Lentekriebels 2015.pdf

Coupled Vibrations in Peptides and Proteins: Structural Information Using 2DIR Spectroscopy
A. Huerta Viga
Samenvatting
Het voorspellen van de driedimensionale gevouwen structuur van een eiwit vereist
een gedetailleerd inzicht in de fundamentele krachten die het vouwen van eiwitten
sturen. Het vergaren van deze kennis vormt echter een voortdurende uitdaging binnen verschillende disciplines van de wetenschap. Dit proefschrift beschrijft hoe de
detectie van gekoppelde vibraties met behulp van tweedimensionale infrarood (2DIR) spectroscopie ons in staat stelt de evenwichtsstructuren van eiwitten en peptiden
op moleculair niveau te doorgronden. De informatie die wij op deze manier verkrijgen is essentieel voor een fundamenteel begrip van de principes die ten grondslag
liggen aan de driedimensionale structuur van eiwitten. De grootte van de systemen
die we bestuderen varieert van een dimeer bestaande uit enkele atomen, tot eiwitten
opgebouwd uit enkele honderden atomen. We bestuderen twee verschillende typen
vibraties, namelijk vibraties betrokken bij de vorming van zoutbruggen, en backbone
amide I vibraties. De eerste drie hoofdstukken van dit proefschrift zijn van inleidende aard. In hoofdstuk 1 introduceren we de specifieke structurele eigenschappen van eiwitten, met name de secundaire structuur en tertiaire contacten. Tevens
introduceren we vibrationele spectroscopie, in het bijzonder 2D-IR spectroscopie,
als een robuuste techniek om deze structuur-specifieke kenmerken te ontrafelen.
In hoofdstuk 2 geven we een beschrijving van 2D-IR spectroscopie in het frequentiedomein door gebruik te maken van een IR pump-probe opstelling met een spectraal nauw-bandige pomp en breed-bandige probe puls. Ook bespreken we de essentiële kenmerken die typerend zijn voor een 2D-IR spectrum van twee gekoppelde
oscillatoren. Hoofdstuk 3 bevat een korte samenvatting van de niet-lineaire respons
theorie, gevolgd door een beschrijving van het vibratie-exciton model voor twee en
drie gekoppelde anharmonische oscillatoren. Aan de hand van dit formalisme kunnen we structuur-specifieke informatie verkrijgen op basis van de niet-lineaire respons van een systeem na de interactie met resonante lichtvelden. De volgende zes
hoofdstukken in dit proefschrift beschrijven de uitkomsten van het onderzoek. In
hoofdstuk 4 karakteriseren we de 2D-IR response van een zoutbrug in oplossing.
Zoutbrug-interacties spelen vaak een bepalende rol in de conformationele stabiliteit
van eiwitten, maar het vaststellen van de geometrie van een zoutbrug in oplossing
is tot op heden niet eenvoudig gebleken. We bestuderen een zoutbrug tussen guanidinium (Gdm+ ) en acetaat (Ac− ), en vinden dat als gevolg van zoutbrugvorming
er een koppeling ontstaat tussen de vibrationele modes van Gdm+ en Ac− . Deze
koppeling blijkt direct uit cross-pieken in het 2D-IR spectrum, en uit een kwanti101
tatieve analyse van het 2D-IR spectrum met behulp van het vibratie-exciton model,
kunnen we concluderen dat een zoutbrug een vlakke geometrie heeft. Vervolgens
bestuderen we een zoutbrug tussen methylguanidinium (MeGdm+ ) en Ac− . Analyse van de 2D-IR spectra stelt ons in staat onderscheid te maken tussen twee mogelijke bidentate geometrieën van deze zoutbrug. In hoofdstuk 5 onderzoeken we
de 2D-IR response van een zoutbrug tussen arginine (Arg+ ) en carboxylaat (Glu− )
in verschillende peptiden in oplossing. We bestuderen drie verschillende peptiden
waarvan de structuur wordt gestabiliseerd door een dergelijke zoutbrug: een βturn, een α-helix, en een coiled coil. We vinden dat de veranderingen in het 2DIR spectrum van deze zoutbruggen vergelijkbaar zijn met die van de geïsoleerde
zoutbruggen, wat waarschijnlijk wordt veroorzaakt door de sterische beperkingen
van de zoutbruggende zijgroepen. We vinden bewijs voor de aanwezigheid van
een bidentate zoutbrug in de β-turn, een monodentate in het α-helix-vormende peptide, terwijl het spectrum van de coiled coil de spectrale vingerafdruk van beide
typen zoutbruggen bezit. Hoofdstuk 6 bestudeert de amide I vibraties van twee verschillende tripeptiden. We onderzoeken hoe de conformatie van deze tripeptiden
wordt beïnvloed door de aan- of afwezigheid van een lading op de C-terminus en
zijgroepen. We analyseren de 2D-IR metingen met behulp van het vibratie-exciton
model, en de uitkomst toont ons dat de dihedrale hoeken (φ, ψ) van het centrale
Cα atoom niet significant veranderen. Hoofdstuk 7 bevat onderzoek naar het onderliggende mechanisme van de veranderingen in eiwitstructuur die optreden als
gevolg van chemische denaturatie met guanidinium (Gdm+ ), een veelgebruikt denatureringsmiddel. We bestuderen guanidinium-geïnduceerde denaturatie van αhelices en β-sheets aan de hand van twee bekende eiwitten, namelijk lysozym en αchymotrypsine. We vinden dat het β-sheet motief zijn secondaire structuur volledig
verliest door Gdm+ -denaturatie, terwijl het α-helix-vormende eiwit zijn secundaire
structuur grotendeels behoudt. Deze resultaten suggereren dat Gdm+ β-sheets veel
efficiënter verstoort dan α-helices, mogelijk doordat hydrofobe wisselwerkingen een
belangrijkere rol vervullen bij de formatie van β-sheets. In hoofdstuk 8 gaan we
verder in op het denaturatie-mechanisme van guanidinium. We meten de veranderingen in secundaire structuur van een de novo ontworpen mini-eiwit, een zincfinger mutant. Deze zinc-finger mutant bezit structurele eigenschappen die verschillen van de meeste natuurlijke eiwitten. Onze resultaten laten zien dat de α-helix
wordt gestabiliseerd door hydrofobe interacties, en dat verstoring van de hydrofobe kern van het mini-eiwit leidt tot ontvouwing van de α-helix. We vinden echter
resterende β-sheet structuur, hetgeen suggereert dat dit motief niet wordt gestabiliseerd door hydrofobiciteit, en dat de verstoring van de hydrofobe kern van het
mini-eiwit geen significant effect heeft op de stabiliteit van de β-sheet. In hoofdstuk 9
introduceren we amyloid- en fibrilvorming van eiwit-structuren. We tonen aan dat
de fibrilatie van lysozym kan worden geïnduceerd met een ‘temperatuur-shock’. De
nucleatie van fibrillen treedt waarschijnlijk op nadat de hydrofobe kern van het eiwit als gevolg van thermische denaturatie wordt blootgesteld aan zijn omgeving.
Aan de hand van deze experimenten demonstreren we dat 2D-IR spectroscopie een
geschikte techniek is om fibril-vorming van eiwitten in ‘live’ te volgen.

Download Report