de interburstperiode, de microburstduur, het aantal pulsen per microburst, het
interpulsinterval, de stroomamplitude, de pulsduur, de ON/OFF tijd en ratio (26).
Figuur 6: parameters microburst VNS. (A = Amplitude, t = tijd, s = seconden, min = minuten).
1.6.9 De rationale van microburst VNS
Gezien het exogeen elektrisch signaal bij VNS typisch toegediend wordt via een geïmplanteerd
apparaat dat gevoed wordt door een batterij, kan de toediening van irrelevante stimuli zorgen
voor onnodig batterijverbruik. Verder kan een pulsburst ervoor zorgen dat de stembanden van
de patiënt contraheren waardoor de stem hees kan worden, wat oncomfortabel kan zijn en
spreken moeilijk maakt. Zelden kan de pulsburst nekpijn en cardiale problemen veroorzaken.
Om deze redenen kan het verminderen van aantal pulsen een positief resultaat geven voor het
comfort en/of veiligheid van de patiënt (27).
De centrale vagale afferente pathways ondervinden meerdere synapsen alvorens activiteit in de
voorhersenen te kunnen uitvoeren. Elk van deze synapsen zijn een potentiële site voor facilitatie
en een niet lineaire temporele filter, waarvoor de sequentie van inter-microburstintervals en/of
interpulse-intervals binnen een microburst geoptimaliseerd kan worden. Microbursts worden
geacht de VNS efficaciteit te verhogen door synaptische facilitatie en het ‘tunen’ van de input
stimulustrein om zo de uitgelokte potentiaal in de voorhersenen te maximaliseren (27).
Het gebruik van gepaarde pulsen (twee of meerdere elektrische stimulaties zeer snel na elkaar
toegediend) is een standaard fysiologische techniek om efficiënte centrale responses te
veroorzaken na stimulatie van afferente vezels met een kleine diameter. Een pulse burst met
21
microbursts van pulsen die een gepaste sequentie van interpulsintervallen hebben vergroten zo
het effect van VNS sterk. Bij een selectie van gepaste signaalparameters ( puls wijdte,
frequentie, interpulsinterval, microburstfrequentie, microburstduur, aantal pulsen microbursts)
kan het exogene elektrische signaal dat de nervus vagus bereikt bestaan uit een serie
microbursts die elk een versterkte vagaal uitgelokte potentiaalverandering (eVEP)
teweegbrengen (27). Gepaarde puls-stimulatie van de n.vagus met een frequentie van 300 Hz
lokten reeds multi-unit ontladingen uit in de central vagale projectieregio’s bij mensapen , meer
specifiek in de nucleus parafascicularis en de basale ventromediale nucleus van de thalamus
(28). Ook werd bevonden dat de probabiliteit van het uitlokken van een respons in de thalamus
van apen stijgt met het aantal van hoogfrequente vagale stimulatiepulsen (gaande van
enkelvoudige, gepaarde tot drievoudige stimuli). Hierop gebaseerd kan men verwachten dat
microbursts meer potent zijn de projectieregio’s van VNS te beïnvloeden en mogelijks te leiden
tot een sterker anti-epileptisch effect dan standaard VNS (29).
Een duur van een microburst langer dan 10 ms (wat correspondeert met 4 pulsen met een
interpulsinterval van ongeveer 3 ms) produceert een maximale eVEP in de thalamus van
mensapen en een interpulsinterval van 6 tot 9 ms leidt tot een maximale facilitatie door de eerste
puls van de tweede puls. Zo kan een optimale VEP bekomen worden met een korte microburst
van pulsen met een totale duur van 10 ms tot 20 ms en een initiële interpulsinterval van 6 tot 9
ms gevolgd door intervallen met gelijke of langere duur. Dit komt omdat een patroon van
microburstpulsen het natuurlijk voorkomend patroon van actiepotentialen in vezels met kleine
diameter simuleert. Selectie van een gepast inter-microburstinterval om de ene microburst te
scheiden van de volgende moet experimenteel bepaald worden, maar een periode van minstens
100 ms (beter 500 ms en bij voorkeur 1 s) en op zijn minst evenredig aan de duur van de
microburst is gewenst (27).
1.7 Diermodel
De hoofdkenmerken van mTLE zijn: 1. de lokalisatie van de epileptische foci in het limbische
systeem, en dan vooral in de hippocampus, entorhinale cortex en amygdala. 2. het frequent
voorkomen van een ‘initieel precipiterend trauma’ dat het ontstaan van mTLE voorafgaat. 3.
een aanvalsvrij interval dat dit precipiterend trauma volgt gekend als ‘de latente periode’. 4. een
hoge incidentie van mesiale of Cornu Ammonis (CA) sclerose, zijnde een unilaterale
22
hippocampale laesie leidend tot atrofie, typisch veroorzaakt door neuronaal verlies en gliose in
Sommer’s sector (subiculim-CA1 transitie zone) en het eindfolium (hilus dentatus). De meeste
van deze eigenschappen kunnen gereproduceerd worden in chronische diermodellen van
mTLE, en dan vooral Kindling of post status epilepticusmodellen. Het pilocarpine model
behoort normaal gezien tot de SE-modellen. Het vertoont hierbij een hoog isomorfisme met het
menselijk ziektebeeld en wordt hierdoor in vele laboratoria gebruikt (30).
Enkele belangrijke kenmerken van het pilocarpinemodel zijn: 1. de snellere inductie van SE dan
bij intraperitoneaal kainaat, de andere convulsante drug die vaak gebruikt wordt om mTLE te
modelleren. 2. de aanwezigheid van een latente periode gevolgd door het verschijnen van
spontane wederkerende epileptische aanvallen. 3. wijdverspreide laesies waarvan sommigen
gelokaliseerd in dezelfde hersendelen die aangetast zijn bij mTLE-patiënten, en geassocieerd
met neuronaal netwerkreorganisatie in de hippocampale en parahippocampale regio’s. (zo zijn
mossy fiber sprouting, interneuron verlies en ectopische granulaire dentaat celproliferatie
aanwezig bij zowel mTLE-patiënten als proefdieren behandeld met pilocarpine) . 4. het feit dat
de epileptische aanvallen moeilijk te controleren zijn met AED’s zowel bij patiënten als bij met
pilocarpine behandelde epileptische proefdieren (30).
Het epileptogeen effect van pilocarpine ligt in de mogelijkheid de muscarinereceptor M1 te
activeren, gezien een proefdier met een knockout voor dit receptor subtype geen epileptische
aanvallen ontwikkelt na pilocarpinetoediening. Andere cholinomimetica zoals carbachol en
oxotremorine zijn ook in staat epileptische aanvallen te induceren na systemische of cerebrale
injectie. Een pilocarpine geïnduceerde SE kan ook geblokkeerd worden door systemische
toediening van de muscarine antagonist atropine. Eens de epileptische aanvallen zijn geïnitieerd
blijkt de voortzetting af te hangen van andere mechanismen gezien atropine ineffectief wordt.
Experimenten op hippocampale neuronen in cultuur toonden aan dat pilocarpine, werkend via
de muscarine receptoren, een disbalans tussen excitatoire en inhibitoire neurotransmissie
veroorzaakt. In vivo microdialyse studies toonden aan dat pilocarpine een stijging in
glutamaatconcentratie in de hippocampus volgend op het ontstaan van epileptische aanvallen
induceert. Een substantiële hoeveelheid aan bewijs ondersteunt nu de suggestie dat, volgend op
de initiatie door M1-receptoractivatie, de epileptische aanvallen in stand gehouden worden door
NMDA-receptoractivatie (30).
23
1.7.1 Het focale pilocarpinemodel
Het focale pilocarpinemodel is een acute variant van het chronische intraperitoneale pilocarpine
model. In dit model worden limbische epileptische aanvallen uitgelokt in wakkere, vrij
bewegende dieren door intrahippocampale pilocarpine toediening via een microdialyse probe.
Focaal uitgelokte pilocarpine geïnduceerde epileptische aanvallen bootsten complex partiële
aanvallen nog beter na dan limbische epilepsie geïnduceerd door systemische toediening van
een drug (31). De aanwezigheid van de microdialyse probe op dezelfde locatie van de
aanvalsinductie laat simultane monitoring toe van lokale extracellulaire concentraties van
endogene stoffen zoals glutamaat en GABA, in dieren bij bewustzijn. Studies uitgevoerd in dit
model toonden een stijging in hippocampale extracellulaire aminozuurconcentraties aan tijdens
focaal geïnduceerde pilocarpine aanvallen. Deze neurochemische veranderingen kunnen
gebruikt worden als merker voor een stijging in netwerkactiviteit (32).
1.7.2 Werkingsmechanisme pilocarpine
De mechanismen waardoor pilocarpine epileptische aanvallen induceert zijn nog niet volledig
begrepen, maar duidelijk is dat veranderingen in ionaire conductantie en 2nd messenger
systemen betrokken zijn. Pilocarpine is een agonist van de M1-receptor. M1 induceert
hydrolyse van fosfoïnositiden en de vorming van inositol trifosfaat en diacylglycerol. De M1en M2-receptoren komen voor in de hippocampus, waar M1 meer uitgesproken is in de
CA1-regio en de gyrus dentatus. Een van de elektrofysiologische effecten van activatie van de
muscarinereceptor op K+ geleiding is de blokkering van de persisterende K+ stroom gekend als
Im, waardoor er een trage depolarisatie ontstaat. Een tweede is de blokkering van de calcium
afhankelijke trage K+ stroom die verantwoordelijk is voor de hyperpolarisatie die een
burstontlading volgt. Een derde is de blokkering van een transiënte uitwaarts gerichte K+
stroom die de exciteerbaarheid van de hippocampale neuronen reguleert. Deze drie effecten
tezamen verhogen de exciteerbaarheid en dragen bij tot epileptogenese.
Ook is geweten dat acetylcholine dat de muscarinereceptoren in de hippocampus activeert leidt
tot een langdurige facilitatie van de excitatoire postsynaptische potentialen die afhankelijk zijn
van de verhoogde responsiviteit voor NMDA. Dit effect is niet afhankelijk van veranderingen
in de kaliumgeleding maar wel van de second messenger functie van inositol 1,4,5-trifosfaat.
Dat dit second messengersysteem een belangrijk deel is van het convulsante effect kan men zien
24
aan het krachtige proconvulsieve effect van co-administratie van pilocarpine en lithium, een
inhibitor van inositol fosfatase.
De 2nd messengerfunctie van diacylglycerol is ook betrokken bij het convulsant mechanisme.
Activatie van proteïnekinase-C leidt tot een functionele modificatie door fosforylatie van
verschillende receptoren. In het geval van de NMDA-receptor potentieert proteïnekinase-C
activatie de respons op glutamaat. Activatie van proteïnekinase-C leidt ook tot een stijging van
de glutamaat opname in de gliale cellen. Via dit mechanisme leidt pilocarpinetoediening tot een
daling van de extracellulaire glutamaatconcentratie (33).
Pilocarpine kan zowel ictale als interictale epileptische gebeurtenissen uitlokken waarbij de
EEG patronen gecorreleerd zijn met de gedragsveranderingen. Laag gevolteerde snelle activiteit
is als eerste zichtbaar in de neocortex en amygdala, terwijl een duidelijk patroon met theta-ritme
zichtbaar is in de hippocampus. Als de gedragsmanifestaties ernstiger worden zal het
hippocampaal theta-ritme vervangen worden door hoog gevolteerd snelle EEG-activiteit. Op
latere stages ontwikkelen de dieren elektrografische aanvallen, gekarakteriseerd door hoog
gevolteerde snelle activiteit en prominente hoge voltagespikes die de aanvallen voorafgaan
(figuur 7), waarschijnlijk door de activatie van het muscarinerg systeem. Deze activatie ontstaat
in de hippocampus en propageert naar de amygdala en neocortex (30).
Figuur 7. EEG alteraties door pilocarpine A: basisactiviteit. B: lage voltage activiteit in cortex (ctx) en
25
theta ritme in hippocampus (HC). C: Hoge voltage spikes in HC. D: Hoge voltage spikes in zowel ctx als
HC. E: elektrografische epileptische aanval. S = seconde, µV = microvolt. Figuur aangepast uit (30).
Het is aangetoond dat intrahippocampale pilocarpinetoediening even efficiënt is als de
intraperitoneale toediening. Niet alleen vindt men dezelfde gedrags-, elektrografische en
neuropathologische veranderingen terug, intrahippocampaal pilocarpine blijkt ook nog gepaard
te gaan met een daling in mortaliteit in vergelijking met systemische injectie (34).
1.8 Intracerebrale microdialyse
Microdialyse wordt gebruikt voor in vivo bemonstering van farmaca en metabolieten of
endogene stoffen vanuit lichaamsvloeistof of interstitiëel vocht in specifieke weefsels, alsook
toediening van exogene stoffen. De microdialyse opstelling bestaat uit een pomp, een katheter
of probe, en een recipiënt waarin het monster wordt gecollecteerd. De probe is concentrisch
bestaande uit een dunne dialyse tube met een binnenste diameter van 0.15-0.3 mm en een
semipermeabel membraan aan het uiteinde. Een perfusie vloeistof stroomt binnen langs de inlet
tubing aan een constant debiet, passeert langs het membraan en bereikt via de outlet tubing het
recipiënt. Het perfusaat is een waterachtige oplossing die de samenstelling van de fysiologische
omgeving nabootst. Hierdoor wordt overtollige migratie in of uit de periprobe vloeistof
vanwege osmotische druk vermeden. De diffusierichting is afhankelijk van de
concentratiegradiënt. Zo zal wanneer het perfusaat het membraan passeert, moleculen (tot een
zeker moleculair gewicht) in (recovery) of uit (delivery)het perfusaat diffuseren (35).
1.9 LMEP
Er bestaat een grote variabiliteit tussen patiënten onderling wat betreft de respons op VNS
therapie. Verschillende factoren kunnen leiden tot deze interindividuele variabiliteit (36). Een
grote bijdragende factor kan het verschil in activatie van de n.vagus in respons op VNS zijn. Zo
kan het gebeuren dat VNS niet in staat is de n.vagus te activeren wegens tijdelijke schade aan
de zenuw geïnduceerd door de electrode implantatie. Om hiervoor te corrigeren zal gebruik
gemaakt worden van LMEP’s. De LMEP (laryngeal muscle evoked potential) is het resultaat
van VNS-geïnduceerde co-activatie van Aα-motorische vezels die de laryngeale spieren
bezenuwen en kan gebruikt worden om 1. de hersteltijd van de n.vagus na elektrode-implantatie
te bepalen en 2. een adequate VNS-gerelateerde activatie van de n.vagus te verifiëren (37, 38).
26
1.10 Probleemstelling en doelstelling
Omdat de responder rate van VNS onder andere afhangt van parameteroptimalisatie werd een
studie opgezet om de effecten van microburst VNS, een nieuwe en experimentele modaliteit
van VNS, in het focale pilocarpinemodel te bestuderen. Hierbij zal geëvalueerd worden of
microburst
VNS
in
staat
is
enerzijds
een
stijging
van
de
hippocampale
noradrenalineconcentratie te bekomen en anderzijds te leiden tot een vermindering van de
pilocarpine geïnduceerde epileptische activiteit.
2 Materiaal en methoden
2.1 Proefdieren
20 mannelijke Wistar ratten (Charles River Laboratories, België) met een gewicht van 250-275
g werden gebruikt in het Laboratorium voor Klinische en Experimentele Neurofysiologie,
Neurobiologie en Neuropsychologie (LKEN3) in het universitair ziekenhuis Gent (UZGent).
De dieren werden behandeld volgens de richtlijnen goedgekeurd door het Europees ethisch
comité (Decree 86/609/EEC). Het onderzoeksprotocol werd goedgekeurd door het ‘Animal
Experimental Ethical Commitee’ van het UZGent. Alle dieren werden onder gecontroleerde
omgevingscondities gehouden (Een dag- en nachtcyclus van 12u/12u werd aangehouden bij een
temperatuur van 20-23°C met een luchtvochtigheid van 50-60%). Voedsel en water werden ad
libitum voorzien. Als kooiverrijking werden nestlets en knaagblokken voorzien.
2.2 Chemicaliën en reagentia
Pilocarpine HCl werd aangekocht van Sigma (St. Louis, MO, USA). Alle andere chemicaliën
waren van de kwaliteitsgraad van analytische reagentia of beter en werden verkregen via Merck
(Darmstadt, Germany). Waterige oplossingen werden gemaakt met gezuiverd water (Seralpur
pro 90 CN, Belgolabo, Overijse, België) en gefilterd door een 0.2 µm membraanfilter. De
waterige perfusie oplossing voor de microdialyse experimenten, hierna beschreven als
gemodifiëerde Ringer’s oplossing, bestaat uit 147 mM NaCl, 2.3 mM CaCl2 en 4 mM KCl. Een
antioxidante oplossing bestaande uit 3.3 mM L-cysteine, 0.27 mM Na2EDTA, 12.5 lM
ascorbinezuur en 100 mM watervrij azijnzuur werd gebruikt om het noradrenaline in de
dialysaten te stabiliseren. Pilocarpine HCl (10 mM) werd opgelost in gemodifieerde Ringer’s
27
oplossing en toegediend via de microdialyseprobe.
2.3 Samenstelling elektroden
2.3.1 VNS elektrode
Twee platina rechthoekjes van 1mm op 3mm (Alfa
Aesar, USA, 99.9% metal basis, 0.25 mm dik)
gesoldeerd aan zilverdraad met silicone elastomeer
coating (MED-4210, Nusil Technology, USA)
worden via een polymeriserend adhesief (Part A and
B MED4-4210, Nusil) aan een siliconeblad gehecht
(MED-4750,
Statice
Santé,
France,
NuSil
components). Hierop wordt een tweede siliconeblad
Figuur 8: Cuff-elektrode voor VNS.
bevestigd met een stretchfactor 0.5 en twee rechthoekjes (0.7mm op 2mm) worden via een
hypodermische naald uit de bovenste siliconelaag verwijderd. De uiteindelijke cuff-elektrodes
worden afgesneden op een lengte van 5mm (figuur 8).
2.3.2 Scalp-, cannula/- en aardingselektroden
De cannula/diepte elektrode (figuur 9) die zowel epileptische aanvallen zal registreren als
microdialyse zal uitvoeren bestaat uit een bipolaire elektrode (polyimide coated stainless steel
wires 70 μm, Bilaney, Germany) met 0.5mm afstand tussen de uiteinden, met krimpdraad
bevestigd aan de cannula. De afstand tussen het langste uiteinde van de bipolaire elektrode en
het uiteinde van de cannula is 3.5 mm. Scalp elektrodes voor EEG registratie bestaan uit vijsjes
(1.57mm, Bilaney, Germany) via een metaaldraad (RS) verbonden met een connectiepin en
geïsoleerd met een krimptube.
Figuur 9: Canulla/diepte-elektrode complex.
28
2.4 Operatie
De chirurgische site werd gedesinfecteerd met ethanol. Na
prechirurgische evaluatie waarbij bekeken werd of het dier niet
ziek is werden nek en hoofdregio geschoren. Gedurende de
volledige operatie werd het dier verwarmd via een heatingpad
met rectale probe. Inductie van anesthesie gebeurde met 5%
isofluraan, onderhouden gebeurde met 2% isofluraan. De huid
Figuur 10: VNS elektrode
wordt ventraal in de nekregio ontsmet met isobetadine (10%
rond n. vagus tijdens de
polyvidoniodine), gevolgd door een incisie in de linker
operatie.
anterieure cervicale regio. De linker cervicale n. vagus werd zorgvuldig losgemaakt van de
aortaschede. Hierna werd de cuff-electrode met twee platina contactpunten (elk 3 mm² met 1
mm ruimte tussen beiden) rond de linker cervicale nervus vagus gewikkeld met de anode
caudaal geplaatst (figuur 10).
Na implantatie werd de impedantie gemeten tussen de platina plaatjes en de n. vagus om een
goed contact tussen de platina plaatjes en de nervus vagus te verzekeren. De uiteinden van de
electroden werden subcutaan naar dorsaal
geleid tot achter het linkeroor en treden naar
buiten langs een incisie in de gedesinfecteerde
schedelhuid. De cervicale wonde werd gehecht
met Silkam R 5/0 wire en xylocaine gel en
neobacitracine werden lokaal toegediend. De
dieren werden vervolgens in een stereotactisch
kader
geplaatst
Düsseldorf,
(Bilaney
Germany)
en
Consultants,
geïmplanteerd
(figuur 11) met twee epidurale opname
Figuur 11: posities elektroden weergegeven op
de schedel van een rat.
elektroden in het linker en rechter os frontale, een aardings (referentie) elektrode dicht bij de
sutura lambdoidea en vier ankervijzen bilateraal in het os frontale en os pariëtale. Een bipolaire
diepte
elektrode
werd
gekoppeld
aan
een
microdialyse
begeleidingscannula
(CMA/Microdialysis, Solna, Sweden) en beiden werden stereotactisch geïmplanteerd in de
linker hippocampus (coördinaten relatief ten opzichte van bregma: rostrocaudaal: -5.6 mm;
mediolateraal: -4.6 mm; dorsoventraal: -4.6 mm, zijnde 3 mm boven de uiteindelijke positie
29
van het membraan van de microdialyse probe). De uiteinden van de cuff-elektroden, epidurale
elektroden en hippocampale diepte elektrode werden geassembleerd in een hoofdcapsule dat op
schedel van de rat bevestigd werd met acryl cement. Om postoperatieve pijn te reduceren
werden een intradermale injectie van xylocaine 2% (0.1-0.2 ml) en een subcutane injectie van
0.05-0.1 mg/kg buprenorphine (Temgesic) toegediend en 2% xylocaïne gel werd rechtstreeks
op de incisiewondes aangebracht. De NSAID metacam (1mg/kg) werd dagelijks subcutaan
geïnjecteerd tot 3 dagen na de operatie. Postoperatief herstel werd bevorderd door het plaatsen
van de dieren onder een infraroodlamp. Correcte positionering van de microdialyseprobe in de
linker hippocampus en de cuff-elektrode rond de linker cervicale n.vagus werd post-mortem
geverifieerd.
2.5 Registratie van de laryngeale motor-evoked potentialen (LMEP)
Een week na de operatie werden de dieren geanestheseerd met isofluraan (inductie: 5%,
onderhouden: 1-2%) en werden VNS geïnduceerde LMEP’s gemeten. De ratten werden
geconnecteerd aan een externe stroomstimulator (CP, model 103, Cyberonics Inc., Houston, TX,
USA) en de n.vagus werd gestimuleerd met bifasiche ladingsgebalanceerde, vierkante pulsen
met de volgende microburststimulatieparameters: pulsbreedte = 250 µs, frequentie = 250 Hz,
intensiteit = 0.5 mA, arbeidscyclus = 60s ON/5min OFF, interburst interval = 0.5s, aantal
pulsen = 4 pulsen/burst. De LMEP registratie werd bekomen door gebruik van een haak
elektrode subcutaan geplaatst op het niveau van de laryngeale spieren. De LMEP-opnames
werden 500 maal versterkt en gefilterd met een band-pass filter van 3 Hz- 3 kHz. De data
werden gedigitaliseerd aan 100 kHz via een National Instruments Acquisition board (NI USB
6259) en opgeslagen op een desktopcomputer. Matlab (2007b, The Math-Works, Natick,
Massachusetts) werd gebruikt voor het opnemen van de LMEP signalen. De LMEPs werden
wekelijks gemeten tot een stabiel signaal verkregen werd.
2.6 EEG monitoring, VNS en intracerebrale microdialyse
Eens er stabiele LMEP-signalen werden gemeten, werden de dieren in neuromonitoring kooien
geplaatst. De hardware bestaat uit een PCB-bord (PCB, vooraf gesensitiseerd bord, enkelzijdig,
100x160mm, dikte 0.8mm, koper 35mm, RS onderdelen, 159-5773) waarop het elektrisch
circuit (getekend met CADSoft Eagle) geëtst wordt. Deze werd gesoldeerd op een
voorversterker (compenseert voor het verschil in impedantie tussen diepte en oppervlakte
elektroden.) De voorversterker connecteert via een wartelkabel (Plastics One, Roanoke, USA.)
30
naar een flatkabel (Plastics One, Roanoke, USA.) en vervolgens met een versterker die het
signaal 510X versterkt. Deze werd verbonden met een 9Vdc stroomvoorziening (NCP, model
103, Cyberonics Inc., Houston, TX, USA) en een NI-DAQ6259 data acquisition card (National
Instruments, Austin, TX, U.S.A). Aanzetten van de VNS gebeurt via dezelfde software voor
EEG-recording (Matlab applicatie 'Neuron'). De microdialyse cannula obturator werd
vervangen door een microdialyseprobe (CMA12, 3 mm membraan lengte, theoretische cut-off
20 kDa, CMA/Microdialysis, Solna, Sweden) die continu geperfuseerd werd met gemodifieerde
Ringer’s oplossing aan een debiet van 2 µl/min. Een 15u-20u interval tussen probe-implantatie
en start van het experiment werd gerespecteerd om de integriteit van de bloed-hersenbarrière,
de afwezigheid van reactieve gliose in het weefsel dat de microdialyseprobe omgeeft, en een
stabiel basale neurotransmitterconcentratie in het dialysaat te verzekeren. Die dieren konden
vrij bewegen in de kooien. Alle dieren werden onder gecontroleerde omgevingscondities
gehouden (cfr. Supra).
2.7 Protocol van het experiment
Tijdens elk experiment werd de microdialyseprobe continue geperfuseerd aan een debiet van 2
µl/min en hippocampale dialysaat stalen (40 µl) werden elke 20 min. gecollecteerd. De effecten
van microburst-VNS op pilocarpine-geïnduceerde limbische convulsies en hippocampale
noradrenaline niveaus werden bestudeerd. Het experimenteel protocol is weergegeven in figuur
12 en hieronder beschreven.
Placebo groep (n=4): de microdialyseprobe werd geperfuseerd met gemodifiëerde Ringer’s
oplossing (R) tijdens de eerste 15 collectieperiodes. Tijdens collectieperiode 16 en 17 werd 10
mM pilocarpine (P) toegevoegd aan de perfusievloeistof. Vervolgens werd opnieuw
geperfuseerd met gemodifiëerde Ringer’s oplossing en werden stalen afgenomen voor de vijf
volgende collectie periodes (collectie periode 18-22).
VNS groep (n=8): hetzelfde protocol als de placebogroep, behalve dat microburst-VNS
uitgevoerd werd vanaf collectieperiode 10 tot het einde van het experiment (zijnde collectie
periode 22). Microburst-VNS werd toegediend met de volgende stimulatieparameters: puls
breedte = 250 µs, intensiteit = 0.5 mA, arbeidscyclus = 60 s On/ 5 min OFF, interburstinterval
= 0.5 s, aantal pulsen = 4 pulsen per burst, burstfrequentie = 250 Hz.
31
Figuur 12| Schematische voorstelling van het experimentele protocol. Elk vierkantje stelt 20 minuten perfusie van
de microdialyseprobe met gemodifiëerde Ringer’s oplossing (R) voor of 10 mM pilocarpine (P) opgelost in
gemodifiëerde Ringer’s oplossing. Microburst-VNS werd gestart vanaf collectieperiode 10 tot het einde van het
experiment.
De tijd tussen de start van de pilocarpineperfusie en het moment waarop de pilocarpine de
linker hippocampus bereikt bedroeg 6.6 min. Voor de start van de microdialyse experimenten
werd de impedantie tussen de twee n. vaguselektrodecontactpunten gemeten.
2.8 Aanvalsernst en EEG analyse
De ernst van de epileptische aanvallen werd geëvalueerd aan de hand van de aangepaste Racine
schaal. Deze is geadapteerd om gedragsveranderingen gezien in focale limbische epileptische
aanvalsmodellen te includeren. De verschillende epileptische ernst scores (EES) worden
weergegeven in tabel 2.
Tabel 2: Aangepaste Racine schaal voor epileptisch gedrag. EES = epileptische ernst score.
EES Gedrag
0
Normale niet epileptische activiteit.
1
Orofaciale bewegingen, hyperactiviteit, wasgedrag, snuffelen, krabben, “wet dog” shakes.
2
Knikken van hoofd, staren, tremor.
3
Voorpoot clonus, voorpoot uitstrekken.
4
Rechtopstaan, salivatie, tonisch-clonische activiteit.
5
Omvallen, status epilepticus.
32
Voor elk van de zeven collectieperiodes na de start van pilocarpineperfusie (zijnde
collectieperiodes 16 tot 22) werd de hoogste epileptische ernst score (EES) behouden. De totale
epileptische ernst score (TEES) werd berekend als de som van de zeven behouden EESen en
gebruikt als een maatstaf voor de ernst van de aanvallen tijdens het experiment. Hippocampaal
en corticaal EEG werden bestudeerd om de latentie tot het voorkomen van de eerste
epileptiforme activiteit (spikes) en de totale duur van de epileptiforme activiteit vanaf de start
van de pilocarpineperfusie te bepalen (zijnde collectieperiodes 16 tot 22). Bij sommige dieren
ging de epileptische activiteit over in een status epilepticus en werden nog epileptiforme
ontladingen geobserveerd op het einde van collectieperiode 22. In dat geval werd EEG-opname
verdergezet tot de volgende dag. Indien dit gebeurde in de VNS-groep werd ook de
microburststimulatie verdergezet.
2.9 Microdialysaat-analyse
De dialysaat stalen (40µl) werden geanalyseerd voor noradrenaline. Om de noradrenaline te
stabiliseren werd 10 µl antioxidante oplossing toegevoegd (cfr. supra). Er werd een off-line
microbore vloeistofchromatografie assay (C8, 5µm, 100 X 1 mm) uitgevoerd gebaseerd op
ion-gepaarde omgekeerde fase chromatografie, gekoppeld aan een enkelvoudig-kanaal
elektrochemische detectie met een laag oxidatiepotentiaal (+450 mV vs. Ag/AgCl) (Decade,
Antec, Leiden, Nederland).
2.10 Histologie
De ratten werden opgeofferd m.b.v. een overdosis Nembutal (3 ml/kg, i.p.). Na een
antistollingsbehandeling met heparine (0.1 ml intracardiaal) werden de ratten transcardiaal
geperfuseerd met 4% paraformaldehyde(PFA) in fosfaatbuffer (0.1M NaHPO4, pH 7.4). De
hersenen werden verwijderd en overnacht gefixeerd in PFA. Cryoprotectie werd bekomen door
de hersenen opeenvolgend op 10%, 20% en tenslotte 30% glucose te leggen. Invriezen gebeurde
d.m.v. de hersenen even in met vloeibaar stikstof gekoeld isopentaan onder te dompelen en
vervolgens te bewaren op -80°C. 24u voor de cryosecties werden de hersenen verplaatst naar
-20°C bewaring. Cryosecties werden genomen op -18°C met een dikte van 80 µm.
33
2.11 Data-analyse
Alle statistische analyses werden uitgevoerd met SPSS 22 voor Windows. De data worden
uitgedrukt als gemiddelde ± standaarddeviatie van het gemiddelde. Als significantie niveau
werd α=0.05 gebruikt. Het effect van microburst-VNS op pilocarpine geïnduceerde limbische
epileptische activiteit werd bepaald door de TEES te vergelijken (Mann-Whitney U test) en de
latentie tot en duur van de epileptiforme ontladingen op het hippocampaal EEG (Student’s
T-test voor vergelijking van onafhankelijke variabelen) tussen de Placebo en microburst VNS
groep. VNS-geïnduceerde veranderingen in de hippocampale noradrenalineconcentratie
werden geëvalueerd door de gemiddelde noradrenalineconcentratie tijdens de baseline
collectieperiodes 4 tot 9 te vergelijken met de gemiddelde noradrenalineconcentraties tijdens de
VNS-collectie periodes 10 tot 15 in de microburstgroep via een Student’s T-test voor
paarsgewijze vergelijking. Een Pearson correlatietest werd uitgevoerd om de correlatie tussen
de VNS-geïnduceerde stijgingen in hippocampale noradrenalineconcentraite en de epileptische
aanvalsparameters (ernst, latentie, duur) te analyseren.
3 Resultaten
3.1 Meten van de laryngeal muscle evoked potential (LMEP)
Microburst-VNS lokte reproduceerbare laryngeale spiercontracties uit, elektrofysiologisch
waarneembaar als een opwaartse piek 2 ms tot 3 ms na de start van elke stimulatiepuls, bij 13
van de 20 dieren. Deze piek werd reeds eerder geïdentificeerd als de LMEP (Figuur 13 A, B).
Een stabiele LMEP kon gemeten worden één week na de operatie bij 7/13 dieren. Bij de overige
dieren was een herstelperiode van 2 weken (5/13 dieren) of 3 weken (1/13 dieren) nodig na de
operatie. Enkel de dieren met een stabiele LMEP werden meegenomen in het microdialyse
experiment. Een dier met een stabiele LMEP werd geëxcludeerd wegens teveel storing op het
hippocampaal en scalp EEG.
34
Figuur 13 A; 4 microbursts met LMEP's. B; 1 microburst met 4 pulsen, 1 LMEP zichtbaar na elke puls.
3.2 Effect van microburst-VNS op limbische epileptische aanvallen en
hippocampale noradrenaline concentratie
Het bereik van impedantie tussen de twee n. vaguselektrodecontactpunten viel binnen de
normale waarden (minder dan 10kΩ) bij alle dieren (1-7 kΩ). Bij de placebo groep lokte een 40
minuten durende intrahippocampale perfusie van 10 mM pilocarpine opgelost in gemodifieerde
Ringer’s oplossing epileptische activiteit uit die toeneemt in ernst (tabel 3). Bij twee dieren in
de placebo groep (50%) evolueerden de aanvallen naar een status epilepticus, terwijl in de
microburst VNS groep drie dieren (37.5%) een status epilepticus ondergingen. Bij zowel de
placebo- als de VNS behandelde groep waren continue epileptische spikes en intermitterende
ritmische epileptiforme ontladingen zichtbaar op het hippocampaal EEG, dat occasioneel
generaliseerde naar de cortex. Geen van de placebo- of VNS-behandelde dieren zijn gestorven.
35
Tabel 3 Resultaten EES (collectieperiode 16-22), TEES, latentie en duur epileptische activiteit.
PLACEBO
(n=4)
1
2
3
4
EES
TEES
P16 P17 R18 R19 R20 R21 R22
0
2
2
4
4
4
5
2
2
5
2
4
2
1
1
2
4
4
4
5
5
0
2
4
2
2
1
1
mVNS
EES
(n=8)
P16 P17 R18 R19 R20 R21 R22
1
2
2
2
4
4
2
1
2
2
2
2
1
1
1
2
4
4
4
5
5
1
2
2
1
1
1
0
1
2
2
2
4
1
1
1
2
4
4
4
4
5
1
2
4
4
5
5
5
1
2
2
2
1
1
0
1
2
3
4
5
6
7
8
Latentie (min)
21
18
25
12
TEES
Duur (min)
10
11
7
23
Latentie (min)
17
11
25
8
13
24
26
9
1069
190
1103
91
Duur (min)
11
11
8
9
10
9
8
9
149
190
1102
99
136
1074
1075
97
Tabel 4. Invloed microburst VNS op hippocampaal NE. nM = nanomolair.
mVNS
NE Basisconcentratie (nM)
NE na VNS (nM)
NE stijging (%)
(n=8)
1
2
3
4
5
6
7
8
0,325
0,338
0,304
0,350
0,365
0,272
0,443
0,233
0,284
0,408
0,326
0,356
0,319
0,317
0,419
0,270
-13
21
7
2
-13
17
-5
16
Tabel 5. Samenvatting resultaten.
behandeling
Aanvalsernst
Aanvalslatentie
Aanvalsduur
Noradrenaline
(TEES)
(min)
(min)
stijging (%)
placebo
19 ± 3
13 ± 4
613 ± 274
n.v.t.
mVNS
17 ± 3
9±1
490 ± 174
4±9
De resultaten van de microdialyse voor en na microburst VNS worden weergegeven in tabel 4.
De limbische epileptische activiteitskarakteristieken en het percentage VNS-geïnduceerde
noradrenaline stijging zijn weergegeven in tabel 5. De aanvalsernst in de VNS-behandelde
36
groep (TSSS = 17 ± 3) was niet significant verschillend van de placebobehandelde groep (TSSS
= 19 ± 3) (p > 0.05) (figuur 14). De latentie tussen de start van pilocarpineperfusie en het
voorkomen van de eerste epileptiforme activiteit op het hippocampaal EEG was gelijkaardig in
de VNS-behandelde groep (9 ± 1 min) en de placebogroep (13 ± 4 min) (p > 0.05). Ook de totale
aanvalsduur verschilde niet significant tussen de VNS behandelde (490 ±174 min) en de
placebogroep (613 ± 274 min) (p>0.05). In de microburst VNS groep was de gemiddelde
noradrenaline basisconcentratie voor de stimulatie (0.329 ± 0.045 nM) niet significant groter
dan de gemiddelde noradrenalineconcentratie tijdens en na de microburst VNS behandeling (
0.338 ± 0.019 nM) (4 ± 9 % VNS geïnduceerde stijging in noradrenaline concentratie) (p >
0.05).
Er
werd
geen
correlatie
gevonden
tussen
de
VNS-geïnduceerde
noradrenalineverandering in de dialysaten (data per rat: zie bijlage II) en de parameters van de
limbische epileptische aanvalsactiviteit (figuur 15).
Figuur 14. Van linksboven naar rechtsonder: grafische weergave van de alteratie van de
noradrenalineconcentratie (nM) na microburst VNS en de vergelijking van aanvalsernst (TEES),
aanvalsduur (min) en latentie (min) tussen placebo en microburst VNS.
37
Figuur 15: Verhouding tussen noradrenalinestijging(%) enerzijds, en aanvalsernst (TEES), latentie (min)
of duur (min) anderzijds.
3.3 Post mortem verificatie microdialyse probe
Bij alle dieren werden de elektroden op de correcte hippocampale positie teruggevonden.
Voorbeeld zie figuur 16.
Figuur 16: A. Hersencoupes met elektrodenlaesie in de linker hippocampus. B. microscopisch vergroot
beeld van omkaderde regio in A.
38
4 Discussie
Deze studie vond geen correlatie tussen microburst-VNS en een vermindering in de
epileptische activiteit. Ook is er geen correlatie tussen de microburst-VNS en de
noradrenalineconcentratie in de hippocampus te vinden in het focale pilocarpinemodel.
Recent zijn anti-epileptische effecten van VNS (30 Hz, 1 mA, 250 µs, 7s ON/ 18s OFF) en een
significante VNS-geïnduceerde stijging (69%) van de extracellulaire hippocampale
noradrenalineconcentratie gevonden in het focale pilocarpinemodel (36). Dit in contrast tot
onze studie waarbij microburst-VNS (250 Hz, 0.5 mA, 250 µs, 60s ON/ 5min OFF, 4 pulsen/
burst, 0.5s interburst interval) de ontwikkeling van pilocarpine-geïnduceerde limbische
aanvallen niet kon tegenhouden noch een significante stijging in extracellulaire
noradrenalineconcentratie kon veroorzaken. Een mogelijke verklaring voor de discrepantie
tussen deze twee studies kan gevonden worden in het feit dat Raedt et al. een intensiever
stimulatieprotocol hanteerden, resulterend in een toediening van 30 240 pulsen aan de n. vagus
per uur in vergelijking met 4 651 pulsen in onze studie. In onze studie werd gekozen voor een
klinisch relevante arbeidscyclus (60 s ON/ 5min OFF) tegenover het rapid cycling paradigma
gebruikt door Raedt et al. (7s ON/ 18s OFF) aangezien het rapid cycling paradigma enkel
gebruikt wordt als laatste optie bij patiënten waarbij de klinisch relevante arbeidscyclus geen
adequate aanvalsreductie veroorzaakte. Ook werd bij onze studie een lagere intensiteit gebruikt
(0.5 mA i.p.v. 1 mA), dit werd echter reeds bewezen als voldoende voor een optimale activatie
voor de n.vagus en het centrale anti-epileptische mechanisme van VNS (39).
Echter ook Roosevelt et al. (10) vonden dat een behandeling van één uur VNS met standaard
parameters (20 Hz, 0.5 mA, 500 µs, 30s ON/10 min OFF) voldoende was voor een significante
stijging (23%) van de extracellulaire hippocampale noradrenalineconcentratie te bekomen. In
het stimulatieprotocol van Roosevelt et al. werd een totaal van 3 600 pulsen toegediend aan de
n. vagus, wat lager is dan de 4 651 pulsen per uur in onze studie. Hierop gebaseerd lijkt het
gebruikte microburst-VNS paradigma minder efficiënt te zijn in het bekomen van een stijging
van de extracellulaire hippocampale noradrenalineconcentraties in vergelijking met
standaard-VNS.
39
Slechts één studie evalueerde reeds het anti-epileptische potentieel van microburst-VNS in het
kindling model (40). In dit model wordt de amygdala elektrisch gestimuleerd om zo
epileptische aanvallen uit te lokken. Een therapie die de drempel voor het uitlokken van deze
aanvallen verhoogt heeft anti-epileptische eigenschappen. In de studie van Alexander et al.
verhinderde continue microburst-VNS voor 1 uur of 1 week (100 Hz, 0.5 mA, 250 µs, 4 pulsen
per burst met een interburstinterval van 3s) de daling van de amygdala kindling drempel zoals
gezien in de placebostimulatie. Dit positieve effect staat in contrast met onze studie ondanks
een gelijkaardig aantal pulsen toegediend aan de n. vagus (4 736 pulsen/uur t.o.v. 4651
pulsen/uur). Dit kan gelegen zijn aan het feit dat Alexander et al. een continu stimulatieprotocol
gebruikten terwijl in ons model de aanvallen ook voorkwamen in de OFF-periode van de VNS.
Zo reduceerde standaard VNS ook de interictale spike frequentie met 33% in een
penicilline/PTZ model, een effect dat het grootste was in een continu stimulatieprotocol en
verminderde op een tijdsafhankelijke manier na de stimulatie (41). Ook gebruikten Alexander
et al. geanestheseerde ratten, wat een grote invloed heeft op de LC. Enerzijds worden
verschillende fysiologische functies die toegeschreven zijn aan de LC onderdrukt tijdens
anesthesie, zoals de stress respons, nociceptie, geheugen en aandacht. Dierexperimenten tonen
aan dat anesthetica die de GABAA-receptoren activeren de noradrenerge neuronen inhiberen
(42). Anderzijds werd recentelijk aangetoond dat noradrenaline een belangrijke rol speelt in
anesthesie mechanismen en dat deze kritiek gereguleerd wordt door de LC (43). Gebruik
makend van een genetische techniek (DREADD) om selectieve LC-neuronactivatie te bekomen
vond Vazey et al. dat LC-activatie voldoende was om de EEG-parameters specifiek voor
anesthesie te veranderen en het herstel van waken te versnellen. Ook inductie van anesthesie
wordt significant vertraagd door LC-NE activatie. Deze wisselwerking tussen anesthesie en LC
activatie impliceert dat de relevantie van de bevindingen afkomstig van geanestheseerde ratten
van Alexander et al. ten opzichte van wakkere vrij bewegende ratten twijfelachtig is.
Een tweede, zeer recente studie (29) onderzocht het effect van acute microburst VNS (300 Hz,
variabele mA ( hoogste stroom die geen hoest uitlokte), 500 µs, 3 pulsen per burst met een
interburstinterval van 0.4s, 7s ON/18s OFF) en standaard VNS op de regionale cerebrale
bevloeiing bij gezonde honden. Hierbij werd een hypoperfusie gevonden in de linker frontale en
rechter partiëtale cortex (die niet teruggevonden werd bij de standaard VNS), echter geen van
beide stimulaties kon een significante alteratie van de thalamische en hippocampale perfusie
aantonen, hoewel deze de meest voorkomende regio’s zijn waarbij alteratie gevonden wordt
40
door VNS in SPECT en PET studies. De gevonden betrokkenheid van de corticale regio’s werd
ook reeds gedetecteerd in verschillende humane studies die het effect van acute VNS op de
regionale cerebrale bevloeiing van patiënten met epilepsie of depressie bestudeerden. Of deze
bevloeiingsalteraties gerelateerd zijn aan het anti-epileptische werkingsmechanisme van VNS
kon met deze studie niet bevestigd worden, maar het lijkt plausibel dat onderdrukking van de
regionale cerebrale bevloeiing, en indirect de neuronale activiteit in bepaalde corticale regio’s,
een aanvalsonderdrukkend effect kan hebben.
De meest plausibele verklaring voor het gebrek aan anti-epileptische of noradrenerge effecten
in onze studie kan gevonden worden op het niveau van de n.vagus-NTS synaps. De synaps
tussen de vagale afferente vezels en de NTS-neuronen vertonen een grote mate aan plasticiteit
op diverse stimuli (44). Een frequentie-afhankelijke depressie van de n.vagus-NTS synaps werd
reeds beschreven in zowel in vitro als in vivo experimenten waarbij vagale afferente stimulatie
met een frequentie van 1 Hz een excitatoire post-synaptische respons uitlokte in de NTS, terwijl
vagale afferente stimulatie met een frequentie van 20 Hz een synaptische depressie uitlokte
(13-16, 45-47). Zo zal een stijging in de frequentie van n.vagus afferente stimulatie leiden tot
een reductie van de NTS-output en zo een desinhibitie en dus versterking van de
LC-noradrenerge activiteit. Dit is een mogelijke verklaring waarom Roosevelt et al. en Raedt et
al. een significante VNS-geïnduceerde hippocampale noradrenalineconcentratie stijging
waarnamen en Alexander et al. een VNS-geïnduceerd aanvalsaborterend effect zagen in het
amygdala kindling model (10, 36). Echter, al zij het veel minder beschreven, ook facilitatie van
de n.vagus-NTS synaps kan voorkomen. Zo toonde Mifflin et al.(48) aan dat in geanestheseerde
ratten twee minuten stimulatie van de n.vagus aan een frequentie van 100-300 Hz leidt tot een
verhoging van de NTS output. Het is dus mogelijk dat ons hoogfrequente (250 Hz)
microburstprotocol geen depressie van de n.vagus-NTS synaps uitlokte maar eerder een
facilitatie. Verder onderzoek is nodig om de invloed van de VNS-parameters op de complexe
plasticiteit van de n.vagus-NTS synaps te begrijpen. Duidelijk is echter dat enkel het aantal
pulsen toegediend aan de n.vagus niet altijd alle geobserveerde effecten kan verklaren.
Gezien de complexiteit van het n.vagus-NTS-LC-HC circuit het moeilijk maakt een directe link
te vinden tussen de microburst stimulatie en de hippocampale NE-stijging, zou men kunnen
opteren dit circuit op te splitsen. Standaard VNS induceert reeds na 1 uur stimulatie een
significante stijging van de vuurfrequentie van de neuronen in de LC (49). Men kan dus in vivo
41
diverse parameterinstellingen (zoals een frequentie in het bereik 100-250 Hz) van microburst
VNS testen via een vergelijking van de basale vuursnelheid van LC neuronen en de
vuursnelheid na stimulatie. Gezien de VNS stimulatie kan leiden tot een interferentie met de
elektrode in de LC voor het meten van de vuursnelheid, is het niet mogelijk een simultane VNS
stimulatie en LC registratie uit te voeren, echter de stijging in LC vuursnelheid blijft tijdelijk
behouden ondanks de afwezigheid van stimulatie. Via deze methode kan men eerst het effect
van een optimalisatie van de microburst parameters op de LC vuursnelheid bepalen in gezonde
dieren, vervolgens kan men deze parameters bestuderen en verifiëren in experimenten op acute
of chronische epileptische modellen.
Een mogelijke optie om de efficaciteit van microburst-VNS te verbeteren zou het randomiseren
van de interburstintervallen kunnen zijn. Zo werd recentelijk aangetoond dat periodische
stimulatie van de amygdala de pentyleentetrazoldrempel voor voorpootclonus verlaagt, terwijl
gerandomiseerde
interpulsintervalstimulatie
de
drempel
voor
voorpootclonus
en
gegeneraliseerde tonisch-clonische convulsies verhoogt. Hierbij werd gehypothetiseerd dat
periodische stimulatie de voorpootclonus faciliteert door te resoneren met de epileptogene
circuits in het limbische systeem, terwijl de gerandomiseerde intervalstimulatie de
voorpootcloni en gegeneraliseerde tonisch-clonische aanvallen reduceert door de epileptische
neurale
netwerken
in
het
voorhersenen-middenhersenen-achterhersenencircuit
te
desynchroniseren (50). Hoewel men in deze studie een rechtstreekse interferentie op het
epileptische netwerk onderzocht, is het plausibel deze lijn door te trekken naar microburst VNS.
Een meer gerandomiseerde stimulatie van de LC kan leiden tot een gerandomiseerde invloed op
de HC, wat resonantie met het epileptische netwerk zou tegengaan.
Dat een optimalisatie van de efficaciteit complex is vindt men ook terug in het feit dat
astrocytaire regulatie van de vagale nuclei de efficaciteit van VNS beïnvloeden. Zo werd recent
astrocytaire activatie aangetoond in de NST indien afferente stimulatie van de n.vagus werd
toegepast. Deze stimulatie resulteerde in een stijging van intracellulaire calciumconcentraties
bij zowel astrocyten als neuronen in hersenstam slices. Het effect op de astrocyten bleef
behouden na NMDA- en metabotrope glutamaatreceptor antagonisme, maar werd geblokeerd
door AMPA-receptor antagonisme. De astrocytaire activatie was dus afkomstig van
extracellularie calcium influx doorheen AMPA-receptoren. Hieruit werd geconcludeerd dat de
NST-astrocyten actief deelnemen aan de regulatie van de vagale activiteit. Dit ondersteunt ook
42
eerder werk dat concludeerde dat neuronen in de NST gereguleerd worden via astrocytaire
glutamaterge signalering onder pathologische en potentieel fysiologische condities (41). Uit
onderzoek op astrocyten in de CA1 regio van hippocampale slices blijkt dat de efficiëntie en
snelheid waarmee de astrocytaire transporters glutamaat verwijderen uit de extrasynaptische
ruimte niet aangetast wordt door hoogfrequente stimulatie van 100 Hz (51). Of dit mechanisme
echter stand houdt bij een stimulatiefrequentie van 250 Hz in de vagale-NTS synaps is niet
geweten.
Zoals hoger beschreven is er een grote inter-patiënt variabiliteit, met als één van de mogelijke
oorzaken het verschil in activatie van de n.vagus als respons op VNS. Om deze mogelijke
oorzaak van variabiliteit uit te sluiten werden de microdialyse-experimenten enkel uitgevoerd
indien een stabiele LMEP (d.i. waarbij de amplitude van de elektrofysiologische respons niet
significant verschilde in twee opeenvolgende dagelijkse metingen) gemeten kon worden, en
werden elektrodebreuken en stimulator defecten uitgesloten door het meten van impedantie.
Ook werd een correcte positionering van de cuff-elektrode rond de n.vagus post-mortem
geverifieerd. Zoals verwacht was in een deel van de dieren pas een VNS-geïnduceerde LMEP
zichtbaar na een vertraging van enkele weken. Gezien de LMEP echter het resultaat is van
efferente stimulatie en VNS gefocust is op stimulatie van de afferente vezels blijft de LMEP een
indirecte surrogaatmerker. De LMEP kan dus enkel gebruikt worden voor verificatie van het
herstel van de n.vagus na implantatie en niet als een richtlijn voor individuele VNS-parameter
titratie. Een mogelijke oplossing hiervoor zou het implementeren van het meten van
samengestelde (compound) actiepotentialen (CAP) van de afferente vagale vezels kunnen zijn
(37, 38). Het postoperatief meten van CAP’s kan zowel onderzoekers als clinici helpen de
individuele optimale intensiteit te bepalen waarbij er volledige activatie van de afferente vagale
vezels plaatsvindt. De laatste jaren is de aandacht gegroeid voor het ontwikkelen van
VNS-apparaten met een elektrode voor zowel stimulatie als opname. Een feasibility-studie
heeft aangetoond dat het mogelijk is afferente CAP’s te meten door gebruik te maken van zo
een apparaat (52).
Op experimenteel niveau kan het LMEP-protocol nog geoptimaliseerd worden. Gezien in deze
studie stimulatie-input niet getitreerd werd tegenover activatie-output kan suboptimale
zenuwactivatie niet uitgesloten worden. Chronische metingen en analyse van de evolutie van de
43
LMEP metingen zouden hiervoor kunnen leiden tot optimale stimulatieparameters. Optimaal
zouden LMEP’s gemeten moeten worden op chronische basis in wakkere dieren.
Naast de presynaptische metabotrope glutamaatreceporen spelen nog verschillende frequentie
afhankelijke mechanismen mee op het niveau van de NTS-synaps om de sensorische afferente
signaaltransmissie te reguleren, waaronder AMPA-receptordesensitisatie, depletie van
synaptische blaasjes op de actieve zones, presynaptische calciumstroominactivatie of activatie
van inhibitoire interneuronen (17). Hoe hoogfrequente microburststimulatie inspeelt op deze
mechanismen is niet gekend. In vitro studies waarbij de vagale-NTS synaps gemodelleerd
wordt en de frequentie van microburst getitreerd wordt met als outcome parameter de depressie
van deze synaps zouden kunnen helpen het vraagstuk op te lossen.
Een mogelijkheid om genetische variaties in de n.vagus–NTS synaps (prevalentie van
metabotrope glutamaatreceptoren op zowel pre als postsynaptische sites, contributie van
specifieke subtype metabotrope glutamaatreceptoren enz.(17)) uit te schakelen als
beïnvloedende factor voor microburstefficaciteit is in hetzelfde dier zowel de standaard-VNS
modaliteit als de microburst-VNS modaliteit toe te dienen met een wash-outperiode tussen
beide stimulatieprotocols. Zo schakelt men de intra-individuele variabiliteit uit en bestudeert
men enkel het zuivere efficiëntieverschil tussen beide modaliteiten. De duur van deze
wash-outperiode zou eerst moeten bepaald worden om geen overlap van de alteraties van de
hippocampale noradrenalineconcentratie door beide modaliteiten als confounding factor te
ervaren. Op deze manier kan men ook bestuderen of er een verschil is in responder rate tussen
standaard en microburst VNS.
Ook kan de in vivo basisconcentratie en het stijgingspotentieel van hippocampaal noradrenaline
verschillen tussen de generaties ratten door genetische variaties. Om deze confounder uit te
sluiten en zo het vergelijken van verschillende studies te vergemakkelijken kan men na het
microdialyse-experiment en na een washout-periode waarbij de VNS gerelateerde NE stijging
terug naar baseline is geëvolueerd, een specifieke noradrenaline-heropnameremmer voor zoals
reboxetine
(53)
toedienen.
Op
deze
manier
kan
men
de
VNS
geïnduceerde
noradrenalinestijging bestuderen in het licht van de farmacologisch geïnduceerde
noradrenalinestijging zodat voor deze parameter gestandaardiseerd kan worden en de relatieve
eerder dan de absolute VNS geïnduceerde noradrenalinestijging kan gemeten worden.
44
Als laatste moet ook de potentiele invloed van NE-cotransmitters op de modulerende rol van
LC-neuronen op epileptische aanvallen in acht genomen worden. Zo synthetiseren
LC-neuronen een variëteit van peptiden zoals enkephaline, neurotensine, vaspopressine,
somtatostatine, neuropeptide Y en galanine (gal). Enkele van deze NE-contransmitters hebben
duidelijke anticonvulsieve effecten. Gal is de meest efficiënte in het tegengaan van SE en is
gecolokaliseerd met NE in meer dan 80% van de LC-neuronen. Intrahippocampale en i.c.v.
toediening van gal vermindert epileptische aanvallen geïnduceerd door zowel picrotoxine als
perforante pad stimulatie. NPY-concentratie is verhoogd in de gebieden gerekruteerd door
limbische aanvallen en heeft anti-epileptische eigenschappen (54). In hoeverre deze
cotransmitters bijdragen aan het anticonvulsieve effect van NE-LC axonen en of ze ook
gerekruteerd worden tijdens VNS moet nog onderzocht worden.
Een mogelijk hiaat van deze studie is de beperkte temporele resolutie van de microdialyse
techniek. Robuuste stijgingingen in noradrenaline kunnen gemeten worden, maar het is
moeilijk te filteren voor acute noradrenalinestijgingen gerelateerd aan externe factoren als een
dialysaat overeenstemt met een meting van twintig minuten. Acute stress geïnduceerd door
onder meer interactie met de onderzoeker kan een stressrespons uitlokken. Deze stressrespons
bestaat uit verschillende neurobiologische mechanismen, waaronder activatie van de LC en de
hieraan
gerelateerde
hippocampale
noradrenalinestijging.
Ook
wordt
de
hypothalamo-hypofysaire-adrenocorticale (HPA) as geactiveerd waarbij CRF (corticotropine
releasing factor) vrijgesteld wordt wat leidt tot hypofysaire secretie van adrenocorticotroop
hormoon (ACTH) en uiteindelijk vrijstelling van glucocorticoiden zoals cortisol in de mens en
corticosterone in knaagdieren (55). Dit uit zich in een signaaloverdracht van de hypothalamus
naar de adrenale medula wat leidt tot vrijstelling van noradrenaline, die ook de hersenen bereikt.
i.c.v. toediening van CRF resulteert in een stijging van de activiteit van de noradrenerge
neuronen in de LC, en hieruit volgend een stijging in hippocampaal noradrenaline (56). Het
meten van hippocampaal CRF/corticosterone tijdens het experiment zou een oplossing kunnen
zijn voor het differentiëren tussen noradrenalinestijging gerelateerd aan VNS enerzijds of aan
externe stressoren anderzijds.
Een oplossing voor het brede tijdsinterval van de microdialysetechniek is het gebruik van in
vivo voltammetrie voor het meten van hippocampaal noradrenaline (56). Via deze techniek
wordt gebruik gemaakt van het oxidatiepotentiaal van noradrenaline (+0.55V) tegenover een
45
referentie elektrode om de concentratie te meten met een resolutie in het bereik van seconden.
Specificiteit voor noradrenaline kan bekomen worden door verschillende parameters,
waaronder bijvoorbeeld het coaten van de elektrode met Nafion wat leidt tot een
selectiviteitsratio van 250:1 ten opzichte van ascorbinezuur. Deze seconden resolutie zou de
mogelijkheid voor het correleren van video beelden (interactie met onderzoeker, schrikreflexen,
enz..) en de acute noradrenalinestijging bieden, waardoor deze kunnen gefilterd worden en
enkel het zuivere effect van VNS op hippocampaal noradrenaline kan bestudeerd worden.
Hoewel het moeilijk is het amperometrisch signaal voor noradrenaline te onderscheiden van dat
van dopamine, blijk de contributie van dopampine aan het noradrenerg signaal niet meer dan
10% te kunnen bedragen, gebaseerd op hippocampale metingen in de muis (57). Specificiteit
kan verder bekomen worden aan de hand van farmacologische verificatie (bijvoorbeeld door
gebruik van de alpha2-AR antagonist idazoxan).
Als laatste kan het geslacht van de onderzoeker (in dit geval mannelijk) een belangrijke
confounder zijn in deze studie alsook in het vergelijken met andere studies. Zo is namelijk zeer
recent aangetoond dat het blootstellen van ratten (en muizen) aan mannelijke maar niet aan
vrouwelijke onderzoekers leidt tot een verhoogde pijn-inhibitie. Mannelijk-gerelateerde stimuli
(alsook kleding gedragen door een man, nestmateriaal van niet familiare dieren en humane
mannelijke okselsecreten) induceren een robuuste fysiologische stressrespons die leidt tot
stress-geïnduceerde analgesie. Gezien de belangrijke invloed van stress op hippocampaal
noradrenaline kan dit een grote confounder zijn waarvoor in de toekomst gecontroleerd dient te
worden. Zo blijkt de simultane aanwezigheid van een vrouwelijke onderzoekster deze
stressrespons te attenueren (58). De resultaten van deze studie moeten echter met
voorzichtigheid benaderd worden, gezien deze nog niet gerepliceerd zijn door andere
onderzoeksgroepen.
5 Algemeen besluit
We kunnen concluderen dat in het focale pilocarpinemodel voor MTLE microburststimulatie
van de n.vagus niet leidt tot een anti-epileptisch effect. Ook was geen microburst VNS
gerelateerde significante hippocampale noradrenalinestijging te bemerken.
Verder onderzoek is nodig om de frequentieafhankelijke depressie van de n.vagus-NTS synaps
en de invloed van microburst-VNS hierop in kaart te brengen.
46
6 Referenties
1.
Malmgren K, Thom M. Hippocampal sclerosis--origins and imaging. Epilepsia. 2012
Sep;53 Suppl 4:19-33. PubMed PMID: 22946718. Epub 2012/09/14. eng.
2.
Fisher RS, van Emde Boas W, Blume W, Elger C, Genton P, Lee P, et al. Epileptic
seizures and epilepsy: definitions proposed by the International League Against Epilepsy
(ILAE) and the International Bureau for Epilepsy (IBE). Epilepsia. 2005 Apr;46(4):470-2.
PubMed PMID: 15816939. Epub 2005/04/09. eng.
3.
Fisher RS, Acevedo C, Arzimanoglou A, Bogacz A, Cross JH, Elger CE, et al. ILAE
Official Report: A practical clinical definition of epilepsy. Epilepsia. 2014;55(4):475-82.
4.
Ramani R. Vagus nerve stimulation therapy for seizures. Journal of neurosurgical
anesthesiology. 2008 Jan;20(1):29-35. PubMed PMID: 18157022. Epub 2007/12/25. eng.
5.
Chang BS, Lowenstein DH. Epilepsy. New England Journal of Medicine.
2003;349(13):1257-66. PubMed PMID: 14507951.
6.
Thurman DJ, Beghi E, Begley CE, Berg AT, Buchhalter JR, Ding D, et al. Standards for
epidemiologic studies and surveillance of epilepsy. Epilepsia. 2011 Sep;52 Suppl 7:2-26.
PubMed PMID: 21899536. Epub 2011/10/18. eng.
7.
Browne TR, Holmes GL. Handbook of Epilepsy: Lippincott Williams & Wilkins; 2008.
8.
Ruffoli R, Giorgi FS, Pizzanelli C, Murri L, Paparelli A, Fornai F. The chemical
neuroanatomy of vagus nerve stimulation. Journal of Chemical Neuroanatomy. 2011
Dec;42(4):288-96. PubMed PMID: WOS:000297830400009.
9.
Boon P, Raedt R, de Herdt V, Wyckhuys T, Vonck K. Electrical stimulation for the
treatment of epilepsy. Neurotherapeutics. 2009 Apr;6(2):218-27. PubMed PMID: 19332313.
Epub 2009/04/01. eng.
10.
Roosevelt RW, Smith DC, Clough RW, Jensen RA, Browning RA. Increased
extracellular concentrations of norepinephrine in cortex and hippocampus following vagus
nerve stimulation in the rat. Brain Res. 2006 Nov 13;1119:124-32. PubMed PMID:
WOS:000242309600013.
11.
Groves DA, Brown VJ. Vagal nerve stimulation: a review of its applications and
potential mechanisms that mediate its clinical effects. Neuroscience &amp; Biobehavioral
Reviews. 2005 5//;29(3):493-500.
12.
Heck C, Helmers SL, DeGiorgio CM. Vagus nerve stimulation therapy, epilepsy, and
device parameters: scientific basis and recommendations for use. Neurology. 2002 Sep
24;59(6 Suppl 4):S31-7. PubMed PMID: 12270966. Epub 2002/09/25. eng.
13.
Kang YH, Sun B, Park YS, Park CS, Jin YH. GABA(A) and GABA(B) receptors have
opposite effects on synaptic glutamate release on the nucleus tractus solitarii neurons.
Neuroscience. 2012 May 3;209:39-46. PubMed PMID: 22410341. Epub 2012/03/14. eng.
14.
Bailey TW, Hermes SM, Andresen MC, Aicher SA. Cranial visceral afferent pathways
through the nucleus of the solitary tract to caudal ventrolateral medulla or paraventricular
hypothalamus: target-specific synaptic reliability and convergence patterns. The Journal of
neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 2006 Nov
15;26(46):11893-902. PubMed PMID: 17108163. Epub 2006/11/17. eng.
15.
Fernandes LG, Jin YH, Andresen MC. Heterosynaptic crosstalk: GABA-glutamate
metabotropic receptors interactively control glutamate release in solitary tract nucleus.
Neuroscience. 2011 Feb 3;174:1-9. PubMed PMID: 21129447. Pubmed Central PMCID:
PMC3020236. Epub 2010/12/07. eng.
16.
Jin YH, Bailey TW, Andresen MC. Cranial afferent glutamate heterosynaptically
modulates GABA release onto second-order neurons via distinctly segregated metabotropic
glutamate receptors. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for
Neuroscience. 2004 Oct 20;24(42):9332-40. PubMed PMID: 15496669. Epub 2004/10/22.
eng.
17.
Liu Z, Chen CY, Bonham AC. Metabotropic glutamate receptors depress vagal and
aortic baroreceptor signal transmission in the NTS. The American journal of physiology. 1998
Nov;275(5 Pt 2):H1682-94. PubMed PMID: 9815076. Epub 1998/11/14. eng.
47
18.
Glaum SR, Miller RJ. Metabotropic glutamate receptors depress afferent excitatory
transmission in the rat nucleus tractus solitarii. J Neurophysiol. 1993 Dec;70(6):2669-72.
PubMed PMID: 7907134. Epub 1993/12/01. eng.
19.
Bailey TW, Appleyard SM, Jin YH, Andresen MC. Organization and properties of
GABAergic neurons in solitary tract nucleus (NTS). J Neurophysiol. 2008 Apr;99(4):1712-22.
PubMed PMID: 18272881. Epub 2008/02/15. eng.
20.
Chandley MJ, Ordway GA. Noradrenergic Dysfunction in Depression and Suicide
The Neurobiological Basis of Suicide. Dwivedi Y, editor. Boca Raton FL: Llc.; 2012.
21.
Aston-Jones G, Zhu Y, Card JP. Numerous GABAergic afferents to locus ceruleus in
the pericerulear dendritic zone: possible interneuronal pool. The Journal of neuroscience : the
official journal of the Society for Neuroscience. 2004 Mar 3;24(9):2313-21. PubMed PMID:
14999082. Epub 2004/03/06. eng.
22.
Van Bockstaele EJ, Peoples J, Telegan P. Efferent projections of the nucleus of the
solitary tract to peri-locus coeruleus dendrites in rat brain: evidence for a monosynaptic
pathway. The Journal of comparative neurology. 1999 Sep 27;412(3):410-28. PubMed PMID:
10441230. Epub 1999/08/11. eng.
23.
Hazra A, Rosenbaum R, Bodmann B, Cao S, Josic K, Ziburkus J. beta-Adrenergic
modulation of spontaneous spatiotemporal activity patterns and synchrony in hyperexcitable
hippocampal circuits. Journal of Neurophysiology. 2012 Jul;108(2):658-71. PubMed PMID:
WOS:000306416400023.
24.
Jurgens CW, Boese SJ, King JD, Pyle SJ, Porter JE, Doze VA. Adrenergic receptor
modulation of hippocampal CA3 network activity. Epilepsy Res. 2005 Aug-Sep;66(1-3):117-28.
PubMed PMID: 16140503. Epub 2005/09/06. eng.
25.
Castoro MA, Yoo PB, Hincapie JG, Hamann JJ, Ruble SB, Wolf PD, et al. Excitation
properties of the right cervical vagus nerve in adult dogs. Experimental Neurology. 2011
Jan;227(1):62-8. PubMed PMID: WOS:000286367800010.
26.
Craig AD. Microburst electrical stimulation of cranial nerves for the treatment of medical
conditions. Google Patents; 2007.
27.
Craig AD. Vagus nerve stimulation method. Google Patents; 2012.
28.
Ito SI, Craig AD. Vagal-evoked activity in the parafascicular nucleus of the primate
thalamus. Journal of Neurophysiology. 2005 Oct;94(4):2976-82. PubMed PMID:
WOS:000231834200060.
29.
Martlé V, Peremans K, Raedt R, Vermeire S, Vonck K, Boon P, et al. Regional brain
perfusion changes during standard and microburst vagus nerve stimulation in dogs. Epilepsy
Research. 2014 5//;108(4):616-22.
30.
Curia G, Longo D, Biagini G, Jones RSG, Avoli M. The pilocarpine model of temporal
lobe epilepsy. Journal of Neuroscience Methods. 2008 Jul 30;172(2):143-57. PubMed PMID:
WOS:000258200300001.
31.
Smolders I, Khan GM, Manil J, Ebinger G, Michotte Y. NMDA receptor-mediated
pilocarpine-induced seizures: characterization in freely moving rats by microdialysis. Br J
Pharmacol. 1997 Jul;121(6):1171-9. PubMed PMID: 9249254. Pubmed Central PMCID:
PMC1564791. Epub 1997/07/01. eng.
32.
Meurs A, Clinckers R, Ebinger G, Michotte Y, Smolders I. Substantia nigra is an
anticonvulsant site of action of topiramate in the focal pilocarpine model of limbic seizures.
Epilepsia. 2006 Sep;47(9):1519-35. PubMed PMID: 16981869. Epub 2006/09/20. eng.
33.
Millan MH, Chapman AG, Meldrum BS. Extracellular amino acid levels in hippocampus
during pilocarpine-induced seizures. Epilepsy Res. 1993 Feb;14(2):139-48. PubMed PMID:
8095893. Epub 1993/02/01. eng.
34.
Furtado Mde A, Braga GK, Oliveira JA, Del Vecchio F, Garcia-Cairasco N. Behavioral,
morphologic, and electroencephalographic evaluation of seizures induced by intrahippocampal
microinjection of pilocarpine. Epilepsia. 2002;43 Suppl 5:37-9. PubMed PMID: 12121293.
Epub 2002/07/18. eng.
35.
Plock N, Kloft C. Microdialysis--theoretical background and recent implementation in
applied life-sciences. European journal of pharmaceutical sciences : official journal of the
European Federation for Pharmaceutical Sciences. 2005 May;25(1):1-24. PubMed PMID:
15854796. Epub 2005/04/28. eng.
36.
Raedt R, Clinckers R, Mollet L, Vonck K, El Tahry R, Wyckhuys T, et al. Increased
48
hippocampal noradrenaline is a biomarker for efficacy of vagus nerve stimulation in a limbic
seizure model. Journal of Neurochemistry. 2011 May;117(3):461-9. PubMed PMID:
WOS:000289464500010.
37.
El Tahry R, Mollet L, Raedt R, Delbeke J, De Herdt V, Wyckhuys T, et al. Repeated
assessment of larynx compound muscle action potentials using a self-sizing cuff electrode
around the vagus nerve in experimental rats. Journal of Neuroscience Methods. 2011 Jun
15;198(2):287-93. PubMed PMID: WOS:000292435900018.
38.
Mollet L, Raedt R, Delbeke J, El Tahry R, Grimonprez A, Dauwe I, et al.
Electrophysiological responses from vagus nerve stimulation in rats. International journal of
neural systems. 2013 Dec;23(6):1350027. PubMed PMID: 24156670. Epub 2013/10/26. eng.
39.
Mollet L, Grimonprez A, Raedt R, Delbeke J, El Tahry R, De Herdt V, et al.
Intensity-dependent modulatory effects of vagus nerve stimulation on cortical excitability. Acta
Neurol Scand. 2013 Dec;128(6):391-6. PubMed PMID: 23614853. Epub 2013/04/26. eng.
40.
Alexander GM, McNamara JO. Vagus nerve stimulation elevates seizure threshold in
the kindling model. Epilepsia. 2012 Nov;53(11):2043-52. PubMed PMID:
WOS:000310975400024.
41.
Witcher MR, Ellis TL. Astroglial networks and implications for therapeutic
neuromodulation of epilepsy. Frontiers in Computational Neuroscience. 2012 Aug 29;6.
PubMed PMID: WOS:000308061700001.
42.
Kushikata T, Yoshida H, Kudo M, Kudo T, Kudo T, Hirota K. Role of coerulean
noradrenergic neurones in general anaesthesia in rats. British journal of anaesthesia. 2011
Dec;107(6):924-9. PubMed PMID: 21965049. Epub 2011/10/04. eng.
43.
Vazey EM, Aston-Jones G. Designer receptor manipulations reveal a role of the locus
coeruleus noradrenergic system in isoflurane general anesthesia. Proc Natl Acad Sci U S A.
2014 Mar 11;111(10):3859-64. PubMed PMID: 24567395. Pubmed Central PMCID:
PMC3956184. Epub 2014/02/26. eng.
44.
Kline DD. Plasticity in glutamatergic NTS neurotransmission. Respir Physiol Neurobiol.
2008 Dec 10;164(1-2):105-11. PubMed PMID: 18524694. Pubmed Central PMCID:
PMC2666915. Epub 2008/06/06. eng.
45.
Hermes SM, Mitchell JL, Silverman MB, Lynch PJ, McKee BL, Bailey TW, et al.
Sustained hypertension increases the density of AMPA receptor subunit, GluR1, in
baroreceptive regions of the nucleus tractus solitarii of the rat. Brain Res. 2008 Jan
2;1187:125-36. PubMed PMID: 18031714. Pubmed Central PMCID: PMC2225988. Epub
2007/11/23. eng.
46.
Chen CY, Ling Eh EH, Horowitz JM, Bonham AC. Synaptic transmission in nucleus
tractus solitarius is depressed by Group II and III but not Group I presynaptic metabotropic
glutamate receptors in rats. The Journal of physiology. 2002 Feb 1;538(Pt 3):773-86. PubMed
PMID: 11826164. Pubmed Central PMCID: PMC2290096. Epub 2002/02/05. eng.
47.
Andresen MC, Fawley JA, Hofmann ME. Peptide and lipid modulation of glutamatergic
afferent synaptic transmission in the solitary tract nucleus. Frontiers in neuroscience.
2012;6:191. PubMed PMID: 23335875. Pubmed Central PMCID: PMC3541483. Epub
2013/01/22. eng.
48.
Mifflin SW. Short-term potentiation of carotid sinus nerve inputs to neurons in the
nucleus of the solitary tract. Respiration physiology. 1997 Nov;110(2-3):229-36. PubMed
PMID: 9407615. Epub 1998/01/04. eng.
49.
Dorr AE, Debonnel G. Effect of vagus nerve stimulation on serotonergic and
noradrenergic transmission. J Pharmacol Exp Ther. 2006 Aug;318(2):890-8. PubMed PMID:
16690723. Epub 2006/05/13. eng.
50.
Cota VR, Medeiros DdC, Silva da Pascoa Vilela MR, Doretto MC, Dutra Moraes MF.
Distinct patterns of electrical stimulation of the basolateral amygdala influence
pentylenetetrazole seizure outcome. Epilepsy & Behavior. 2009 Jan;14:26-31. PubMed PMID:
WOS:000262800100008.
51.
Diamond JS, Jahr CE. Synaptically released glutamate does not overwhelm
transporters on hippocampal astrocytes during high-frequency stimulation. J Neurophysiol.
2000 May;83(5):2835-43. PubMed PMID: 10805681. Epub 2000/05/11. eng.
52.
El Tahry R, Raedt R, Mollet L, De Herdt V, Wyckuys T, Van Dycke A, et al. A novel
implantable vagus nerve stimulation system (ADNS-300) for combined stimulation and
49
recording of the vagus nerve: Pilot trial at Ghent University Hospital. Epilepsy Research. 2010
Dec;92(2-3):231-9. PubMed PMID: WOS:000285657300015.
53.
Sacchetti G, Bernini M, Bianchetti A, Parini S, Invernizzi RW, Samanin R. Studies on
the acute and chronic effects of reboxetine on extracellular noradrenaline and other
monoamines in the rat brain. Br J Pharmacol. 1999 Nov;128(6):1332-8. PubMed PMID:
10578149. Pubmed Central PMCID: PMC1571760. Epub 1999/12/01. eng.
54.
Fornai F, Ruffoli R, Giorgi FS, Paparelli A. The role of locus coeruleus in the
antiepileptic activity induced by vagus nerve stimulation. European Journal of Neuroscience.
2011 Jun;33(12):2169-78. PubMed PMID: WOS:000292525000001.
55.
Heinrichs SC. Neurobehavioral consequences of stressor exposure in rodent models
of epilepsy. Progress in Neuro-Psychopharmacology & Biological Psychiatry. 2010 Jun
30;34(5):808-15. PubMed PMID: WOS:000280031900009.
56.
Palamarchouk VS, Zhang J, Zhou G, Swiergiel AH, Dunn AJ. Hippocampal
norepinephrine-like voltammetric responses following infusion of corticotropin-releasing factor
into the locus coeruleus. Brain Res Bull. 2000 Mar 1;51(4):319-26. PubMed PMID: 10704782.
Epub 2000/03/08. eng.
57.
Yavich L, Jakala P, Tanila H. Noradrenaline overflow in mouse dentate gyrus following
locus coeruleus and natural stimulation: real-time monitoring by in vivo voltammetry. J
Neurochem. 2005 Nov;95(3):641-50. PubMed PMID: 16248883. Epub 2005/10/27. eng.
58.
Sorge RE, Martin LJ, Isbester KA, Sotocinal SG, Rosen S, Tuttle AH, et al. Olfactory
exposure to males, including men, causes stress and related analgesia in rodents. Nature
methods. 2014 Apr 28. PubMed PMID: 24776635. Epub 2014/04/30. Eng.
50
I
BIJLAGE I
Lijst van afkortingen
5-HT
µl
µm
µs
AED
AMPA R
Beta-AR
CA
DMN
DRAEDD
DRN
EEG
EES
eVEP
FDA
GABA
gal
HS
Hz
i.c.v.
i.p.
i.p.v.
K+
kDA
kg
kΩ
LC
LMEP
M1
mA
ml
mm
mM
mTLE
n.vagus
NA
NE
NMDA
NPY
NSAID
NTS
PCB
Peri-LC
pERK
PET
PFA
serotonine
microliter
micrometer
microseconde
anti-epileptische drug
α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid receptor,
beta adrenoreceptoren
cornu ammonis
dorsale motore nucleus van de nervus vagus
designer receptors exclusively activated by designer drugs
dorsale raphe nucleus
elektro-encefalogram
epileptische ernst score
enhanced vagal evoked potential
food and drug administration
gamma amino-boterzuur
galanine
hippocampale sclerose
Hertz
Intracerebroventriculair
Intraperitoneaal
In plaats van
kaliumion
kilodalton
kilogram
kilo ohm
locus coeruleus
laryngeal muscle evoked potential
muscarinereceptor subtype 1
milliampère
milliliter
millimeter
millimolair
mesiale temporale kwab epilepsie
nervus vagus
nucleus ambiguus
norepinephrine
N-methyl-D-aspartaat,
neuropeptide Y
niet-steroidale anti-inflammatoire drug
nucleus tractus solitarius
printed circuit board
perifere regio rond de LC
extracellulair signaal gereguleerd kinase (gefosforyleerd)
positron emission tomography
paraformaldehyde
I
Pgi
PKA
PrH
PTZ
RCT
SE
SPECT
SPSS
SPW-R
TEES
Vdc
VEP
VNS
nucleus paragigantocellularis
cyclisch AMP proteïne kinase A
perifasciculaire area van de nucleus prepositus hypoglossi
pentyleen tetrazol
randomized controlled trial
status epilepticus
single-photon emission computed tomography
statistical package for the social sciences
sharp wave-ripple
totale epileptische ernst score
volt, gelijkstroom
vagal evoked potential
nervus vagus stimulatie
II
BIJLAGE II: NEUROCHEMISCHE ANALYSE
Legende voor alle grafieken:
Blauw = basis noradrenalineconcentratie
Rood = noradrenalineconcentratie na microburst VNS
Figuur 17 neurochemische analyse van
rat met identificatienr "L3".
Figuur 18: neurochemische analyse van rat
met identificatienr "L6".
Figuur 19: neurochemische analyse van rat
Figuur 20: neurochemische analyse van rat
met identificatienr "L12" VOOR FILTEREN
met identificatienr "L12" NA FILTEREN
VOOR OUTLIER.
VOOR OUTLIER.
III
Figuur 21: neurochemische analyse van rat
Figuur 22: neurochemische analyse van rat
met identificatienr "L13".
met identificatienr "L15".
1 Figuur 23: neurochemische analyse van rat
met identificatienr "L16".
Figuur 24: neurochemische analyse van rat
met identificatienr "L18".
Figuur 25: neurochemische analyse van rat
met identificatienr "L19".
IV
V

download presentatie

Eddy 埃迪 Schekman - ABN AMRO Markets

Ochtendprogramma

Gezondheidsvragenlijst

PVC Voetbal - Oefenstof ABC-junioren - 8 tegen 6

download presentatie

88386 BBS - Bubbelbadmat

Epilepsie,

H. Christiaan Stronks, Huib Versnel, Vera .F. Prijs, Wilko Grolman

download presentatie