関節リウマチ感受性遺伝子 FCRL3 (Fc receptor-like3) の同定 ○高地 雄太1,2,山田 亮1,山本 一彦1,2 1理化学研究所遺伝子多型研究センター関節リウマチ関連遺伝子研究チーム 2東京大学大学院医学系研究科アレルギー・リウマチ内科 関節リウマチ(RA)の遺伝性 ・家系解析より 一卵性双生児再発危険率 λMZ 12~62 同胞再発危険率 λsib 2~17 ・HLA領域 6p21 RAの遺伝素因の30~50%を占める HLA-DR (shared epitope)との強い関連 ・non-HLA遺伝子 複数の遺伝子多型が関与 相対危険率が低いため,同定が困難 non-HLA遺伝子の探索 自己免疫疾患連鎖解析の知見より 候補領域が重複 ・複数の疾患 ・ヒト・マウス 1q21-23 (human) 共通の遺伝素因 ・CTLA4 ・CARD15 ・SLC22A4/5 ・PTPN22 * ヒト・マウスの複数の自己免疫性疾患感受性候補領域を マウス染色体上にマッピングした (Marrack et al. Nat Med 2001) 候補領域 1q21-23 マウス CIA(Mcia2) EAE,TMEVD (Eae3, Tmevd2) ヒト 1q21 FcγRI mCh3 乾癬 (PSORS4) FCRL1~5 NOD (Idd10, Idd17) MS CD1 SLE Lupus models (sle1, swrl1) 1q23 mCh1 FcγRII/III CD3Z RA SNPsを用いたケース・コントロール関連解析 SNPs(1塩基多型 single-nucleotide polymorphisms) 遺伝マーカーとして解像度が高い (300~1000bp間隔) 機能性多型となりうる (アミノ酸変化,プロモーター活性に影響) ケース・コントロール関連解析 ある遺伝子多型のアレル頻度(もしくはジェノタイプの頻度)が,疾患 群において対照群よりも高いことを検定することにより,疾患感受性 遺伝子多型,もしくはそれと連鎖不平衡にある遺伝子多型の同定を 行う. 連鎖不平衡 linkage disequilibrium (LD) 2つの遺伝子座間で,連鎖があるために,メンデルの独立の法則に よる平衡から逸脱した状態 連鎖不平衡係数Δ ハプロタイプ SNP A – SNP B 1-1 1-2 2-1 2-2 頻度 P11 P12 P21 P22 Δ=|P11P22 - P12P21|÷ (P1・P2・P・1P・2)1/2 連鎖がない場合(異なる染色体に存在) → Δ=0 完全に連鎖している場合 → Δ=1 連鎖不平衡図を用いた関連解析 Block1 Block2 ・全てのSNP対でΔを計算し,値によりグループ化(Δ>0.5) →LD blockの同定. ・SNP5(marker SNP)で疾患との関連を認めた場合 →同じLD block内のSNP3~6が原因多型である可能性が高い. 対象 ・関節リウマチ(RA) 第1群 830人 第2群 540人 ・全身性エリテマトーデス(SLE) 564人 ・自己免疫性甲状腺炎(AITD) バセドウ病 351人 橋本病 158人 ・対照群 第1群 第2群 第3群 658人 636人 752人 1q21-23領域のSNPs 741 SNPs をJSNP database より抽出 ↓ 対照群658人をgenotyping アレル頻度 > 0.1 タイピング成功率 > 0.95 Hardy-Weinberg 検定 P > 0.01 ↓ 491 SNPs を 連鎖不平衡・関連解析に 1q21-23領域の 連鎖不平衡・関連解析 FCRLs ・1q21-23領域 (16Mb) 491 SNPs 対照群 658人をgenotyping → 110 LD block (Δ>0.5) ・患者群 94人をgenotyping 患者・対照群アレル頻度比較 → 9 SNP に関連 (P<0.01) ・患者群 736人を追加 → FCRL3のSNPに関連あり (OR 1.39, P=0.000035) ・FCRL領域 → 2 LD ブロックを詳細に解析 FCRL領域の関連解析 ・FCRL領域のSNPs… 41 SNPs JSNP… 25 SNPs 新規同定SNPs … 16 SNPs ・関連解析 RA患者群 830人, 対照群 658人 アレル頻度比較 → FCRL3プロモータ領域に関連のピーク(P<0.0001) FCRL5 FCRL4 FCRLy4 FCRL3 FCRL2 FCRL1 CD5L FCRL3多型の関連解析 アレル SNPsa ジェノタイプ 11 vs 12+22 (劣性遺伝型式) アレル1 頻度 ID 位置 1/2 RA患者 対照 OR (95% CI) c2 P fcrl3_3 -169 C/T 0.42 0.35 2.15 (1.58-2.93) 24.3 0.00000085 fcrl3_4 -110 A/G 0.25 0.18 3.01 (1.71-5.29) 16.1 0.000060 fcrl3_5 Exon2 C/G 0.42 0.35 2.05 (1.51-2.78) 21.6 0.0000033 fcrl3_6 Intron3 A/G 0.42 0.34 2.02 (1.49-2.75) 20.8 0.0000052 aSNPs with P<0.0001 in allele frequency comparison test -169 -110 exon1 exon2 exon3 ATG fcrl3_3 fcrl3_4 fcrl3_5 fcrl3_6 FCRL3プロモーター活性の評価 ・FCRL3 プロモーター配列(SNP;-169C/T,-110A/G) ・ルシフェラーゼ・アッセイにて評価 3ハプロタイプのプロモータ活性の評価(nt -523 ~ +203) -169C/T 周辺配列のエンハンス活性の評価(nt -189 ~ -160) -169 C/Tに結合する転写因子 ① TRANSFACによる予測 -169C/T CGGGAAGTCC[C/T]T NFκB consensus motifとの比較 allele core match matrix match -169C 1.000 0.957 -169T 0.760 0.824 -169 C/Tに結合する転写因子 ② EMSA (ゲルシフト・アッセイ) ・-169C/T周辺配列を用いたEMSA Raji細胞核タンパクと -169Cアレルで強い結合(バンドI) ・スーパーシフトアッセイ 抗NFκB 抗体でシフト (p50,p65,c-Rel) ジェノタイプ別のFCRL3発現量 健常人末梢血B細胞での発現をTaqMan-PCR法により定量 発現量はRA感受性アレルの数(n = 0,1,2)で有意に回帰された. (R2 = 0.49,P = 0.0076) FCRL3多型と遺伝子発現量 組織でのFCRL3発現 TaqMan-PCR法にて定量 RA滑膜でのFCRL3発現 in situ hybridization法 T細胞 B細胞 CD3 CD20 100x 100x FCRL3 ISH 100x 400x FCRL3 多型と自己抗体の関連 リウマトイド因子 抗CCP抗体 n 血清抗体価 ±SEM n (N=148) (IU/ml) (N=71) 陽性率 (%) -169 C/C 29 479.9 ±91.3a 17 100.0b -169 C/T 75 323.7 ±47.3a 35 94.3b -169 T/T 44 216.4 ±44.0a 19 73.7b ジェノタイプ a 血清抗体価はRA感受性アレルの数で有意に回帰された (R2=0.049, bP=0.029 by Fisher's exact test. P=0.0065). FCRL3多型(-169 C/T) と HLA-DRB1ジェノタイプの関連 SE+/+ SE+/- SE-/- n=113 n=376 n=215 -169 C/C 32 73 35 -169 C/T 46 177 99 -169 T/T 35 126 81 アレルC頻度 0.49* 0.43 0.39 ジェノタイプ SE = shared epitope (日本人では DRB1*0405が最多) * c2 検定で P <0.05 (vs SE-/-). RA患者(N=704)をHLA-DR shared epitopeのジェノタイプ別に 層別化し,-169Cのアレル頻度を比較した FCRL3多型( -169C/T)とAITD,SLEの関連 疾患 AITD total 人数 アレルC 頻度 劣性遺伝形式比較 OR (95% CI) c2 P 509 0.45 1.74 (1.35-2.24) 18.5 0.000017 GD 351 0.46 1.79 (1.34-2.39) 15.7 0.000074 HT 158 0.42 1.62 (1.07-2.47) 5.2 0.022 SLE 564 0.41 1.49 (1.16-1.92) 9.8 0.0017 Controls 2037 0.37 AITD = 自己免疫性甲状腺炎; SLE = 全身性エリテマトーデス; GD = Graves病; HT = 橋本病. FCRL3 Fc receptor-like 3 ・Ⅰ型膜貫通タンパク (734a) ・ 細胞外 6個のIg-like domain FcγRとの高い相同性 ・ 細胞内 4つのTyrosine motif FCRL3細胞内ドメイン ITIM ITAM Y Y ITIM Syk, ZAP70 tyrosine kinases or ITIM ITIM Y SHP-1,SHP-2 tyrosine phosphatases ITIM hemi-ITAM Y (Xu et al. BBRC 2002) ITAM ; Immunoreceptor Tyrosine-based Activation Motif ITIM ; Immunoreceptor Tyrosine-based Inhibition Motif FCRLsのリンパ組織での発現 Tonsilを用いたin situ hybridization (Miller et al. Blood 2002) HE ISH Mantle zone Mantle zone Light zone Marginal zone Light zone RAにおけるFCRL3の役割(仮説) まとめ ・FCRL3遺伝子プロモータ領域の多型(-169 C/T)と 複数の自己免疫性疾患感受性との関連を同定した. ・感受性アレルを持つ個人では,遺伝子発現量が増 加しており,また自己抗体産生の増加も認めた. ・FCRL3は,2次リンパ組織および疾患病理組織の B細胞において発現しており,免疫系における機能 性遺伝子であることが考えられた. 今後の展開 ① 自己免疫性疾患の病態解明 FCRL3は自己免疫疾患に普遍的に関与する遺伝子? B細胞を中心とした自己免疫現象の解明 ② 治療法の開発 FCRL3をターゲットにした創薬 ③ テイラーメード医療への応用 FCRL3遺伝子多型は疾患の予後予測因子になりうる? 個人の遺伝情報に基づいた治療 謝辞 理化学研究所遺伝子多型研究センター 川上 高橋 角田 関根 大西 中村 弘人 篤 達彦 章博 洋三 祐輔 同・関節リウマチ関連遺伝子研究チーム 鈴木 亜香里 徳廣 臣哉 常 暁天 小林 香子 菅野 栄美 川井田 礼美 駒木根 啓子 山中 美弥子 明前 敬子 RAゲノム検体提供機関 行岡 正雄 (行岡病院) 脇谷 滋之 (信州大学) 當間 重人 (国立相模原病院) 松原 司 (松原メイフラワー病院) 豊島 良太 (鳥取大学医学部) 西岡 雄一 (山梨県立中央病院) RA滑膜検体提供機関 吉野 愼一 (日本医科大学) 永島 正一 (同上) SLE,AITDゲノム検体提供機関 笹月 白澤 三森 小池 湯村 大坪 健彦 (国立国際医療センター) 専二 (同上) 明夫 (同上) 隆夫 (北海道大学) 和子 (東京女子医科大学) 茂 (同上) 東京大学大学院医学系研究科 アレルギー・リウマチ内科 沢田 哲治 敬称略
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