イネ科C4植物トダシバの PEPカルボキシラーゼ cDNAの解析理工学研究科分子生物学専攻 05SB004 内野道明 C4植物 C4光合成経路がCO2を濃縮して C3回路に供給する C4植物はC3植物と比較して強光・高温・乾燥の環境条件に適応トウモロコシイネ科植物の分類 Family Sub-family Tribe Speices C4タイプ Poaceae Panicoideae Andropogoneae Zea mays NADP-ME Saccharum officinarum NADP-ME Sorghum bicolor NADP-ME Arundinelleae Arundinella hirta NADP-ME Paniceae Setaria italica NADP-ME Panicum miliaceum NAD-ME Panicum maximum PEP-CK Cynodonteae Cynodon dactylon NAD-ME Chlorideae Chloris virgata PEP-CK Arundinoideae Aristideae Aristida mauritiana NADP-ME Pooideae Triticeae Triticum aestivum C3 Ehrhartoideae Oryzeae Oryza sativa C3 Chloridoideae 被子植物内でのC4種の内で単子葉類は79%、イネ科は61%を占める C4光合成を行うイネ科植物が非常に多いトダシバの知見・NADP-MEタイプのC4光合成経路・葉の維管束間隔が広い・DC (distinctive cell) 0.1 mm 1 葉身 2 3 4 トウモロコシ 5 1 維管束 DC 2 トダシバ 3 トダシバ葉身の切片写真 100 µm DC MC BSC MC NADP-MEタイプ C4光合成 Cytosol Chloroplast Cytosol Malate OAA Malate Starch NADP-ME PEPC RuBP Malate OAA NADP-MDH CO2 Chloroplast CO2 HCO3 Rubisco - PEP PEP PPDK Pyruvate Calvin cycle Pyruvate 3-PGA Mesophyll cell Bundle sheath cell PEPC ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ (PEPC) は C4光合成の他に、TCA回路への有機酸供給にも働くまた、3つのイソ型がある PEPC イソ型の種類主な発現器官 C4 緑葉 Root 根 Housekeeping (HK) 全体全てのイソ型ORFは約3000 bp 目的現在、トダシバの器官別の光合成酵素発現量が免疫電顕法で測定されている。葉身と葉鞘の間 (葉舌) あるいは葉鞘と茎の間 (葉枕)では、・緑色が薄い・不明瞭なクランツ構造であり、他の緑色器官と光合成酵素の発現様式が異なる。また、葉鞘の発達段階で・一旦発現したRubiscoが消失し、再度増加する。そのため、isogeneの使い分けの可能性がある。そこで、これらの組織で発現している酵素のタイプを特定し、葉身および葉鞘と比較することでC4特異的酵素発現制御の手がかりを得たい。トダシバのPEPCとRubiscoの各イソ型の使い分け・役割の違いを明らかにする足がかりとして、各イソ型のPEPCを単離し、他のイネ科植物のPEPCと比較した。実験概要葉身、根の組織からTotal RNAを抽出 cDNAを合成 PEPC各イソ型をPCR法で増幅電気泳動したPCR産物の抽出クローニングシークエンシング塩基配列による分類相同性の比較系統樹作成各イソ型特異的なPCRプライマー設計 18PF 16PF 1PF 2PF 5’ 8PF 13PF 12PF 5PF poly A poly T PEPC ORF 約3,000 bp 3’ 3PB 10PB 11PB 14PB 17PB K L O M 19PB N P H C4タイプ 1~14 PF, PBプライマー Rootタイプ 16PF, 17PBプライマー HKタイプ 7PB 18PF, 19PBプライマープライマー非翻訳領域翻訳領域 Q R 3’ 5’ 各イソ型の分類 5’ poly A poly T PEPC ORF 約3,000 bp 3’ 1 2A 2B 3A 3B 4A 4B 5A 5B 6A 6B Q1~3 R1~3 C4タイプ 1~6B Rootタイプ Q1~3 非翻訳領域 HKタイプ R1~3 翻訳領域 3’ 5’ 相同性の比較塩基配列 (%) Ah 1A 2A 3A C4 4A 5A 6A Root Q2 HK R2 Zm C4 87 86 88 88 88 88 81 74 アミノ酸配列 (%) Zm Root 83 78 71 72 74 79 94 78 Zm HK 76 74 70 71 74 76 77 92 Ah 1A 2A 3A 4A 5A 6A Q2 R2 Zm C4 86 82 87 86 87 83 76 71 トダシバPEPC各イソ型が単離された Zm Root 85 83 80 80 82 81 97 74 Zm HK 86 78 77 79 81 72 72 94 系統樹で用いた領域 5’ poly A poly T PEPC ORF 約3,000 bp 3’ 1 2A 2B C4タイプ 4A 4B 5A 5B R1~3 6A 6B Q1~3 R1~3 1~6B Rootタイプ Q1~3 HKタイプ 3A 3B 非翻訳領域翻訳領域約350 bp 3’ 5’ 系統樹 0.02 0.02 59 94 52 56 HK 100 99 94 91 100 99 100 99 Root 100 100 66 99 100 100 68 C4 100 ブーツストラップ値 (%) まとめ・トダシバからC4、Root、HousekeepingタイプPEPCの部分配列を得た。・C4タイプについて、プライマーの位置が異なるPCR産物同士の重複する塩基配列間での相違により、全長cDNAを得るには至らなかった。・ケトダシバ、ウスゲトダシバが知られており、それぞれ染色体が 2n = 34, 36、2n = 28, 56となっているため、複倍数体の可能性がある。そうであるなら、全てのイソ型で複数の種類が確認されたことも不思議ではない。