Effectiviteit van ultrageluid op Tetraselmis suecica (alg) en Artemia

Effectiviteit van ultrageluid op
Tetraselmis suecica (alg) en Artemia
salina (zoöplankton)
Testen met apparatuur van LG Sonic en
Van Antwerpen Milieutechniek
Koper, E.
Dalen, van P.
Datum
26-02-2014
Voorwoord
Dit rapport is geschreven in opdracht van de HZ University of Applied Sciences,
onderzoeksgroep Water Technology. De experimenten die in deze rapportage
beschreven zijn, zijn uitgevoerd in het kader van het project RAAK-MKB Ultrasone
Desinfectie (feb 2012-jan 2014). De experimenten voor het rapport zijn uitgevoerd
van september 2012 tot februari 2013.
1
Inhoudsopgave
Voorwoord ........................................................................................ 1 1 Inleiding .............................................................................. 3 2 Effectiviteit ultrageluid op algen in batch cultuur ............................ 4 2.1 Resultaten ............................................................................. 4 2.2 Discussie ............................................................................... 6 2.3 Conclusie ............................................................................... 6 2.4 Aanbevelingen......................................................................... 6 3 Effectiviteit ultrageluid op algen in continue, recirculerende cultuur .... 7 3.1 Resultaten ............................................................................. 7 3.2 Discussie ............................................................................. 10 3.3 Conclusie ............................................................................. 10 3.4 Aanbevelingen....................................................................... 11 4 Effectiviteit ultrageluid op zoöplankton ...................................... 12 4.1 Resultaten ........................................................................... 13 4.2 Discussie ............................................................................. 14 4.3 Conclusie ............................................................................. 14 4.4 Aanbevelingen....................................................................... 15 5 Algemene conclusie .............................................................. 16 6 Algemene aanbevelingen ........................................................ 17 7 Referenties ........................................................................ 18 Bijlage I Werking van de US-apparatuur ................................................. 19 Bijlage II Algenkweek ........................................................................ 22 Bijlage III Zoöplankton kweek ............................................................... 26 Bijlage IV Walne medium .................................................................... 29 Bijlage V Methode en benodigdheden algen in batchcultuur experiment........... 30 Bijlage VI Methode en benodigdheden algen in continue cultuur experiment ...... 31 Bijlage VII Methode en benodigdheden zoöplankton batchcultuur experiment ..... 33 2
1 Inleiding
Vanuit de innovatiekring watertechnologie kwam de vraag of ultrageluid (US)
gebruikt zou kunnen worden voor het selectief afdoden en/of algemene desinfectie
van organismen. Deze techniek zou bijvoorbeeld toepasbaar kunnen zijn in de
aquacultuursector om zoöplankton uit water voor algenkweek te verwijderen (of
inactief maken) en de algen onbeschadigd te laten. Ook is het verminderen van
chemische reinigingen, verminderen van biofouling, etc. een motivatie.
Dit project idee is verder uitgewerkt door de HZ met de betrokken bedrijven, en
resulteerde in een aanvraag voor een RAAK-MKB subsidie. Deze aanvraag is
gehonoreerd en het project loopt van februari 2012 tot en met januari 2014.
Het doel van dit project is te onderzoeken op welke manier en tegen welke kosten
ultrageluid effectief en efficiënt toegepast kan worden als methode om de groei
van micro-organismen in recirculatiewater en in bassins te bestrijden en om
aangroei in leidingen tegen te gaan. Afhankelijk van de toepassing zijn bepaalde
organismen al dan niet gewenst in het watersysteem.
In deze rapportage wordt gekeken naar de effecten van ultrageluid op de alg
Tetraselmis suecica, een veel gebruikte voeder alg in de aquacultuur, en de
zoöplankton Artemia salina, een organisme dat juist model staat voor algen etende
zoöplankton. Voor de algenexperimenten is er onderscheid gemaakt tussen een
batch- en een continue cultuur.
In de rapportage staat de effectiviteit van ultrageluid op Tetraselmis suecica (T.
suecica) in batch cultuur, de effectiviteit van ultrageluid op T. suecica in continue
cultuur en de effectiviteit van ultrageluid op Artemia salina (A. salina). In de
bijlages staan de theoretische werking van het ultrageluid, de specificaties van de
test organisme, kweek methodes, methodes en benodigdheden van experimenten,
etc.
3
2 Effectiviteit ultrageluid op algen in batch cultuur
Algen kunnen in vijvers en meren grote problemen met zich meebrengen, denk
bijvoorbeeld aan blauwalgen. Ook binnen de aquacultuur kunnen algen ongewenst
zijn, bijvoorbeeld bij een kweker van zeewier waar de algen gaan concurreren met
het zeewier om de nutriënten. Om deze problemen tegen te gaan is ultrageluid
mogelijk een optie. US is, doordat er geen
schadelijke chemicaliën etc. worden
gebruikt, constant toe te passen voor het
te behandelen water.
Het doel van dit experiment was inzicht
krijgen in hoeverre de groei van T. suecica
geremd zou worden door gebruik van
ultrageluid. T. suecica is een flagellaat, die
met behulp van vier flagella zich
voortbeweegt in het water. T. suecica
wordt veel gebruikt in de schelpdierkweek.
Figuur 1 - proefopstelling van het experiment
Gedurende het experiment zijn twee verschillende ultrageluid probes getest, een
LG Sonic probe en een probe van Van Antwerpen Milieutechniek (VAM Sonic). Het
experiment is uitgevoerd met een start concentratie van 100.000 cellen per ml in
met 13 liter per aquarium, waarbij de tellingen zijn uitgevoerd met een
Bürkerturk. De duur van het eerste deel van het experiment bedroeg 16 dagen en
bij het tweede deel van het experiment 2 dagen. Voor de uitgebreide methode zie
appendix V. De twee behandelingen zijn vergeleken met een blanco, de blanco is
artificieel zeewater verrijkt met het Walne medium.
In dit hoofdstuk worden de resultaten van het experiment naar de mogelijkheid om
de groei van T. suecica te remmen met behulp van ultrageluid beschreven. Het
betreft hier een experiment in de periode september 2012 – oktober 2012.
2.1
Resultaten
In figuur 2 is de groei van T. suecica weergegeven, zowel de probe van LG Sonic als
de probe van VAM stonden gedurende dit deel van het experiment op programma 2.
4
4
Algen cellen (*10^6/ml)
3,5
3
2,5
Blanco
2
VAM
1,5
LG Sound
1
0,5
0
4‐9
6‐9
8‐9
10‐9
12‐9
14‐9
16‐9
18‐9
20‐9
22‐9
Datum
Figuur 2 - De bereikte cel concentraties van T.suecica in de drie aquaria. Waarbij VAM staat voor het
aquarium waar een ultrasound probe van Van Antwerpen Milieutechniek in zat, LG sonic staat voor het
aquarium met een probe van LG Sonic en de Blanco is het aquarium zonder probe.
Zoals te zien in figuur 2 zijn de T. suecica in ieder aquarium aangeslagen en laten
ze allen een natuurlijk verloop zien zoals in een batch cultuur verwacht mag
worden. Alleen de maximale cel concentraties van de met ultrageluid behandelde
aquaria variëren aanzienlijk in vergelijking met het blanco aquarium. De blanco
bereikt een veel hogere cel concentratie dan de twee aquaria met een ultrageluid
probe erin. Met behulp van de maximale cel concentraties kan de groeiremming
door gebruik van ultrageluid bepaald worden. De groeiremming bedraagt in het
geval van VAM 60% ten opzichte van de blanco. In het geval van LG Sonic is de
groeiremming 65% ten opzichte van de blanco.
Het volgende figuur laat de cel concentraties van de drie aquaria zien wanneer de
LG Sonic is uitgezet en de VAM Sonic op programma 4 (maximaal vermogen) is
gezet.
3,5
Algen cellen (*10^6/ml)
3
2,5
2
Blanco
1,5
VAM
1
LG Sound
0,5
0
08‐okt
09‐okt
09‐okt
10‐okt
10‐okt
11‐okt
11‐okt
Datum
5
Figuur 3 - De bereikte cel concentraties van T. suecica in de drie aquaria. Waarbij VAM staat voor het
aquarium waar een ultrasound probe van VAM in zat op de stand boost, LG sonic staat voor het aquarium
met een probe van LG Sonic die uit stond en de Blanco is het aquarium zonder probe.
Opvallend in dit figuur is dat de cel concentraties T. suecica van LG Sonic en de
blanco vrijwel gelijk zijn. Dit betekend dat de probe van LG Sonic geen blijvende
schade aanricht in de algenpopulatie. Zodra de LG Sonic probe verwijderd wordt
bereikt de algencultuur dezelfde concentraties als de blanco. De bereikte cel
concentraties in het aquarium met de probe van VAM is een stuk lager dan de
andere twee aquaria. De hieruit volgende groeiremming bedraagt 40% ten opzichte
van de blanco.
2.2
Discussie
Er is duidelijk een effect van ultrageluid op de groei van T. suecica, deze wordt
namelijk aanzienlijk geremd. Het is nog de vraag of deze zelfde remming ook
gerealiseerd wordt bij andere algensoorten, hiervoor zal vervolgonderzoek meer
inzicht in moeten verschaffen.
Ook is niet duidelijk wat er precies met de algen gebeurt, duidelijk is dat de groei
wordt geremd, maar wanneer de probe wordt verwijderd zal de algencultuur weer
opgroeien tot een zelfde concentratie als de blanco. Dit betekent dat er geen
blijvende schade is bij de algen, maar dat de deling van de cellen wordt geremd
door het ultrageluid.
2.3
Conclusie
Ultrageluid heeft een duidelijk effect op de groei van T. suecica. Bij de probe van
VAM (programma 2) is de groeiremming 60% ten opzichte van de blanco. Door de
probe van LG Sonic (programma 2) is de groeiremming ruim 65%. Ook in het geval
van programma 4 bij de probe van VAM is een remming in de groei te zien, ditmaal
van 40%.
Wanneer de LG Sonic wordt verwijderd, na blootstelling van de US, zal de
algencultuur dezelfde cel concentraties bereiken als de blanco. Het ultrageluid
richt dus geen blijvende schade aan bij de algen.
2.4
Aanbevelingen
Nu bekend is dat de ultrageluid probes effect hebben op de groei van T. suecica op
een kleine schaal, zou dit effect ook op grotere schaal en met een andere
algensoort kunnen worden uitgezocht.
Het is nog onduidelijk dat bij verwijdering van de VAM probe ook de algenpopulatie
zich weer volledig zal herstellen. Herhaling van het experiment, waarbij ook de
VAM probe wordt verwijderd is aan te raden.
6
3 Effectiviteit ultrageluid op algen in continue,
recirculerende cultuur
Om water te kunnen besparen in een productieproces is
recirculatie van water zeer belangrijk. Dit gerecirculeerde water
moet echter wel rein genoeg zijn om geen negatieve effecten
elders in het proces te krijgen. Ultrageluid is, doordat er geen
chemicaliën etc. worden gebruikt, in principe toepasbaar voor
elk type waterstroom. Echter is de effectiviteit op microorganismen grotendeels onbekend.
Het doel van het experiment was om effecten van ultrageluid op
een algenpopulatie (T. suecica) te onderzoeken in een continu
doorstroomd systeem, gebruik makend van een US unit van Van
Antwerpen Milieutechniek (VAM Sonic). Het experiment is
driemaal uitgevoerd.
Figuur 4 Verbeterde opstelling
experiment
algenkweek met
recirculatie
Het experiment is uitgevoerd met een start concentratie van +/- 220.000 cellen per
ml met +/- 40 liter per buiskolom, waarbij de tellingen zijn uitgevoerd met een
Bürkerturk. De recirculatie snelheid bedroeg 4 liter/minuut. De duur van het
eerste experiment bedroeg 32 dagen, bij het tweede experiment 29 dagen en bij
het derde experiment 37 dagen. Voor de uitgebreide methode zie appendix VI.
3.1
Resultaten
De resultaten en analyse zullen per experiment worden behandeld.
Experiment 1
In figuur 5 is de grafiek weergegeven met de algen tellingen, waarbij de blanco
(blauw) en de VAM (rood) zijn weergegeven.
7
Figuur 5 - Resultaten algentelling continue doorstroming exp.1
De behandelde algenpopulatie (VAM) laat een duidelijke stijging zien aan het einde
van de periode, terwijl de blanco om onbekende redenen “instort”. Doordat de
blanco populatie ingestort is, geeft deze geen goede referentie meer.
Experiment 2
In figuur 6 is de grafiek weergegeven met de algen tellingen, waarbij de blanco
(blauw) en de VAM (rood) zijn weergegeven.
Figuur 6 - Resultaten algentelling continue doorstroming exp.2
Het tweede experiment gaf een kleine afname van de algenconcentratie in de
behandelde (VAM) opstelling in vergelijking met de blanco opstelling. De abrupte
daling in de blanco populatie is mogelijk het gevolg van een verkeerde telling.
Beide zijn echter wel aan het einde van het experiment ingestort.
Experiment 3
In figuur 7 is de grafiek met de algentellingen weergegeven, waarbij de blanco
(blauw) en de behandelde met VAM (rood) zijn weergegeven.
8
Figuur 7 - Resultaten algentelling continue doorstroming exp.3
In de grafiek is te zien dat de algenconcentratie in de blanco is ingestort. Dit is ook
al eerder in het eerste experiment gebeurd. De behandelde algenpopulatie lijkt
geen hinder te ondervinden van de US unit.
In het onderstaande figuur staat per populatie de drie absorptie spectrofotometer
metingen geïllustreerd van het derde experiment.
Figuur 8 - Absorptie spectrofotometer 450, 680 en 880 µm
De trends in figuur 8 geven aan dat de blanco populatie niet meer tot fotosynthese
in staat was en dat de behandelde populatie geen remming ondervond.
9
3.2
Discussie
De discussiepunten van het voorgaande experiment zijn verwerkt in de methode
en/of de experiment opstelling in het erop volgende experiment.
Eerste experiment
 De blanco populatie is aan het einde van
experiment ingestort.
 Enkel de algentellingen met de Bürker-Türk
telkamer zijn dagelijks uitgevoerd.
 Bij de reiniging van de buiskolommen is te zien dat
de zijde van de buiskolom aan de kant van de tl
buis begroeid is met T. suecica (fig. 9).
Figuur 9 - Biofilm in continu
Mogelijkerwijs is de verklaring voor de lage
doorstroomde opstelling (VAM
tellingen in de blanco buiskolom dat de algen niet rechts, blanco links).
meer in de gesuspendeerde fase aanwezig waren,
maar aan de buiskolom zijn gaan plakken. T.suecica kan plakken bij de
voortplanting of bij stress. De stress kan o.a. worden veroorzaakt bij te hoge
turbulentie, verdwijnen van voedingstoffen, etc. In de opstelling is het mogelijk
dat het opraken van voedingstoffen de stress heeft veroorzaakt. Wel geven deze
resultaten mogelijkheden voor andere toepassingen van US, zoals het voorkomen
van biofilm met US.
Tweede experiment
 Dit resultaat is tegengesteld aan de resultaten
verkregen in het voorgaande experiment.
 pH metingen zijn niet bruikbaar door de
onbetrouwbaarheid van de pH meter.
 Absorptie en coulter metingen zijn onvoldoende
bemonsterd om bruikbaar te zijn.
Derde experiment
 De blanco populatie is aan het einde van het
experiment ingestort.
 Bij inspectie van de buizen is bij de blanco
aanslag te zien die bij de VAM opstelling niet
aanwezig was (fig.10). De behandelde buizen
bleven totaal schoon. Echter is dit in mindere
mate zichtbaar als bij het eerste experiment.
Besmetting zou een mogelijke oorzaak kunnen
zijn in de blanco, zoöplankton werd echter niet
waargenomen bij de genomen monsters.
3.3
Figuur 10 - Begroeiing op buiskolommen
van blanco opstelling
Conclusie
De behandelde T. suecica populatie lijkt in twee van de drie experimenten geen
hinder te ondervinden van de US unit. De blanco populatie stortte in deze gevallen
in. Wel was bij deze experimenten veel aangroei (van T. suecica) in de blanco buis
te zien, wat bij de behandelde opstelling niet te zien was. Mogelijk voorkwam de
10
US unit dat de T. suecica zich kon/ wilde hechten. Het tweede experiment liet een
ander resultaat zien. Hier verdween T. suecica in de behandelde populatie eerder
en bleef in de blanco langer goed. Wel stortte aan het eind van het experiment
beide populaties in. Er was in het tweede experiment geen begroeiing in zowel de
behandelde als de onbehandelde opstelling aangetroffen.
Met de gevonden resultaten is nog geen sluitende conclusie te geven over het
effect van US op een gerecirculeerde T. suecica algenpopulatie.
3.4
Aanbevelingen
Herhaling van het experiment is noodzakelijk, aangezien geen duidelijk is
verkregen of T. suecica effect ondervindt van de US unit. Gebruikmaken van een
niet “plakkende” algensoort zou de stabiliteit van de experimenten vergroten.
11
4 Effectiviteit ultrageluid op zoöplankton
Binnen de aquacultuur speelt schelpdierteelt een grote rol.
De laatste jaren wordt gekeken naar de mogelijkheden om
schelpdieren binnendijks te kweken. Om schelpdieren te
kweken moeten ze gevoerd worden, hiervoor worden algen
gebruikt. Deze algen worden gekweekt in aparte bassins en
vervolgens gevoerd aan de schelpdieren. Funest voor de
schelpdierkweker is besmetting in het algenbassin door
zoöplankton, die ook de algen eten. Ultrageluid kan, mits het
de zoöplankton doodt en de algen in leven laat, een grote rol
gaan spelen in het besmettingsvrij houden van de bassins.
Figuur 11 – A. Salina
In rijkswateren echter, waar algenbloei jaarlijks
problematisch is, zou het in leven laten van zoöplankton om de biodiversiteit niet
te schaden en het beperken van algengroei met ultrageluid nieuwe mogelijkheden
bieden. Uiteraard heeft beperking van de algengroei ook gevolgen voor de
populatie zoöplankton.
Gedurende het experiment is de zoöplankton A. salina gebruikt, A. salina is een
kreeftachtige soort die veel gebruikt wordt als voer voor vislarven in de
aquacultuur. De soort komt in de natuur veel voor in zoute meren.
Aquarium 1 T. suecica + A. salina + VAM Aquarium 2 T. suecica + A. salina Aquarium 3 T. suecica + A. salina + LG Sonic Aquarium 4 T. suecica Figuur 12 Schematische tekening opstelling
In dit hoofdstuk worden de resultaten van het experiment naar de mogelijkheid om
A. salina (figuur 11) te bestrijden met behulp van ultrageluid beschreven. Het
betreft hier het experiment in de periode januari-februari 2013.
Gedurende het eerste semester van 2012
heeft de student Frank Herrewijn
onderzoek gedaan naar het effect van
ultrageluid op zoöplankton1. De conclusie
uit het onderzoek van Frank is dat de VAMSonic de A. salina doodt en dat de LG Sonic
niets doet bij de A. salina. Dit onderzoek
dient om de resultaten van het eerdere
onderzoek te verifiëren.
Figuur 13 – Proefopstelling experiment A. salina
1
Desinfectie van kweekwater door middel van ultrageluid. Onderzoeksrapport HZ minor naar de
invloed van laag energetisch ultrasoon geluid op de overleving van zoöplankton in een
kweekmedium, oktober 2012 (F. Herrewijn)
12
Het experiment is uitgevoerd met een start concentratie van +/- 75 A. salina per
50 ml met 13 liter per aquaria, waarbij de T. suecica tellingen zijn uitgevoerd met
een Bürkerturk en de A. salina zijn geteld door deze te zeven en te tellen met een
binoculair. De duur van het experiment bedroeg 15 dagen. Voor de uitgebreide
methode zie appendix VII.
Gedurende het experiment zijn twee verschillende ultrageluid probes getest, een
probe van LG Sonic en een probe van Van Antwerpen Milieutechniek(VAM). De twee
behandelingen zijn vergeleken met een blanco.
4.1
Resultaten
In figuur 14 is de groei van de populatie T. suecica in de vier de aquaria
weergegeven.
Algen cellen (*10^6/ml)
3,5
3
2,5
Tetraselmis + Artemia + VAM
2
Tetraselmis + Artemia
1,5
1
Tetraselmis + Artemia +
LGSound
0,5
Tetraselmis
04‐feb
03‐feb
02‐feb
01‐feb
31‐jan
30‐jan
29‐jan
28‐jan
27‐jan
26‐jan
25‐jan
24‐jan
23‐jan
0
Datum
Figuur 14 - De bereikte cel concentraties van T. suecica in de vier aquaria.
Zoals te zien in figuur 14 neemt het aantal algen bij de aquaria T. suecica + A.
salina + VAM en T. suecica toe en bij de aquaria T. suecica + A. salina en T. suecica
+ A. salina + LG Sonic af. De oorzaak van de afname van de T. suecica in de aquaria
is de begrazing van A. salina op de algen. Hoe meer A. salina aanwezig is in het
aquarium hoe hoger de afname van T. suecica is. Figuur 15 laat het verloop van het
aantal A. salina per 50 ml over tijd zien voor de drie aquaria.
13
80
Artemia salina / 50 ml
70
60
50
Tetraselmis + Artemia + VAM
40
30
Tetraselmis + Artemia
20
Tetraselmis + Artemia +
LGSound
10
04‐feb
03‐feb
02‐feb
01‐feb
31‐jan
30‐jan
29‐jan
28‐jan
27‐jan
26‐jan
25‐jan
24‐jan
23‐jan
0
Datum
Figuur 15 - Aantal A. salina per 50 ml in de verschillende aquaria.
Opvallend is dat het aantal A. salina in het aquarium met de probe van VAM sterk
afneemt tot vrijwel nul en dat het aantal A. salina in de andere twee aquaria gelijk
blijft. Na 6 dagen is ruim 95 procent van de A. salina gedood in het aquarium met
de VAM probe. Het figuur laat duidelijk zien dat de probe van VAM de A. salina
doodt en dat de probe van LG Sonic niets bij de A. salina doet. Bovenstaand figuur
is verwant aan figuur 14, bij de aanwezigheid van veel A. salina zal de concentratie
T. suecica afnemen door begrazing en wanneer er weinig tot geen A. salina in het
water zit zal de algen concentratie toenemen.
4.2
Discussie
De afname van A. salina aan het einde van de proef bij de aquaria T. suecica + A.
salina en T. suecica + A. salina + LG Sonic komt vermoedelijk door een gebrek aan
T. suecica (voer) waardoor een deel van de A. salina dood ging.
De oorzaak dat het aantal A. salina op 23 en 24 januari zo laag was komt door de
meetmethode. Een deel van het water (50 ml) is gezeefd en het aantal A. salina
dat achter bleef is geteld. Gedurende de eerste dagen waren de A. salina zo klein
dat een deel van de A. salina door de zeef ging. Vermoedelijk was het aantal A.
salina op 23 en 24 januari rond de 70 individuen per 50 ml.
De concentratie van T. suecica aan het begin van de proef varieert per aquarium.
Oorzaak hiervan is dat de T. suecica zijn opgekweekt in de verschillende aquaria en
niet ieder aquarium even veel licht ter beschikking had. Verwacht wordt dat de
verschillende startconcentraties geen effect heeft op de resultaten.
4.3
Conclusie
Het effect van ultrageluid op A. salina hangt af van de probe die gebruikt word. Er
is een duidelijk verschil tussen de probe van VAM en de probe van LG Sonic. De
probe van VAM doodt de A. salina binnen 6 dagen ruim 95 procent van de
aanwezige A. salina in het aquarium en de probe van LG Sonic heeft geen effect op
de A. salina.
14
4.4
Aanbevelingen
De resultaten van dit experiment zijn vergelijkbaar met de resultaten van het
onderzoek van Frank Herrewijn. Een aanbeveling is om in een vervolg experiment
een fijnere zeef te gebruiken bij de tellingen van de A. salina. Een andere
aanbeveling is om de proef op grotere schaal te herhalen.
15
5 Algemene conclusie
Uit de experimenten kunnen de volgende conclusies worden getrokken.
Batch cultuur (Tetraselmis suecica):
 Het effect van US met de VAM (programma 2) is 60% groeiremming en de van LG
Sonic (programma 2) 65% ten opzichte van de onbehandelde populatie.  Het effect van US met de VAM (programma 4) 40% groeiremming ten opzichte
van de onbehandelde populatie.  Bij verwijdering van de LG Sonic probe hersteld de populatie zich tot dezelfde
concentratie als de onbehandelde populatie. Continue doorstroming (Tetraselmis suecica):
 T. suecica plakt bij stress, en is hierdoor geen geschikte algensoort voor
experimenten in continue doorstroming.
 In de opstelling met US heeft de T. suecica zich niet aangehecht aan de wanden
etc. wel in de blanco opstelling bij het instorten van de populatie.
 Met de resultaten is nog geen conclusie over het effect van US op een
gerecirculeerde T. suecica algen populatie te geven.
Batch cultuur (Artemia salina):
 De probe van VAM (programma 2) doodt binnen 6 dagen ruim 95% van de
aanwezige A. salina in het aquarium.
 De probe van LG Sonic heeft geen effect op de A. Salina.
16
6 Algemene aanbevelingen
Uit de experimenten kunnen de volgende aanbevelingen worden gegeven.
Batch cultuur (Tetraselmis suecica):
 Herhaling van het experiment, waarbij ook de VAM probe wordt verwijderd is
aan te raden.  Opschalen van aquaria naar een groter volume (+/- 2m3) om richting praktijk te
komen.  Andere algensoort gebruiken om te onderzoeken of de effectiviteit
overeenkomt. Continue doorstroming (Tetraselmis suecica):
 Herhaling van experiment met een niet “plakkende” algensoort.  Meer verversing van medium. Batch cultuur (Artemia salina):
 Tellingen van A. salina met een fijnere zeef uitvoeren.
 De proef op grotere schaal herhalen.
17
7 Referenties
[1] Herrewijn, F. Desinfectie van kweekwater door middel van ultrageluid.
Onderzoeksrapport HZ minor naar de invloed van laag energetisch ultrasoon geluid
op de overleving van zoöplankton in een kweekmedium, oktober 2012. Vlissingen:
HZ University of Applied Sciences.
[2] http://www.wavelet.org/tutorial/whistory.htm
[3] Antoniadis, Poulios, Nikolakaki, Mantzavinos, 1993. Elzevier “Sonochemical
disinfection of municipal wastewater”
[4] Blackwell publishing. Handbook of microalgal culture. 2004, tabel 19.1.
[5] Mojtaba Azma1, Rosfarizan Mohamad1, Raha Abdul Rahim2 and Arbakariya B.
Ariff*,1. Improved Protocol for the Preparation of Tetraselmis suecica Axenic
Culture and Adaptation to Heterotrophic Cultivation. 2010. Serdang, Selangor,
Malaysia: Universiti Putra Malaysia.
(http://www.benthamscience.com/open/tobiotj/articles/V004/36TOBIOTJ.pdf)
[6] Laing I. Cultivation of marine unicellular algae. 1991. MAFF Laboratory Leaflet
Number 67:31
(http://www.cefas.co.uk/publications/lableaflets/lableaflet67.pdf)
[7] Hiele, T. van der, 2012, protocol voor het kweken zoetwateralgen
[8] Bengtson. 1991. Use of Artemia as a food source for aquaculture. Artemia
biology, 255-285.
[9] Grzimek, B. 1972. Grzimek's Animal Life Encyclopedia, Vol. 1 "Lower Animals".
New York: Van Nostrand Reinhold Co..
[10] Pennak, R. 1989. Fresh-Water Invertebrates of the United States. Canada:
John Wiley and Sons, Inc..
[11] Banister, K. 1985. Encyclopedia of Aquatic Life. New York: Facts on File, Inc..
[12] Najarian, H. 1976. Sex Lives of Animals Without Backbones. New York: Charles
Scribner's Sons.
[13] Captain's Universe, 1996. "Artemia salina, Saltwater Brine Shrimp" (On-line).
Accessed (Date Unknown) at http://www.captain.at/artemia/index.php?p=1.
18
Bijlage I Werking van de US-apparatuur
De gebruikte US-units zijn geleverd door twee verschillende bedrijven. Het eerste
bedrijf is Van Antwerpen Milieutechniek (VAM), een bedrijf dat zich richt op
afvalwaterbehandeling en slibontwatering. VAM wil haar US-unit (VAM-Sonic)
implementeren in combinatie met andere zuiveringstechnieken. Het tweede bedrijf
is LG Sound. Dit is een kleiner bedrijf dat gespecialiseerd is in het bestrijden van
organismen, met name algen en wieren d.m.v. US. Zij leveren de LG-Sonic in dit
project.
De apparatuur bestaat uit een signaalgenerator met geïntegreerde versterker en
een transducer/probe. De generator zet de elektrische energie om naar pulsen die
in de probe wordt omgezet naar trillingen (geluid). De versterker verhoogt enkel de
intensiteit van het geluid en wijzigt niet de frequentie. De frequentie is hoe vaak
een bepaalde gebeurtenis in de tijd voorkomt (bijv. een enkele trilling). Dit is te
berekenen door de volgende formule.
f = 1/T
f= frequentie
T= trillingstijd
Figuur 16 - Frequentie/amplitude voorbeeld
Bij een kortere trillingstijd wordt de frequentie hoger. Een transducer heeft een
bepaald frequentiebereik waarin deze het meest optimaal presteert. Dit bereik kan
vrij breed zijn, waardoor de transducer wel alle frequenties in het bereik aankan,
maar geen evenredige intensiteit kan leveren. Bij een transducer die meer
gespecialiseerd is (een kleiner frequentiebereik) kan de intensiteit beter verdeeld
blijven. Hierdoor zullen er minder intensiteitspieken zijn. Door meerdere
gespecialiseerde transducers samen te brengen is het mogelijk om over het gehele
frequentie bereik een vrij evenredige intensiteit te leveren. Een teveel aan
intensiteit heeft als gevolg dat de efficiëntie daalt en dat er dus energie wordt
verspild.
Door een transducer kan een enkele frequentie of een frequentiespectrum worden
uitgezonden. Met een hydrofoon wordt de geluidsdruk in het water gemeten als
functie van de tijd en hieruit zijn zowel de intensiteit als de frequentie te
berekenen. Tussen frequenties kunnen verschillen in intensiteit zitten.
19
Figuur 17 - Voorbeeld van twee tijdsignalen
In het bovenstaande figuur staat een voorbeeld van twee tijdsignalen (blauw en
rood). Daarbij is de amplitude uitgezet tegen de tijd. Deze grafiek in het
tijdsdomein kan met Fourier transformatie worden omgezet naar een power
spectrum in het frequentiedomein (Fig. 18).2 De amplitude is uitgezet tegen de
frequentie, zodat te zien is dat de hoogte van de amplitude afhankelijk is van de
frequentie.
Figuur 18 - Voorbeeld van twee power spectra
In figuur 18 is een power spectrum weergegeven waarbij er een gelijke intensiteit
wordt geleverd door de transducer bij enkel de frequentiepieken. Hier is een piek
bij 50 kHz en een piek bij rond de 120 Hz te zien. Bij deze pieken is de amplitude
zeer hoog.
De pieken in figuur 18 worden eigenfrequenties genoemd. Bij deze frequenties is
de weerstand tegen de trilling (de impedantie Z) zeer laag. De geïnverteerde van
de impedantie wordt admittantie genoemd (Y = 1/Z), zodat eigenfrequenties
plaatsvinden bij pieken in de admittantie. Bij een lage admittantie is het
energieverbruik voor het behalen van een zelfde (geluids) amplitude dus hoog.
In onderzoek met US wordt vaak gebruik gemaakt van cavitatie. Bij cavitatie gaan
hele kleine luchtbelletjes resoneren totdat de trillingsamplitude zo groot wordt dat
ze imploderen. Tijdens deze implosie ontstaat er lokaal voor een korte periode een
heel hoge druk, een hele hoge tempratuur en de vorming van radicalen in het
2
Fig. 2 en fig. 3 http://www.wavelet.org/tutorial/whistory.htm
20
water 3. Een hypothese is dat deze druk- en temperatuurschok tezamen met het
effect van de radicalen de micro-organismen vernietigt 3.
Een alternatief mechanisme dat desinfectie veroorzaakt wordt resonantie
genoemd, waar minder onderzoek naar is gedaan. Het organisme gaat als het ware
resoneren op de uitgezonden signalen. De organismen scheuren door het
samengeperst en uitgetrokken worden als gevolg van de veranderingen in de
geluidsdruk. Ook kan het zijn dat de overgang van zeewater (medium) naar de cel
een te groot impedantieverschil teweegbrengt en dat de cel uit elkaar wordt
gescheurd door verschillen in voortplantingssnelheid. De exacte reden van het
afsterven van een algen cel door US is zeer lastig te bepalen. In dit project worden
deze mechanismen niet verder onderzocht, hoewel ze voor het effect van US op
micro-organismen wel relevant zijn.
3
Antoniadis, Poulios, Nikolakaki, Mantzavinos, 1993. Elzevier “Sonochemical disinfection of municipal
wastewater”
21
Bijlage II Algenkweek
In dit hoofdstuk staat beschreven wat de specifieke eigenschappen van de
algensoort is met hierbij het opzetten van een stock-kweek voor een algencultuur,
de benodigdheden en de vitaliteitstest.
Specificatie algen soort
De marine flagellaat Tetraselmis suecica (grootte rond de 9 µm) wordt veelal
gebruikt voor voeding in de aquacultuur en met name de schelpdierenkweek. Deze
groene alg kan zichzelf voortbewegen door vier flagellaten aan één zijde van de
algencel. Groene algen komen overal voor en zijn te
vinden in alle soorten oppervlaktewater.
T. suecica wordt voornamelijk gekweekt op Walne
medium 4(bijlage I). Volgens het handboek (3) blijkt
dat Walne medium de beste cultuur T. suecica
oplevert. Bij een pH lager dan 7-6,5 zal de T. suecica
volgens het handboek niet overleven. Volgens het
handboek overleeft deze alg een pH van 8,5 (door
NaOH) ook niet.5 Ander onderzoek geeft aan dat de pH Figuur 19 ‐ Tetraselmis suecica
tussen de 7,8 en 8,0 voor zoutwater algen wenselijk is.6
Om een gezonde populatie te houden is het van belang de verversingsgraad hoog te
houden (10-50% per dag), anders gaat de de kwaliteit van de algen snel achteruit.
De verdubbelingstijd is sterk afhankelijk van de kweekcondities.
Om fotosynthese mogelijk te maken heeft de T. suecica een lichtbron nodig, in de
meeste kweken volstaat een TL-buis (wit fluorescerend licht), en bij een
kamertemperatuur (rond de 20˚C) worden de meeste kweken uitgevoerd. Voor
flagellaten is een zoutconcentratie van 25-30 g/L wenselijk.3
Het walne medium bestaat uit mineralen, vitaminen en nutrieten. De compositie
van het medium staat beschreven in bijlage I Walne medium. De procedure voor de
kweek is beschreven door Tony van der Hiele.7 Dit protocol is bedoeld voor
zoetwateralgen, enkel kan het protocol ook worden gebruikt voor zoutwateralgen
met enkel een verandering in gebruikt medium (Walne medium i.p.v. F2 medium).
Contaminatie
Een proefopstelling met een enkele (algen)cultuur is zeer kwetsbaar. Andere
soorten kunnen bij contaminatie in het medium terecht komen en competitie
aangaan met de gewenste cultuur. Ook is het mogelijk dat zoöplankton in het
medium worden geïntroduceerd en dat de gewenste algensoort predatie
4
(Handbook of microalgal culture, blackwell publishing 2004, tabel 19.1).
Improved Protocol for the Preparation of Tetraselmis suecica Axenic Culture and Adaptation to
Heterotrophic Cultivation (2010)
http://www.benthamscience.com/open/tobiotj/articles/V004/36TOBIOTJ.pdf
6
Laing I (1991) Cultivation of marine unicellular algae. MAFF Laboratory Leaflet Number 67:31
(http://www.cefas.co.uk/publications/lableaflets/lableaflet67.pdf)
7
Hiele, T. van der, 2012, protocol voor het kweken zoetwateralgen
5
22
ondervindt. In al de genoemde situaties levert dit geen betrouwbaar resultaat voor
de experimenten. Het steriel werken wordt bevorderd door het medium in een
autoclaaf te zetten (hoge druk en hoge temperatuur) en steriele pipetpunten te
gebruiken. Ook het gebruikt van chloor bij het reinigen van luchtbuizen etc. en
ethanol voor reiniging van de werkplek voorkomt contaminatie.
Om contaminatie te voorkomen is er gewerkt met het protocol dat door Tony van
der Hiele is gemaakt en dat bovenstaande voorzorgsmaatregelen heeft verwerkt.
Hierin staat duidelijk beschreven welke stappen er genomen moeten worden zodat
er geen contaminatie ontstaat en met welke benodigdheden dit kan worden
bereikt. De stock-kweek is in duplo opgezet, zodat als er één van de kweken
gecontamineerd is dit niet zal leiden tot vertraging van de experimenten.
Benodigdheden voor de kweek
Om een algenkweek op te zetten is het van belang dat er gekeken wordt naar het
doel van de kweek. Voor de stock-kweek kan het efficiëntst gewerkt worden met
een batch kweek.
Voor de kweek is de volgende apparatuur nodig:
 Ent materiaal (T. suecica)
 Lichtbron (TL-buis, wit fluorescerend licht)
 Walne medium
 Zoutwater met een saliniteit van +/- 30 g/L. 4
 Bürker-Türk telkamer
 Autoclaaf
 Erlenmeyers 500 ml
 Erlenmeyers 1L
 Erlenmeyers 2L
 Erlenmeyers 5L
 Steriel pipetten
 Instelbare doseringspipet + pipetpuntjes
 CO2 bron
 Formaldehyde
 Chloor
 Ethanol
 Gasbrander
 Watten
 Aluminium folie
Methode stock-kweek
De reincultuur waarmee de stock van T. suecica wordt opgezet is afkomstig van
Stichting Zeeschelp, die voldoende ent materiaal heeft en ook projectpartner is.
Om algen te kunnen kweken worden deze vanuit een bestaande stock-kweek geënt
in een schone erlenmeyer (met medium). Het kan enkele dagen tot weken duren
voordat de populatie de stationaire fase heeft bereikt (fig. 22). Dit is ook sterk
23
afhankelijk van de lichtintensiteit (hoeveelheid fotonen voor fotosynthese) die
aanwezig is. De verhouding van algen stockoplossing met nieuw medium is
ongeveer 1:10.
Indien de stock kweek dezelfde concentratie heeft als de vorige stockoplossing zal
de oplossing (<1,5 miljoen algen cellen/ml) worden geënt in een nieuwe
erlenmeyer (met medium). Om voor de kweek voldoende licht te garanderen zullen
de erlenmeyer worden geplaatst bij een tl-buis. De CO2 is in het medium voldoende
aanwezig d.m.v. diffusie.3
Figuur 20 - Fasen in de algen kweek
Als de afstervingsfase bereikt is, zijn de algen onbruikbaar en kunnen deze ook niet
verder gekweekt worden. In de experimenten wordt er doorgekweekt tot de
stationaire fase.
In het experiment is het mogelijk om met een batch cultuur te werken of om een
vast percentage per 2-3 dagen te oogsten en dit direct te vervangen (handmatig)
met nieuw medium. Dit is een semi-continue algen kweek. Het voordeel van deze
kweek methode is dat er vrijwel altijd voldoende algen aanwezig zijn in het
medium (log fase/ begin stationaire fase) en dat de proeven op bijna elke
gewenste dag kunnen worden uitgevoerd. Het nadeel echter is een grotere kans op
contaminatie en verhoogde arbeidsintensiteit.
Bepaling van destructie van de algen cellen
Om met zekerheid te kunnen vaststellen dat een algencel levend, niet
reproducerend of dood is, kan er gewerkt worden met de volgende methodes. Ook
als de alg niet meer kan reproduceren of dit (te) langzaam gaat kan het leiden tot
het verwijderen van de algen populatie.
 Voor T.suecica is de levend/dood verhouding gemakkelijk te bepalen doordat
deze soort een flagellaat is. Vooraf aan de proef zijn alle bewegingsloze (dode)
algen cellen geteld. Hierna zal formaldehyde worden toegevoegd, waardoor
alle algen worden gedood. Het totaal aantal cellen is op deze manier te tellen,
en kan de hoeveelheid dode algen cellen van het totaal worden afgetrokken
waardoor de hoeveelheid levende cellen overblijft. Na de behandeling met US
24
kan de hoeveelheid dode cellen worden bepaald. Deze kan worden afgetrokken
van het totaal, waardoor de hoeveelheid levende cellen bekend is.
 Met een spectrofotometer meet je in hoeverre verschillende kleuren licht door
een oplossing (algenpopulatie) worden geabsorbeerd of doorgelaten. De
kleuren licht die door een oplossing worden geabsorbeerd of doorgelaten zijn
een maat voor de concentratie van die oplossing en kenmerkend voor de
bepaalde algensoort. De activiteit en de dichtheid van de algenpopulatie is
hiermee te bepalen.
 Een coulter counter bepaalt de hoeveelheid en de grote van de deeltjes in een
oplossing door deze langs een sensor te leiden, die de verstoring van het
signaal doorberekend. Aangezien de gebruikte populatie monoculturen zijn,
kan deze methode worden toegepast.
 Door dagelijks het totaal aantal aan T. suecica te analyseren kan er worden
bepaald in welke fase de populatie zich bevind en of er remming m.b.t. de
groei is/ afname van de concentratie in de populatie.
In alle beschreven experimenten in de rapportage is er van de laatste methode
gebruik gemaakt.
25
Bijlage III Zoöplankton kweek
In dit hoofdstuk staat beschreven wat de specifieke eigenschappen van de Artemia
salina is met hierbij het opzetten van een zoöplankton cultuur, de benodigdheden
en de vitaliteitstest.
Specificatie zoöplankton
Artemia salina, ook wel pekelkreeft genoemd, is een
kreeftachtige soort die veel gebruikt wordt als voer voor
vislarven in de aquacultuur8. A. salina komt voor in
binnenlandse zoutwaterlichamen over de hele wereld 9,10.
A. salina hebben een opmerkelijke weerstand tegen
veranderingen en kunnen leven in een grote variëteit van
saliniteit. Ze komen voor in wateren met een saliniteit zoals
in zee (2.9-3.5%) en zoutwater meren als de Great Salt
Lake(25-35%). Ze tolereren zelfs zoutconcentraties tot 50%.
Ook de temperatuur van het water waar A. salina voorkomt
varieert behoorlijk, van 6 tot 37 ˚C met een optimale
voortplanting temperatuur van rond de 25 ˚C.
Figuur 21 - Artemia salina
Een volwassen A. salina is gemiddeld 8-10 mm lang, maar dat kan oplopen tot 15
mm afhankelijk van zijn leefomgeving. Ze hebben een langwerpig lichaam dat is
opgedeeld in ten minste 20 segmenten en aan de romp zitten ongeveer 10 paar
platte bladachtige aanhangsels genaamd phyllopodia die pulseren in een regelmatig
ritme. De volwassenen kunnen wit, roze, groen of transparant zijn, afhankelijk van
de leefomgeving en leven meestal een paar maanden. Ze hebben samengestelde
ogen op steeltjes en beperkte monddelen.
A. salina behoort tot de orde Anostroca, wat letterlijk "geen schild" betekent. De
subklasse Brachiopoda betekent letterlijk "kieuw voet", verwijzend naar het feit
dat de kieuwen aan de buitenkant zitten11,12.
Een A. salina doet er ongeveer een week over om uit een nauplius larve volwassen
te worden en leeft dan voor enkele maanden en kan om de vier dagen tot 300
nieuwe nauplii reproduceren. 11, 12, 13.
Het vreemde aan Artemia salina is dat ze op de kop zwemmen. Dit komt doordat
de A. salina aangetrokken worden door het licht en ze gaan naar het licht toe met
de aanhangsels naar boven gericht.
8
Bengtson. 1991. Use of Artemia as a food source for aquaculture. Artemia biology, 255-285.
Grzimek, B. 1972. Grzimek's Animal Life Encyclopedia, Vol. 1 "Lower Animals". New York: Van
Nostrand Reinhold Co..
10
Pennak, R. 1989. Fresh-Water Invertebrates of the United States. Canada: John Wiley and Sons,
Inc..
11
Banister, K. 1985. Encyclopedia of Aquatic Life. New York: Facts on File, Inc..
12
Najarian, H. 1976. Sex Lives of Animals Without Backbones. New York: Charles Scribner's Sons.
13
Captain's Universe, 1996. "Artemia salina, Saltwater Brine Shrimp" (On-line). Accessed (Date
Unknown) at http://www.captain.at/artemia/index.php?p=1.
9
26
A. salina voedt zich voornamelijk met groenalgen. Ze krijgen voedsel binnen door
het filteren van kleine deeltjes met de fijne slanke stekels op de benen als ze
zwemmen of door begrazing op de bodem door algen van rotsen te schrapen met
snelle bewegingen van hun aanhangsels. (Banister10, 1985; Pennak9, 1989)
A. salina zijn voornamelijk verkrijgbaar als cysten. Dit zijn droge ingekapselde A.
salina die in zeewater dienen te worden uitgebroed. Indien de juiste procedure
wordt gevolgd is een zeer hoog uitkomstpercentage mogelijk.
Benodigdheden voor de kweek
Voor de kweek zijn de volgende apparatuur nodig:
 Maatcilinder (1L)
 Zout water (32 g/L)
 Beluchtingspomp
 Luchtslang
 Aluminiumfolie
 Lamp
 Artemia zeef (100 µm)
 Artemia cysten (6 g/L)
Methode stock kweek
1. Maak in een maatcilinder een oplossing van schoon bron- of leidingwater met
zeezout of A. salina zout in een concentratie van 15-35 gram/liter. Het water
dient een pH-waarde te hebben van 7.5-8.5. Indien de pH-waarde te laag is kan
deze worden verhoogd met behulp van natriumbicarbonaat.
2. De watertemperatuur dient 25 °C tot maximaal 30 °C te zijn. Zorg voor flinke
beluchting van onder uit de maatcilinder. Hiervoor kan gebruik gemaakt worden
van bruissteen. Tevens dient er voldoende licht (2000 lux vlak boven de
maatcilinder) te branden.
3. De A. salina cysten worden toegevoegd in een verhouding variërend tussen 2 en
6 gram/liter. Hierbij dient het water met de cysten door de beluchting flink te
bewegen en rond te wervelen. Dit moet gedurende 24 uur zo blijven. Door de
turbulentie kunnen cysten boven het water aan de rand gaan kleven. Deze rand
dient regelmatig met een beetje water te worden teruggespoeld.
4. Na 24 uur kan de beluchting worden uitgezet. De oranje A. salina zinken
langzaam naar de bodem van de maatcilinder terwijl de lichte, bruine schilletjes
naar de oppervlakte stijgen. Omdat A. salina het licht opzoeken verloopt de
scheiding nog beter indien de lamp boven de maatcilinder wordt uitgezet en een
andere lamp onder de maatcilinder wordt aangedaan.
5. Na 10 min is de scheiding compleet en kunnen de A. salinaworden geoogst. Het
kan prima door de A. salina over te hevelen met een slang. Het oogsten dient te
stoppen voordat de bruine schilletjes meekomen.
6. De A. salina dienen te worden opgevangen in een zeef van 100 µm en met
schoon water te worden gereinigd. Kleine schaaltjes, eiwitten en dergelijke
worden dan verwijderd. Dit komt de kwaliteit van A. salina ten goede.
27
Bepaling van het afdoden van Artemia Salina
Om te bepalen hoeveel van de A. salina zijn afgedood wordt er dagelijks het aantal
A. salina in de waterkolom geteld. Met behulp van een volumetrische pipet is 50 ml
monster door een Artemia zeef gepipetteerd. Vervolgens is met behulp van een
binoculair het aantal A. salina, dat achter is gebleven op de zeef, geteld.
Daarnaast wordt de hoeveelheid T. suecica(voer voor A. salina) geteld om te
bepalen in welke mate deze predatie ondervinden. Dit is te vergelijken met een
blanco waar enkel T. suecica zich bevindt.
Deze telling is dagelijks uitgevoerd, vanaf het begin van het experiment tot en met
het einde van het experiment.
28
Bijlage IV
Walne medium
Gemaakt door Tony van der Hiele.
Locatie in opslag
Oplossing
Concentratie Stof
D39B
1,33 g/l FeCl3, 6H2O
0,4
g/l MnCl2, 4H2O
C12
33,6 g/l H3BO3
A71
45,0 g/l EDTA
D16
20,0 g/l NaH2PO4, 2H2O
C70
100,0 g/l NaNO3
L020 Ox3-8a
1,0
ml Solution B
Van deze oplossing 1 ml/l toevoegen aan zeewater doe dit voor het autoclaveren of
chloreren
A
Concentratie Stof
2,1
g/100ml ZnCl2
2,0
g/100ml CoCl2, 6H2O
0,9
g/100ml (NH4)6Mo7O24,
4H2O
2,0
g/100ml CuSO4, 5H2O
10,0 ml geconcentreerd HCL
Van deze oplossing 1,0 ml toevoegen aan oplossing A
Locatie in opslag
D53
L020 Gif 2-03
A26
Oplossing
Locatie in opslag
L018 koelkast 7-3D
Oplossing
B
C
Concentratie Stof
0,2 g/200ml Vitamine B1
25,0 ml Solution E
B113
Vraag Mitra
Van deze oplossing 0,1 ml/l toevoegen aan geautoclaveerd of gechloreerd zout
water
Oplossing
D
Concentratie Stof
53,58 g/l Natrium
Methylsilicaat (Na2SiO3, 5H2O)
Locatie in opslag
C52A
Van deze oplossing 2 ml/l toevoegen aan zeewater met oplossing A doe dit voor het
autoclaveren of chloreren.
Oplossing
E
Concentratie Stof
0,1
g/250ml Vitamine B12
Locatie in opslag
L018 koelkast 1-A3C
Van deze oplossing 25 ml toevoegen aan oplossing C
29
Bijlage V
Methode en benodigdheden algen in
batchcultuur experiment
Methode
Het experiment heeft plaatsgevonden in drie aquaria, waarin 13 liter zoutwater
(artificieel zoutwater, 32 g/l zout) verrijkt met het Walne medium (bijlage 3) zat,
een aquarium voor de blanco, een aquarium voor LG Sonic en een aquarium voor
VAM Sonic. De probe van LG Sonic stond op programma 2 evenals de probe van
VAM. Voor gebruik is het water geautoclaveerd om besmetting te voorkomen. De
drie aquaria zijn geënt met algen uit een stockcultuur, dit was een monocultuur.
De beginconcentratie van het experiment was 100.000 cellen per ml. De aquaria
zijn continu belicht en belucht. Dagelijks zijn de algen geteld met behulp van een
Bürker-Türk telkamer.
Nadat de algen de stationaire fase hebben bereikt is de probe van LG Sonic
uitgezet en is de VAM-Sonic op programma 4 gezet (de hoogste intensiteit) en
wederom zijn de algen geteld met behulp van een Bürker-Türk telkamer.
Benodigdheden
Voor het experiment zullen de volgende materialen nodig zijn:
 3 Grote bakken of aquaria
 Ultrasonic apparatuur (VAM Sonic)
 Ultrasonic apparatuur (LG Sonic)
 Stock oplossing (T. suecica)
 Walne medium
 Bürker-Türk telkamer
 Pipet
 CO2 bron
 Formaldehyde
 Duck tape
 Emmer
30
Bijlage VI
Methode en benodigdheden algen in continue
cultuur experiment
Methode
De algencultuur werd in monocultuur opgekweekt en in de
meest optimale situatie gehouden om zo met zekerheid te
kunnen stellen dat de kwaliteit van de algenpopulatie geen
invloed had op de resultaten van het experiment. De start
concentratie bedroeg gemiddeld 220.000 cellen per ml. Om dit
te bereiken is er gewerkt met het al vastgestelde Walne medium
(voeding algen) die in een autoclaaf is gedesinfecteerd (hoge
druk en hoge temperatuur) waardoor deze ontdaan is van
mogelijke besmetting (levende organismen). Daarnaast werd de
omgevingstemperatuur constant gehouden op 20 ˚C. Voor de
VAM Sonic is er gewerkt met programma 2 in de continue modus Figuur 22 Opstelling eerste
(dit is in te stellen op de VAM Sonic). De lichtverdeling in het
experiment
eerste experiment was afkomstig van twee tl-buizen, die
algenkweek met
recirculatie
verticaal achter de buisreactoren geplaatst waren. In het
tweede en derde experiment is dit verbeterd met een lichtsnoer
dat het licht homogeen verdeelt om de buis. Het volume van de buiskolommen was
+/- 40 L per reactor. Het water werd gemiddeld elke 10 minuten langs de US unit
in de opstelling gepompt. De pomp nam het water onderin de buiskolom in en
bracht dit boven in de buiskolom terug. De monsterpunten zitten na de pomp in de
toevoer naar de opstelling. Van september 2012 tot februari 2013 hebben de
experimenten gelopen.
Het verversen van het medium is in het eerste experiment (start sept./okt. 2012)
staat aangegeven in figuur 10. Van elk monster worden beide rasters van de
Bürker-Türk telkamer gevuld. Beide rasters worden geteld en gemiddeld, waardoor
de betrouwbaarheid van de tellingen vergroot. De verversing bedroeg 25% van het
totale volume van 40 liter.
In het tweede experiment uitgevoerd in oktober 2012 werden de dagelijkse
tellingen gedaan d.m.v. de Bürker-Türk telkamer, de pH en absorptie van de licht
spectra bij 450, 680 en 880 nm voor de bepaling van licht absorptie van,
respectievelijk, chlorofyl a, b en carotenoïden . De verversing van het medium is
aangegeven in figuur 14 en de verversingsgraad bedroeg 25%.
Het derde experiment is gestart in januari 2013 en heeft gelopen tot half februari.
Dagelijkse tellingen werden gedaan d.m.v. de Bürker-Türk telkamer en absorptie
van de licht spectra bij 450, 680 en 880 nm. De verversing van het medium is
aangegeven in figuur 15 en de verversingsgraad bedroeg 25%.
Benodigdheden
 2 Buiskolommen +/- 70 L
 Experiment opstelling
 Pomp (4L / min)
 Ultrasound apparatuur (VAM Sonic)
31















Stock kweek (T. suecica)
Lichtbron (led lichtslang 4,5 m)
Walne medium (A+C)
Zoutwater met een saliniteit van +/- 30 g/L.
Bürker-Türk telkamer
Autoclaaf
Erlenmeyers 3L
Erlenmeyers 5L
Steriel pipetten
Instelbare doseringspipet + pipetpuntjes
CO2 bron
Formaldehyde
Chloor
Duck tape
Emmer
4
32
Bijlage VII
Methode en benodigdheden zoöplankton
batchcultuur experiment
Methode
Het experiment heeft plaatsgevonden in vier aquaria, waarin 13 liter
zoutwater(artificieel zoutwater, 32 g/l zout) verrijkt met het Walne medium
(bijlage 3) zat. Voor gebruik is het water geautoclaveerd om besmetting te
voorkomen. In eerste instantie werd in de vier aquaria de algensoort T. suecica
opgekweekt tot er een hoge cel concentratie was bereikt. De algen dienen als voer
voor de A. salina. Vervolgens zijn 75 A. salina larven per 50 ml toegevoegd aan drie
van de vier aquaria, het vierde aquarium dient als blanco zodat de invloed van de
gezondheid van T. suecica kan worden uitgesloten. Eerder onderzoek heeft
uitgewezen dat 1 á 2 A. salina per ml ideaal is voor dit experiment, van daar dat
gekozen is voor 75 A. salina per 50 ml. Verder is in een aquarium een probe van LG
sonic geplaatst en in een ander aquarium een probe van VAM, de probes stonden
beide op programma 2. Figuur 17 en 18 geven de proefopstelling weer.
De aquaria zijn continu belicht en belucht. Dagelijks is de T. suecica geteld met
behulp van een Bürker-Türk telkamer (bijlage 2) en de A. salina met behulp van
een zeef en een binoculair, 50 ml water uit het aquarium is gezeefd en vervolgens
zijn de aanwezige A. salina geteld met behulp van een binoculair. De proef heeft
12 dagen gelopen.
Benodigdheden
Voor het experiment zullen de volgende materialen nodig zijn:
• 4 Grote bakken of aquaria
• Ultrageluidapparatuur (VAM Sonic)
• Ultrageluid apparatuur (LG Sonic)
• Stock oplossing (T. suecica)
• Gekweekte A. salina
• Zeef maaswijdte 30 µm
• Walne medium
• Bürker-Türk telkamer
• Microscoop
• Pipet
• CO2 bron
• Luchtslang
• Lugol
• Tape
• Emmer
33

Download Report