O-8 酵素糖化・効率的発酵に資する基盤研究（財）バイオインダストリー協会森川康１．要旨本テーマは、セルロース系バイオマスからの燃料エタノールの生産を2015～2020年頃に実用化する上で最大の課題である酵素糖化・発酵プロセスにおける革新的技術を創成することにより、わが国独自の新規技術の開発を目標としている。これまでに達成した成果の一部を報告する。２．これまでの成果本テーマでは、現在全16法人で図に示したように糖化基盤研究と発酵基盤研究を実施しており、加速的先導技術の一貫プロセス開発（ア）チームへの貢献を直接目的としている。糖化基盤研究の役割の一つである、バイオマスのハイスループット解析法の確立や、種々のバイオマス前処理法、タンパク質定量法および糖化酵素活性測定法などの標準化等は完了した。２−１糖化基盤研究：（イ）糖化システムの解明による高効率糖化の実現酵素使用量を少なくすると糖化率が頭打ちになる現象（頭打ち現象）を見いだし、この現象が糖化酵素（セルラーゼ）のバイオマスへの非生産的結合によることを明らかにし、バイオマス（セルロースおよびリグニン）側および酵糖化基盤研究１. 糖化システムの解明による高効率糖化の実現Ａバイオマスのミクロ構造および酵素との相互作用の解析 ①バイオマスのミクロ構造と糖化 ②糖化率頭打ち現象の打破Ｂ酵素回収法の開発 ③吸着挙動解析と酵素回収方法の開発２. 革新的糖化酵素の創成 D 最適な成分酵素の探索・評価・改良 ⑤成分酵素の機能解明と改良 ⑥異種宿主発現 ⑦統一的な性能評価 E 成分酵素の最適比率 ⑧成分酵素の最適比率の決定 F 高機能酵素生産菌株の造成と酵素生産研究 ⑨革新的糖化酵素生産菌株の造成 ⑩糖化酵素生産研究Ｃ高濃度糖化 ④高濃度糖化の実施 3 効率的C6・C5 発酵に資する遺伝子情報の獲得 G 耐酸・耐熱・キシロース代謝速度向上遺伝子情報の同定 ⑪耐熱性• 耐酸性遺伝子 ⑫キシロース代謝向上遺伝子（ア)チームへの貢献素（各成分酵素）側から、この現象の打破あるいは緩和を網羅的に解析しており、いくつかの発酵基盤研究酵素糖化 2013. 3 １ mg/g-生成糖４円/L-EtOH （ア)チームへの遺伝子情報提供への道筋成果を見いだしている。参考図基盤研究開発の概念図（ロ）革新的糖化酵素の創成 Trichoderma reesei の生産する糖化酵素中の多数の成分酵素よりも高機能の酵素を幅広く探索し、これまでに β-グルコシダーゼ（BGL）やキシラナーゼを含めた数種類の高機能成分酵素を見いだした。また、糖化酵素中の主要成分酵素は、バイオマス種と前処理法によってそれらの必要性が大きく変わることを明らかにした。 Aspergillus aculeatus の高機能 BGL を組み込んだ T. reesei 変異体の糖化酵素は欧米の市販酵素を上回る糖化能力を示した。さらに、用いるプロモーターと組み込み方法を最適化した菌株の酵素は、最新型の市販酵素を完全に凌駕する糖化機能を示した。組換え T. reesei 変異株の大量生産技術の検討も始めている。２−２発酵基盤研究：（ハ）効率的 C6・C5 発酵に資する遺伝子情報の獲得耐酸・耐熱性およびキシロース代謝向上に関する遺伝子情報の取得を目指して、実用酵母の突然変異遺伝子を次世代シーケンサーによる親株との比較ゲノムにより明らかにし、実用酵母での検証を行っている。さらに今年度からは比較ゲノムの単純化を目指し、ゲノム配列を明らかにした実用酵母親株を基に上記耐性変異株を構築している。また、キシロース代謝の上流３遺伝子の発現比率最適化を目指した発現制御技術の確立を進めている。３．まとめと今後の課題今後は、（イ）実用的な高濃度糖化での酵素使用量の低減とともに、（ロ）BGL 組換え酵素のさらなる高機能化を通じて、どのようにして 1 mg/g-生成糖に近づけるかが大きな課題である。また、（ハ）酵素の大量生産技術を確立して、安価な酵素生産の実現や、（ニ）キシロース代謝向上や耐熱・耐酸性の遺伝子情報および発現制御技術をいかに早く取得するかなどが重要であると考えている。 92 平成２３年度「バイオマスエネルギー関連事業成果報告会」 2012. 2. 2 東京コンファレンスセンター・有明新エネルギー技術研究開発／バイオマスエネルギー等高効率転換技術開発／先導技術開発（加速的先導技術開発） (ウ) 酵素糖化・効率的発酵に資する基盤研究参画 16 法人一般財団法人独立行政法人株式会社国立大学法人公立大学法人学校法人バイオインダストリー協会（JBA）産業技術総合研究所、製品評価技術基盤機構、森林総合研究所、食品総合研究所、農業生物資源研究所花王、日揮、Meiji Seika ファルマ京都大学、信州大学、東京大学、長岡技術科学大学、熊本大学大阪府立大学祟城大学 (一財) バイオインダストリー協会技術顧問森川康 1 研究の目的と目標セルロース系バイオマスからのバイオエタノール生産の実用化に向けて主要課題１）前処理エネルギー消費抑制、設備コスト低減、酵素糖化を受けやすい前処理２）酵素糖化 (セルロース・ヘミセルロース・リグニンの複雑な絡み合った構造であり、セルロースが結晶構造を取っているため、大量の酵素が必要）糖化酵素（セルラーゼ等）の使用量低減（酵素コスト低減）３）発酵 C5 糖（キシロース等）の C6 糖と同時・同速度での発酵４）その他加速的先導技術開発の基盤研究として、革新的糖化酵素の創成（糖化基盤研究）と発酵課題解決（発酵基盤研究）を目指して研究開発を実施 2 93 直接目的加速的先導（ア)チームの一貫プロセス開発への貢献遺伝子、酵素、微生物、技術情報等の提供「バイオ燃料技術革新計画」技術革新ケースのベンチマーク原料：目的生産バイオマス規模：10万〜20万 kL／年糖化工程酵素コスト低減ー酵素使用量の低減、酵素単価低減発酵工程酵素使用量１ mg-酵素／g-生成糖酵素コスト４円／L-EtOH C6 と C5 糖の同時利用と発酵菌の高温耐性エタノール収率 95 ％以上最終目標（2015 年）：ベンチマークの達成現在 8 プロセスが実用化に向けて開発中（経産省／NEDO、農水省）日本のバイオエタノール生産プロセス実用化への貢献 3 研究開発全体の概念図糖化基盤研究糖化１. 糖化システムの解明による高効率糖化の実現Ａバイオマスのミクロ構造および酵素との相互作用の解析 ①バイオマスのミクロ構造と糖化 ②糖化率頭打ち現象の打破Ｂ酵素回収法の開発 ③吸着挙動解析と酵素回収方法の開発Ｃ高濃度糖化 ④高濃度糖化の実施酵素２. 革新的糖化酵素の創成 D 最適な成分酵素の探索・評価・改良 ⑤成分酵素の機能解明と改良 ⑥異種宿主発現 ⑦統一的な性能評価 E 成分酵素の最適比率 ⑧成分酵素の最適比率の決定 F 高機能酵素生産菌株の造成と酵素生産研究 ⑨革新的糖化酵素生産菌株の造成 ⑩糖化酵素生産研究（ア)チームへの貢献 2013. 3 １ mg/g-生成糖４円/L-EtOH 発酵基盤研究 3. 効率的C6・C5 発酵に資する遺伝子情報の獲得 G 耐酸・耐熱・キシロース代謝速度向上遺伝子情報の同定 ⑪耐熱性• 耐酸性遺伝子 ⑫キシロース代謝向上遺伝子（ア)チームへの遺伝子情報提供への道筋 94 4 研究開発体制 NEDO JBA 研究開発推進委員会（外部委員、内部委員）ＰＬＰＬ（補佐）長岡技科大（JBA） JBA 森川康小林良則研究開発大項目１糖化リーダー京大杉山淳司京都大、信州大、森林総研、東京大 JBA、日揮研究開発大項目２酵素リーダー JBA 小林良則サブリーダー産総研宮崎健太郎 JBA、産総研、製品評価技術基盤機構、長岡技科大、大阪府大、農生資源研、食総研 Meiji Seika ファルマ、花王研究開発大項目３発酵リーダー産総研鎌形洋一総合調整と調査研究産総研、熊本大学、崇城大学 JBA 5 基盤研究全体の進行状況 (プロジェクト期間 2008.10 - 2013.3）〜 2008 （日本） 2011. 12 （現状）無し完成済み 2013. 3 (達成見込み) 20152020 「バイオ燃料技術革新計画」の酵素糖化のベンチマーク達成標準化バイオマスTTP解析、最適前処理法、分析法と評価（酵素活性等）糖化基盤研究高効率糖化高機能糖化酵素 (Trichoderma reesei) 低酵素使用時の糖化率頭打ち現象ほとんど指摘無し解析完了原因把握具体的な酵素使用量低減策酵素回収・再利用膜法など（経済性？）吸着現象解析向流型酵素糖化法提案具体的な再利用法の提案（頭打ち現象と関連）バイオマスに最適な酵素概念なし主要成分酵素に付いて完了各プロセスに最適な糖化酵素酵素使用量 (標準的糖化） 34 mg /g-生成糖酵素大量生産技術酵素コスト (仮定あり) 過去にあり (データ未公表) 307 円 /L-EtOH 4 mg /g-生成糖 2-10 L ジャーでの検討開始 35 円 /L-EtOH 1.5-2 mg /g-生成糖 3,000 円/kg-酵素タンパク質酵素使用量 1 mg /g-生成糖酵素コスト 4円 /L-EtOH 10 円 /L-EtOH 6 95 （つづき）〜 2008 （日本） 2011. 12 現状耐酸性・耐熱耐酸性関連遺伝子発酵基盤研究耐熱性・耐酸性に関性に関与する数種の候補を取得数種の遺伝子耐熱性関連遺伝子わる遺伝子情報の情報進行中 2013. 3 (達成見込み) 20152020 各数個以上の遺伝子情報を取得 (実用酵母で確認) キシロース代謝向上遺伝子情報代謝マップ上キシロース代謝に関わる遺伝子の関与についての情報キシロース代謝が向上した自然突然変異株の比較ゲノム進行中キシロース代謝３遺伝子の発現比率技術強弱2種類の発現比率のみによる代謝効率の情報３遺伝子の発現比率を多段階に変化させ、最適発現比率の達成代謝効率を向上。実 (実用酵母で確認) 用酵母でキシロース代謝向上菌株取得「バイオ燃料技術革新計画」の発酵のベンチマーク達成数個の遺伝子情報を取得 (実用酵母で確認) C6/C5 同時発酵高温耐性発酵収率 95％以上 7 糖化「糖化システムの解明による高効率糖化の実現」Ａバイオマスのミクロ構造および酵素との相互作用の解析酵素量低減高効率糖化 ①バイオマスのミクロ構造と糖化の関係 ②糖化率頭打ち現象の打破前処理バイオマス糖糖化発酵エタノール併行複発酵Ｃ高濃度糖化 ④高濃度糖化の実施Ｂ酵素回収法の開発 ③吸着挙動解析と酵素回収方法の開発再利用酵素量低減酵素から見た実用化とのギャップや問題点解消 8 96 糖化「糖化システムの解明による高効率糖化の実現」 (JBA つくば研、京大、信州大、森林総研、東大、日揮、長岡技大）成果の主なトピックス ◎バイオマスのハイスループットな分析・評価法の確立（ケモメトリクス） ◎標準前処理法の確立（NaOH、希硫酸、水熱、(爆砕)；稲わら、エリアンサス、ユーカリ、(スギ)） ◎低酵素量使用時の糖化率頭打ち現象の緩和と打破糖化反応の網羅的解析各種の解析から「セルラーゼのセルロースへの非生産的結合により起こる」と結論糖化率（％）酵素量大通常の酵素反応 0 酵素量小酵素使用量低減と酵素回収・再利用とに密接に関連反応時間（h）基質側（セルロースやリグニン）と酵素側（成分酵素）から頭打ち現象の打破を検討 ◎前処理法・バイオマス種に応じた糖化酵素が必要糖化低酵素量使用時の頭打ち現象の解析、緩和と打破・セルロースの物性を変化させることで頭打ち現象は緩和されるが解消しない 5％ NaOH 前処理ユーカリ酵素：Accellerase 1500 100 ・ろ紙の糖化時に震盪すると頭打ち現象あり、静置ではかなり回復・セロビオハイドロラーゼ (CBH II) が振盪により析出 20 mg/g-biomass 80 糖化率 (%) 9 60 5 mg/gbiomass 40 ・成分酵素や分子種によって残渣への吸着性が異なる 2 mg/g-biomass 20 β-グルコシダーゼ（BGL）はリグニンに吸着 0 0 20 40 60 反応時間 (h) 80 100 ・グルコースによる糖化反応阻害は確実に起るが、頭打ち現象の原因ではない 10 97 糖化糖化時の CBH I と CBH II の挙動の解析（日揮）これまでの解析で、「振盪により CBH II が析出」を発見 10 ％ろ紙の糖化、静置法、酵素量約 10 mg/g-ろ紙上清中の CBH I 濃度[-] 1.2 原液セルラーゼ 1 CBH1主体 0.8 CBH II 有り 0.6 0.4 0.2 CBH II 無し 0 0 20 40 反応時間 [Day] 回収・再利用にも重要 CBH I の解離を CBH II が促進糖化 11 成分酵素（CBH II）の糖化残渣への吸着と消失（JBA つくば研） pH pH3 分子量バイオマス NaOH 前処理稲わら酵素 5 mg/g-バイオマス糖化時間 72 hr Accellerase 1500 の二次元電気泳動図大糖化条件 pH10 小上清 CBH II のスポット残渣振盪静置消失は CBH II の分子種で異なる 12 98 糖化前処理法およびバイオマス種に応じた糖化酵素が必要（JBA つくば研、長岡技科大）主要成分酵素 CBH I、CBH II、EG I の差異硫酸前処理稲わら 100 水熱処理ユーカリ ΔEG I 80 80 糖化率（％）糖化率（％） ΔCBH II ΔCBH I 60 40 ΔEG I ΔCBH II 60 40 ΔCBH I 20 Δ：それぞれの成分酵素だけが欠失している糖化酵素 20 WT 100 WT 0 0 0 20 40 時間 60 0 80 20 40 時間 60 同様に、各種の前処理バイオマスを糖化し、成分酵素の重要性を検討 80 13 糖化前処理バイオマスの糖化に対する T. reesei 成分酵素の役割（JBA つくば研） CBH I CBH II EG I NaOH 前処理稲わら ◎ △ △ 希硫酸前処理稲わら ◎ ○ × 水熱前処理稲わら ◎ ○ △ NaOH 前処理エリアンサス ◎ △ △ NaOH 前処理ユーカリ ◎ ○ ○ 希硫酸前処理ユーカリ ◎ ○ ○ 水熱前処理ユーカリ ◎ ○ △ 爆砕前処理スギ ◎ ○ × コンバージミル前処理スギ ◎ △ ○ セルロース [SIGMA]、[ADVANTEC] ◎ ◎ × リン酸膨潤セルロース (×) (×) (×) NaOH 処理セルロース [SIGMA] ◎ ◎ △ 前処理バイオマス前処理バイオマスの糖化における寄与度：＜大＞ ◎・○・△・× ＜小＞前処理法およびバイオマス種に応じて、主要な成分酵素の比率を変化させる必要有り14 99 酵素「革新的糖化酵素の創成」 Trichoderma reesei の成分酵素は最高ではない！広範囲に優れた成分酵素を探索する D 最適な成分酵素の探索・評価・改良＜既存生物の成分酵素＞＜新規微生物の成分酵素＞糸状菌（Trichoderma) 麹菌（Aspergillus) ⑤ 探索・改良担子菌（Irpex) 放線菌昆虫（ゴキブリ、シロアリ）メタゲノムメタトランスクリプトーム微生物ライブラリーデータベース（CAZY） ⑥ 遺伝子の異種宿主発現バイオマス種と前処理法で異なる（S. pombe、A. oryzae、枯草菌等） E 成分酵素の最適比率の決定 ⑦ 統一的な性能評価と絞り込み ⑧ 成分酵素の最適比率の決定 F 酵素生産菌株の造成と生産研究遺伝子組換え技術による改良と大量生産技術 ⑨ 高機能糖化酵素生産菌株の造成 ⑩ 糖化酵素生産研究酵素 15 「革新的糖化酵素の創成」成果の主なトピックス（JBA つくば研、産総研、製品評価技術基盤機構、食総研、生物資源研、花王、日揮、Meiji Seika ファルマ、長岡技科大、大阪府大、信州大） ◎分析法の標準化タンパク質定量、酵素活性測定、バイオマス組成分析、市販酵素の機能評価 ◎広範囲な糖化酵素（成分酵素）の探索と統一評価（メタゲノム、日本独自の微生物資源、既知セルラーゼ生産菌などから） CBH、β-グルコシダーゼ（BGL）、ヘミセルラーゼ等の探索多数のメンバーから提供された成分酵素の統一的評価 ◎成分酵素の最適比率の決定 BGL の最適比率 GHF10 キシラナーゼ（T. reesei XYN III）の最適化 ◎高機能糖化酵素の構築セロビアーゼ活性の高い BGL（A. aculeatus BGL1）の選定セルラーゼ高生産菌 T. reesei への A. aculeatus BGL1 の導入導入法の検討により３種の高機能糖化酵素を構築 JN13 は欧米の最新型市販酵素を完全に凌駕するオールラウンドな糖化酵素 80 ％糖化に必要な酵素使用量 (mg/g-生成糖) 親株の酵素 JN13 最強市販酵素 34 3.9 5.6 100 16 酵素最適な成分酵素の探索・評価メタゲノム由来β-グルコシダーゼの取得と評価添加効果有り（4）難培養性微生物 >99% 添加効果試験（10）環境中の微生物遺伝子クローニング（20）・メタゲノム由来 1400 の BGL 取得・30以上の Glc 耐性 BGL 獲得・4 種類の BGL に糖化時の添加効果を確認グルコース耐性（31）・既存のものと比べてユニークな BGL ・糸状菌由来とは全く異なる性質・「メジャーなセルラーゼ生産菌」の研究では獲得することは出来なかった BGL メタゲノム由来β−グルコシダーゼ（1400） BGL 探索進化分子工学的改変へ酵素（産総研） 17 広範囲な微生物資源からの成分酵素の探索（製品評価技術基盤機構）微生物資源微生物スクリーニング・セルラーゼスクリーニング・ヘミセルラーゼスクリーニング・NBRC株・過去の所内分離株・生態学や分類研究者からの提供株・国内外での新規分離株活性株新規遺伝子資源の選抜酵素系評価による選定（補完成分中心）主要成分酵素（CBH I 等）の選抜・成分酵素の精製・統一的評価・分類に基づく俯瞰図・活性株類縁・遺伝子情報の有無・分類の新規性・分離源や生態学的興味・１D Secretome LC-MS による成分酵素同定 cDNAプール／ゲノム配列決定・２D Secretome 遺伝子取得 LC-MS 定量 PCR サブトラクション解析（JBAつくば研）異種発現（JBA つくば研等）、 T. reesei への組み込み評価（長岡技科大） 101 18 酵素統一的な評価 ◯ 成分酵素 187 種 CBH（大部分は CBH I） EG （多数のメンバーからの提供 JBA つくば研での評価） T. reesei CBH I と同等以上 76 種 5種 28 T. reesei EG I と同等 1 種比活性の高いEG 1 種 BGL 24 XYN 14 他のへミセルラーゼアクセサリー酵素等 26 19 A. aculeatus BGL1 A. aculeatus BGL1 以上の比活性 1種 Glc 耐性（活性化されるものを含む） 5 種 GHF 10 キシラナーゼの重要性耐熱性キシラナーゼ 1 種評価の高いものは T. reesei への組み込み今後は CBH II やヘミセルラーゼ・補助タンパク質中心に探索酵素 19 高機能 T. reesei セルラーゼの構築と評価（長岡技科大、大阪府大 JBA つくば研） ◎ T. reesei の優秀さと弱点セルラーゼ高生産性タンパク質生産能力が高く、そのほとんどはセルラーゼとヘミセルラーゼセルロース系バイオマス分解に必要なすべての成分酵素・タンパク質を作る糖化に必須のβ-グルコシダーゼ（BGL）活性が弱い ◎ BGL の必要量および高性能のBGL ・糖化には T. reesei の BGL 活性の 10 倍以上必要 T. reesei および A. aculeatus の β-グルコシダーゼ（BGL）の基質特異性比活性（U/mg） 250 200 ・T. reesei には 10 種の BGL しかし、セロビアーゼ活性の高い BGL なし A. aculeatus BGL1 探索結果から 150 T. reesei BGL I 100 50 0 Cellobiose pNPG Cellobiose pNPG 102 ・A. aculeatus BGL1の T. reesei への組み込み 20 酵素高機能糖化酵素 JN シリーズの酵素活性（JBA つくば研、長岡技科大）酵素活性比活性（U/mg-protein） WT JN11 JN12 JN13 JN13H 市販酵素X Cellic CTec2 FPU 1.1 1.9 1.9 1.9 1.6 1.0 1.5 CMCase 35 53 57 52 48 45 66 Cellobiase 0.12 7.8 40 12 7.1 3.2 40 Xylanase 88 67 50 67 170 110 210 β-Xylosidase 0.59 0.54 0.69 0.45 1.7 4.8 0.25 Mannanase 1.2 2.0 2.0 2.3 1.9 0.62 2.8 Mannosidase - - - - - - 0.038 α-Arabinofuranosidase 0.12 0.089 0.067 0.074 0.22 4.6 0.049 酵素 -：not detected JN13H : キシランを添加培養した JN13 の酵素 NaOH 前処理エリアンサスの糖化 21 （JBA つくば研）酵素使用量と糖化率（5 ％前処理バイオマス使用） 100 CTec2 JN13H 糖化率（Glc + Xyl）（％） 80 JN11 酵素X 60 40 20 0 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 酵素量（mg/g-バイオマス） 22 103 酵素糖化率80％（Glc + Xyl）に必要な酵素量（JBA つくば研）バイオマス（前処理法） WT JN11 JN12 JN13 JN13H 稲わら（NaOH） 29 7.4 7.8 4.6 3.8 エリアンサス（NaOH） 22 3.7 3.5 2.8 2.5 ユーカリ（水熱） 35 4.2 4.8 4.3 4.6 酵素 X Cellic CTec2 10 11 5.7 14 3.6 5.6 JN13H : キシラン添加培養 3.9 mg/g-生成糖（80 ％糖化率 x 80 ％含有率） 34 mg/g-生成糖使用量約1/9 に低減 5.6 mg/g-生成糖欧米の市販酵素を完全に凌駕 A. aculeatus BGL1：高機能および T. reesei での高発現 T. reesei 親株（WT）の優秀さ JN13 をベースに第２段階以降の高機能糖化酵素の造成を進行中発酵 23 「高効率C6・C5発酵に資する遺伝子情報の獲得」次世代シーケンサーによる高速ゲノム解析比較ゲノム解析による有用変異遺伝子の解析変異株のDNA 実用酵母変異株の取得変異遺伝子特定実用酵母での変異遺伝子の検証（耐酸・耐熱性遺伝子）（キシロース代謝向上遺伝子）プロモーター開発多重発現技術プロモーターの選定と発現技術の提供耐酸性・耐熱性・キシロース代謝向上遺伝子情報キシロース代謝向上のための発現制御技術 104 24 発酵エタノール実用酵母からの耐酸性遺伝子情報の取得（熊本大、産総研）実用酵母 SOLiD3解析酸性条件で連続培養・馴化四胞子解析耐酸性変異株ハプロイドドラフトゲノムを参照して変異遺伝子候補の絞り込みドラフトゲノム解析 NAM34-4C（実用酵母基準株） pH 3.0 での培養条件で、より生育させる遺伝子を数個発見！候補遺伝子の挿入菌体量遺伝子導入酵母耐酸性の変化の検証発現ベクター時間比較ゲノムが複雑過ぎる発酵遺伝子発現用実験室酵母単純化（NAM34-4Cを親株に） 25 実用酵母基準株 NAM34-4C の突然変異株（熊本大、崇城大） ◎ 耐酸・耐熱性変異株ー準備完了、現在変異進行中 ◎ キシロース代謝向上株の取得キシロース高濃度培地での生育速度（２段階）の向上株エタノール発酵も早い SCB26 SCB27 YPXU 培地 50 g/L xylose 次世代シーケンサーによる比較ゲノム実施中キシロース代謝向上遺伝子情報獲得へ 26 105 発酵キシロース代謝酵素の発現制御による発酵能力の改善（産総研） DPP 株（実用酵母の親株 IR-2 に XR, XDH, XK 遺伝子のみ導入、３遺伝子の発現比率が現時点で最適な株） Glucose, Xylose, Xylitol, Ethanol (g/L) YPDX 培地（4.5％ Glc + 4.5% Xyl） ○従来株より・キシロースの早い代謝・エタノールの早い蓄積 EtOH Xylose Xylitol Incubation time (h) ○さらなる加速に向けた発現制御技術の改良を進める従来株： Matsushika et al. Biores. Technol. (2009) 100: 2392–2398 より 27 今後の課題（糖化）実用的な高濃度糖化での酵素使用量低減（頭打ち打破、再利用）（酵素）JN13 をベースに更なる高機能化酵素の構築酵素使用量をいかに 1 mg/g-生成糖に近づけるか（酵素）糖化酵素の大量生産技術の確立安価な酵素生産の実現（酵素コストのベンチマーク 4 円/L）（発酵）キシロース代謝向上遺伝子情報を中心に、耐酸・耐熱遺伝子情報やキシロース代謝遺伝子の発現制御技術の獲得 28 106