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関節リウマチ感受性遺伝子
FCRL3 (Fc receptor-like3)
の同定
○高地 雄太1,2,山田 亮1,山本 一彦1,2
1理化学研究所遺伝子多型研究センター関節リウマチ関連遺伝子研究チーム
2東京大学大学院医学系研究科アレルギー・リウマチ内科
関節リウマチ(RA)の遺伝性
・家系解析より
一卵性双生児再発危険率 λMZ 12~62
同胞再発危険率
λsib 2~17
・HLA領域
6p21
RAの遺伝素因の30~50%を占める
HLA-DR (shared epitope)との強い関連
・non-HLA遺伝子
複数の遺伝子多型が関与
相対危険率が低いため,同定が困難
non-HLA遺伝子の探索
自己免疫疾患連鎖解析の知見より
候補領域が重複
・複数の疾患
・ヒト・マウス
1q21-23 (human)
共通の遺伝素因
・CTLA4
・CARD15
・SLC22A4/5
・PTPN22
* ヒト・マウスの複数の自己免疫性疾患感受性候補領域を
マウス染色体上にマッピングした (Marrack et al. Nat Med 2001)
候補領域 1q21-23
マウス
CIA(Mcia2)
EAE,TMEVD
(Eae3, Tmevd2)
ヒト
1q21
FcγRI
mCh3
乾癬 (PSORS4)
FCRL1~5
NOD
(Idd10, Idd17)
MS
CD1
SLE
Lupus models
(sle1, swrl1)
1q23
mCh1
FcγRII/III
CD3Z
RA
SNPsを用いたケース・コントロール関連解析
SNPs(1塩基多型 single-nucleotide polymorphisms)
遺伝マーカーとして解像度が高い (300~1000bp間隔)
機能性多型となりうる (アミノ酸変化,プロモーター活性に影響)
ケース・コントロール関連解析
ある遺伝子多型のアレル頻度(もしくはジェノタイプの頻度)が,疾患
群において対照群よりも高いことを検定することにより,疾患感受性
遺伝子多型,もしくはそれと連鎖不平衡にある遺伝子多型の同定を
行う.
連鎖不平衡 linkage disequilibrium (LD)
2つの遺伝子座間で,連鎖があるために,メンデルの独立の法則に
よる平衡から逸脱した状態
連鎖不平衡係数Δ
ハプロタイプ
SNP A – SNP B
1-1
1-2
2-1
2-2
頻度
P11
P12
P21
P22
Δ=|P11P22 - P12P21|÷ (P1・P2・P・1P・2)1/2
連鎖がない場合(異なる染色体に存在) → Δ=0
完全に連鎖している場合
→ Δ=1
連鎖不平衡図を用いた関連解析
Block1
Block2
・全てのSNP対でΔを計算し,値によりグループ化(Δ>0.5)
→LD blockの同定.
・SNP5(marker SNP)で疾患との関連を認めた場合
→同じLD block内のSNP3~6が原因多型である可能性が高い.
対象
・関節リウマチ(RA)
第1群
830人
第2群
540人
・全身性エリテマトーデス(SLE)
564人
・自己免疫性甲状腺炎(AITD)
バセドウ病 351人
橋本病
158人
・対照群
第1群
第2群
第3群
658人
636人
752人
1q21-23領域のSNPs
741 SNPs をJSNP database より抽出
↓
対照群658人をgenotyping
アレル頻度 > 0.1
タイピング成功率 > 0.95
Hardy-Weinberg 検定 P > 0.01
↓
491 SNPs を 連鎖不平衡・関連解析に
1q21-23領域の
連鎖不平衡・関連解析
FCRLs
・1q21-23領域 (16Mb)
491 SNPs
対照群 658人をgenotyping
→ 110 LD block (Δ>0.5)
・患者群 94人をgenotyping
患者・対照群アレル頻度比較
→ 9 SNP に関連 (P<0.01)
・患者群 736人を追加
→ FCRL3のSNPに関連あり
(OR 1.39, P=0.000035)
・FCRL領域
→ 2 LD ブロックを詳細に解析
FCRL領域の関連解析
・FCRL領域のSNPs… 41 SNPs
JSNP…
25 SNPs
新規同定SNPs … 16 SNPs
・関連解析
RA患者群 830人, 対照群 658人
アレル頻度比較
→ FCRL3プロモータ領域に関連のピーク(P<0.0001)
FCRL5 FCRL4 FCRLy4 FCRL3
FCRL2 FCRL1 CD5L
FCRL3多型の関連解析
アレル
SNPsa
ジェノタイプ 11 vs 12+22
(劣性遺伝型式)
アレル1 頻度
ID
位置
1/2
RA患者
対照
OR (95% CI)
c2
P
fcrl3_3
-169
C/T
0.42
0.35
2.15 (1.58-2.93)
24.3
0.00000085
fcrl3_4
-110
A/G
0.25
0.18
3.01 (1.71-5.29)
16.1
0.000060
fcrl3_5
Exon2
C/G
0.42
0.35
2.05 (1.51-2.78)
21.6
0.0000033
fcrl3_6
Intron3
A/G
0.42
0.34
2.02 (1.49-2.75)
20.8
0.0000052
aSNPs
with P<0.0001 in allele frequency comparison test
-169
-110
exon1
exon2
exon3
ATG
fcrl3_3
fcrl3_4
fcrl3_5
fcrl3_6
FCRL3プロモーター活性の評価
・FCRL3 プロモーター配列(SNP;-169C/T,-110A/G)
・ルシフェラーゼ・アッセイにて評価
3ハプロタイプのプロモータ活性の評価(nt -523 ~ +203)
-169C/T 周辺配列のエンハンス活性の評価(nt -189 ~ -160)
-169 C/Tに結合する転写因子 ①
TRANSFACによる予測
-169C/T
CGGGAAGTCC[C/T]T
NFκB consensus motifとの比較
allele
core match
matrix match
-169C
1.000
0.957
-169T
0.760
0.824
-169 C/Tに結合する転写因子 ②
EMSA (ゲルシフト・アッセイ)
・-169C/T周辺配列を用いたEMSA
Raji細胞核タンパクと
-169Cアレルで強い結合(バンドI)
・スーパーシフトアッセイ
抗NFκB 抗体でシフト
(p50,p65,c-Rel)
ジェノタイプ別のFCRL3発現量
健常人末梢血B細胞での発現をTaqMan-PCR法により定量
発現量はRA感受性アレルの数(n = 0,1,2)で有意に回帰された.
(R2 = 0.49,P = 0.0076)
FCRL3多型と遺伝子発現量
組織でのFCRL3発現
TaqMan-PCR法にて定量
RA滑膜でのFCRL3発現
in situ hybridization法
T細胞
B細胞
CD3
CD20
100x
100x
FCRL3
ISH
100x
400x
FCRL3 多型と自己抗体の関連
リウマトイド因子
抗CCP抗体
n
血清抗体価 ±SEM
n
(N=148)
(IU/ml)
(N=71)
陽性率 (%)
-169 C/C
29
479.9 ±91.3a
17
100.0b
-169 C/T
75
323.7 ±47.3a
35
94.3b
-169 T/T
44
216.4 ±44.0a
19
73.7b
ジェノタイプ
a 血清抗体価はRA感受性アレルの数で有意に回帰された (R2=0.049,
bP=0.029
by Fisher's exact test.
P=0.0065).
FCRL3多型(-169 C/T) と
HLA-DRB1ジェノタイプの関連
SE+/+
SE+/-
SE-/-
n=113
n=376
n=215
-169 C/C
32
73
35
-169 C/T
46
177
99
-169 T/T
35
126
81
アレルC頻度
0.49*
0.43
0.39
ジェノタイプ
SE = shared epitope (日本人では DRB1*0405が最多)
* c2 検定で P <0.05 (vs SE-/-).
RA患者(N=704)をHLA-DR shared epitopeのジェノタイプ別に
層別化し,-169Cのアレル頻度を比較した
FCRL3多型( -169C/T)とAITD,SLEの関連
疾患
AITD total
人数
アレルC
頻度
劣性遺伝形式比較
OR (95% CI)
c2
P
509
0.45
1.74 (1.35-2.24)
18.5
0.000017
GD
351
0.46
1.79 (1.34-2.39)
15.7
0.000074
HT
158
0.42
1.62 (1.07-2.47)
5.2
0.022
SLE
564
0.41
1.49 (1.16-1.92)
9.8
0.0017
Controls
2037
0.37
AITD = 自己免疫性甲状腺炎; SLE = 全身性エリテマトーデス; GD = Graves病; HT = 橋本病.
FCRL3
Fc receptor-like 3
・Ⅰ型膜貫通タンパク (734a)
・ 細胞外
6個のIg-like domain
FcγRとの高い相同性
・ 細胞内
4つのTyrosine motif
FCRL3細胞内ドメイン
ITIM
ITAM
Y
Y
ITIM
Syk, ZAP70
tyrosine kinases
or
ITIM
ITIM
Y
SHP-1,SHP-2
tyrosine phosphatases
ITIM
hemi-ITAM
Y
(Xu et al. BBRC 2002)
ITAM ; Immunoreceptor Tyrosine-based Activation Motif
ITIM ; Immunoreceptor Tyrosine-based Inhibition Motif
FCRLsのリンパ組織での発現
Tonsilを用いたin situ hybridization
(Miller et al. Blood 2002)
HE
ISH
Mantle zone
Mantle zone
Light zone
Marginal zone
Light zone
RAにおけるFCRL3の役割(仮説)
まとめ
・FCRL3遺伝子プロモータ領域の多型(-169 C/T)と
複数の自己免疫性疾患感受性との関連を同定した.
・感受性アレルを持つ個人では,遺伝子発現量が増
加しており,また自己抗体産生の増加も認めた.
・FCRL3は,2次リンパ組織および疾患病理組織の
B細胞において発現しており,免疫系における機能
性遺伝子であることが考えられた.
今後の展開
① 自己免疫性疾患の病態解明
FCRL3は自己免疫疾患に普遍的に関与する遺伝子?
B細胞を中心とした自己免疫現象の解明
② 治療法の開発
FCRL3をターゲットにした創薬
③ テイラーメード医療への応用
FCRL3遺伝子多型は疾患の予後予測因子になりうる?
個人の遺伝情報に基づいた治療
謝辞
理化学研究所遺伝子多型研究センター
川上
高橋
角田
関根
大西
中村
弘人
篤
達彦
章博
洋三
祐輔
同・関節リウマチ関連遺伝子研究チーム
鈴木 亜香里
徳廣 臣哉
常 暁天
小林 香子
菅野 栄美
川井田 礼美
駒木根 啓子
山中 美弥子
明前 敬子
RAゲノム検体提供機関
行岡 正雄 (行岡病院)
脇谷 滋之 (信州大学)
當間 重人 (国立相模原病院)
松原 司 (松原メイフラワー病院)
豊島 良太 (鳥取大学医学部)
西岡 雄一 (山梨県立中央病院)
RA滑膜検体提供機関
吉野 愼一 (日本医科大学)
永島 正一 (同上)
SLE,AITDゲノム検体提供機関
笹月
白澤
三森
小池
湯村
大坪
健彦 (国立国際医療センター)
専二 (同上)
明夫 (同上)
隆夫 (北海道大学)
和子 (東京女子医科大学)
茂 (同上)
東京大学大学院医学系研究科
アレルギー・リウマチ内科
沢田 哲治
敬称略