Ontwikkeling qPCR Woronichinia

1
Ontwikkeling qPCR Woronichinia
Kimberly Learbuch, Edwin Kardinaal en Bart Wullings
Bridging science to practice
Even stapje terug
2
Bridging science to practice
qPCR
Elk organisme bevat DNA: uniek voor soort (of individu).
DNA niks meer dan opeenvolging van stikstofbasen :
Adenine (A), Thymine (T), Cytosine (C) en Guanine (G)
ATGCGTGCAATGTTTACGCGTAAAGCGTGCACGTTAGAGTACGTGCAGT
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
TACGCACGTTACAAATGCTCATTTCGCACGTGCAATCTCATGCACGTCA
3
Bridging science to practice
qPCR
4
Bridging science to practice
Q-PCR primer en probe design
 Fycocyanine operon (cpcBA)
• Uniek voor cyanobacteriën
• Grote collectie van “referentie” sequenties beschikbaar in
databases (totaal 1000 cpcBA sequenties)
© kwr 2010
5
5
Bridging science to practice
2010 Primer en probe design
Microcystis, Planktothrix, Anabaena en Aphanizomenon
• Microcystis en Planktothrix genus specifiek primers en probe
ontworpen
• Geslachten Anabaena en Aphanizomenon zijn niet monofylogenetisch maar vermengd
• Verschil tussen morfologische en fylogenetische classificatie
• Sequenties kunnen worden geclusterd in 4 grote clusters
• Primers en probes ontworpen tegen de 2 belangrijkste
clusters
6
Bridging science to practice
7
Dendrogram Anabaena en Aphanizomenon
cpcBA sequenties
A
e.g. Anabaena bergii, Aphanizomenon ovalisporum,
B
Anabaena variabilis, Anabaena siamensis
e.g. Anabaena flos-aquae, A. kisseleviana, A.bergii,
A. sphaerica, Aphanizomenon aphanizomenoides,
C
D
e.g. Anabaena solitaria, A. planktonica, A. viguieri,
A. spiorides, A. circinalis, A. smithii, A. ucrainica, A. affinis,
A. elipsoides, and A. lemmermannii
e.g. Aphanizomenon glacile, A. flos-aquae, A. issatschenkoi,
Anabaena lemmermannii, A. circinalis, A. flos-aquae
7
Bridging science to practice
8
Camping De Watermolen
Anabaena C
Aphanizomenon D
Microcystis
Planktotrix
Anabaena sp.
Aphanizomenon
Microcystis sp.
Planktothrix sp.
cellen / DNA kopie
aantallen per ml
1000000
100000
10000
1000
100
10
1
25
27
29
31
33
Weeknummers
35
37
39
Bridging science to practice
9
Planktothrix
8
log genkopieën (/mL)
R2 = 0,875
6
4
2
0
0
1
2
3
4
log cellen (/mL)
5
6
7
Bridging science to practice
Conclusies 2012
• Goede relatie cel aantallaen en DNA kopie aantallen: op basis
van 2 veldstudies, meer dan 400 monsters
• Conversie factoren DNA kopie aantal naar cel equivalent in
orde
• Na conversie genereren beide technieken resultaten van
dezelfde orde grootte
• qPCR op basis van fycocyanine genen is goed alternatief voor
microscopische tellingen!
Nog te doen:
• Meer laboratoria betrekken
• Blijven werken aan de inzichten aangaande de realties tussen cel
aantallen en DNA kopie aantallen
• Uitbreiden naa andere genera: o.a. Woronichinia / Phormidium
(benthisch genus)
10
Bridging science to practice
Geslachten potentieel toxische cyanobacteriën
in NL
Bij monitoring van blauwalgen gaat het om het voorzorgsprincipe. Hierbij
wordt gekeken naar de vijf meest voorkomende potentieel toxische
geslachten in Nederland: Microcystis, Anabaena, Aphanizomenon,
Planktothrix en Woronichinia
11
Bridging science to practice
Doel TKI project 2013
Het ontwikkelen en beschikbaar maken van moleculaire
technieken (primer / probe combinaties) voor het opsporen
van cyanobacteriën van de geslachten Woronichinia en /of
Phormidium.
12
Bridging science to practice
qPCR Woronichinia ontwikkeling
stappenplan
• Fycocyanine gen
• Watermonsters
• DNA-sequentie analyse
• Primer en probe ontwikkeling
• Specificiteit
• Praktijkmonsters
• Conclusie en vervolgonderzoek
13
Bridging science to practice
Fycocyanine gen
• Fycocyanine operon (cpcBA)
• Uniek voor cyanobacteriën
• Grote collectie van ‘referentie’ sequenties beschikbaar in
databases
• qPCR primers en probe (Taqman) ontwerpen op basis van
verschillen en overeenkomsten
• Maar voor Woronichinia zijn er geen fycocyanine sequenties
beschikbaar in databases
14
Bridging science to practice
Watermonsters met Woronichinia
Tilburg; 6 locaties
CENTAURUSWEG
EMMASINGEL
SWEELINCKVIJVER
GROENEWOLD
KAUKASUSWEG
CADDENBOSCH
15
Bridging science to practice
Woronichinia selecteren
EMMASINGEL-DRIJFLAAG
SWEELINCKVIJVER-DRIJFLAAG
16
Bridging science to practice
17
Woronichinia selecteren
• Kolonies isoleren + wasstappen
• 72 kolonies geselecteerd en toegepast in qPCR (algemeen primer paar)
• Hiervan 20 resultaten gebruikt voor sequentie analyse
Bridging science to practice
18
Sequentieanalyse
20 kolonies; 3 verschillende locaties
• Homogene sequenties!
• Match met genen database
• hoog (99% ) percentage overeenkomstig met ‘uncultured
Chroococcus sp. Clone’
• Artikel Miller (2011) “Genetic diversity of cyanobacteria in four
eutrphic lakes”
 conclusie op basis van 92,6-93,8% sequentie overeenkomst met
andere Chroococussen
 foutieve conclusie: overeenkomst te laag.
• De sequenties zijn van Woronichinia!
Bridging science to practice
qPCR Primer en probe ontwikkeling
Combinatie
Forward primer
Reverse primer
1
Woro-1266F
Woro-1484R
2
Woro-1479R
3
Woro-1555R
4
Woro-1385F
Woro-1484R
5
Woro-1479R
6
Woro-1555R
Naam
Woro-1385F
Woro-1555R
Naam
Lengte
probe
Woro-1385F
18
Woro-1479P
Woro-1555R
20
Woro-1484P
Woro-1479P
19
Woro-1492P
19
Bridging science to practice
Ijklijn
20
Bridging science to practice
Specificiteit
Soort
PCR resultaat
De specificiteit van
een qPCR methode beschrijft
het
Anabaena circinalis
N/A
vermogen
van de methode om echt-negatieve reacties
Anabaena flos-aquae
N/A te
Anabaena inaequalis
N/A
genereren
Anabaena varabilis
N/A
Anabaena variabilis
N/A
Aphinozmenon flos-aquae
N/A
Aphinozmenon flos-aquae
N/A
Aphinozmenon flos-aquae
N/A
Microcystis aeruginosa
N/A
Microcystis aeruginosa
N/A
Microcystis aeruginosa
N/A
Planktothrix agardhii
N/A
Planktothrix agardhii
N/A
Planktothrix agardii cya
N/A
Phormidium autumnale
N/A
21
Bridging science to practice
Praktijkmonsters 2013
Tilburg
Woronichinia
Microcystis
Planktothrix
Anabaena
Aphanizomenon
kopien/ml
kopien/ml
kopien/ml
kopien/ml
kopien/ml
Emmasingel
8,18E+06
1,29E+06
6,60E+06
9,68E+04
2,01E+03
Sweelinckvijver
3,88E+06
1,71E+06
2,62E+05
3,68E+06
1,82E+05
Centaurusweg
5,37E+06
1,70E+05
6,24E+05
7,88E+05
1,35E+05
Groenewold
3,65E+05
8,38E+05
8,73E+02
1,48E+04
7,68E+03
Kaukasuslaan
9,13E+05
9,46E+06
1,67E+01
4,76E+04
1,74E+05
Caddenbosch
2,29E+06
5,60E+06
1,43E+05
6,16E+03
6,40E+03
22
Bridging science to practice
23
Praktijkmonsters 2010
Woronichinia
Microcystis
Planktothrix
Anabaena
Aphanizomenon
cellen/ml
kopien/ml
CelCelcellen/ml Cel-equiv/ml cellen/ml Cel-equiv/ml cellen/ml equiv/ml cellen/ml equiv/ml
0,00E+00
2,87E+03
3,00E+02
1,75E+03
1,00E+00
1,93E+02
2,57E+03 5,21E+01 1,00E+00 1,89E+03
1,07E+03
1,17E+03
1,00E+00
6,46E+03
7,33E+04
7,14E+04
6,03E+03 1,06E+03 7,78E+03 2,58E+04
3,56E+03
2,27E+00
1,00E+00
4,65E+03
5,89E+05
1,42E+05
2,24E+04 5,49E+03 1,86E+04 7,53E+04
1,65E+03
1,27E+04
8,35E+03
7,12E+03
1,00E+00
2,02E+01
1,56E+04 8,63E+03 1,57E+02 8,94E+01
1,52E+03
2,83E+04
7,91E+03
1,82E+04
4,99E+02
5,13E+01
1,62E+04 4,70E+03 1,10E+03 1,85E+02
6,66E+03
1,06E+04
1,00E+00
9,54E+03
4,17E+04
1,47E+04
1,79E+03 1,69E+03 1,51E+04 6,79E+03
1,67E+03
1,15E+05
2,37E+04
3,61E+04
2,74E+02
1,76E+02
1,00E+01 2,00E+01 4,40E+01 3,53E+02
1,45E+03
8,48E+03
1,00E+00
8,99E+03
4,04E+04
8,68E+03
2,74E+03 9,28E+02 7,42E+03 4,39E+03
1,10E+03
2,77E+05
1,82E+03
4,71E+04
1,00E+00
3,78E+01
1,00E+00 3,16E+01 1,23E+03 1,41E+03
Bridging science to practice
Conclusie ontwikkeling qPCR Woronichinia
• qPCR methode voor Woronichinia werkt naar behoren
• Cyanobacterie toolbox compleet!
 Vervolgacties
o Verdere validatie
o Ontwikkelen van een positieve controle
o Omrekenfactoren bepalen
o Toepassen in praktijk (2014?)
24
Bridging science to practice
Resultaten 2013
• Onderzoek uitgevoerd m.b.v. TKI subsidie
• Implementatie qPCR techniek bij Intertek (Geleen)
• Toepassing qPCR op 4 geslachten
• Totaal 306 monster geanalyseerd
• Bevredigend
o.b.v.
qPCR eerder waarschuwing
Binnenkort
Wullingsresultaat,
et al. in H2O
online:
“DNA toolbox blauwalgen is klaar voor de start: routinematige
toepassing van qPCR detectie in zwemwater.”
25
Bridging science to practice
Dank voor jullie aandacht!
Met dank aan:
• Topconsortia voor Kennis en Innovatie (TKI's) van het
ministerie van Economische Zaken
• Intertek Life sciences
• RWS-WVL
• Waterschap de Dommel
Info:
[email protected]
www.kwrwater.nl
Twitter: @KWR_Water
26
Bridging science to practice
27
Bridging science to practice
Suggesties Blauwalgenprotocol
•
Werkelijke gezondheidsrisico’s van blauwalgen zitten opgesloten in de aanwezigheid
van toxines
•
Als screening is toxine analyse minder geschikt: te veel verschillende varianten en
mogelijk te duur
•
Als screening gelden fluorescentie analyse, qPCR fycocyanine, of microscopie als
inschatting voor potentieel gezondheidsrisico (bij fluorescentie altijd aanvullen met
microscopisch beeld of qPCR fycocyanine)
•
Potentieel toxinevormers in grote getalen aanwezig? Waarschuwen/neg zwemadvies
•
Aansluitend toxine analyse, op basis van aanwezige genera toxine-analyse bepalen
•
Toxine > 20? µg/L, dan zwemmen ontraden / sluiten
28
Bridging science to practice
Cyano-chlorofyl bepaling
+ check toxinevormers
Fycocyanine gen PCR
of direct
Microscopische tellingen
> 12,5 µg / l
(toxine genen PCR)
> 300.000 cellen (eq) / ml
Toxine analyse
> 20 µg / l
29

Download Report