LC/MSを用いた生物試料中のジラム、マンゼブの定量

LC/MSを用いた生物試料中の
ジラム、マンゼブの定量
株式会社住化分析センター
○木村義孝、村上雅志、竹田菊男
ジラム

構造
S
(H3C)2N-C-S
2
Zn
物性
分子量
融点
(℃)
305.83
250～
251.5
蒸気圧
(mPa)
<1
(25℃)
水溶解度 LogPow
(mg/L)
1.58-18.3
(20℃)
1.23
マンゼブ

構造
S
S
-S-C-NH-CH2-CH2-NH-C-S
x
Mny Znz
物性
分子量
融点
(℃)
270.53 192～194
蒸気圧
(mPa)
極小
(20℃)
水溶解度 LogPow
(mg/L)
不溶
1.20
分析上のポイント

ジチオカルバメート系農薬は、金属錯体のままで
はほとんどの溶媒に溶けない

対象物質をアルカリ性EDTA溶液でナトリウム塩
に変換して可溶化
ヨウ化メチルでメチルエステル化
ジラムはジメチルジチオカルバミン酸メチル
(DMDTC-Me)として分析
マンゼブはエチレンジチオカルバミン酸ジメチル
(EBDTC-2Me)として分析



分析上の注意点

ジメチルジチオカルバミン酸及びエチレンジチオカルバミ
ン酸を構造に持つ物質の分別定量ができない
ジラム換算合量及びマンゼブ換算合量


DMDTC-Me (ジラムの誘導体化物)を生成する物質：
チウラム、有機ニッケル等
EBDTC-2Me (マンゼブの誘導体化物)を生成する物質：
ジネブ、マンネブ、アンバム、ポリカーバメート等
ジラム、マンゼブ（生物）

分析フローチャート
×2
生物試料 10 g
ホモジナイズ
振とう
遠心分離
ジクロロメタン 10 mL +
5% L-システイン-5% EDTA溶液 25 mL
ホモジナイズ5分
30分
3000rpm
5分
pH調整
メチル化・抽出×2
濃縮・転溶
0.4 mol/L TBA溶液 5 mL
2 mol/L塩酸、pH7.5～7.7
0.1 mol/Lヨウ化メチル含有
アセトン/ヘキサン(1:2) 50 mL
約2 mLまで濃縮
アセトニトリル転溶、
約2 mLまで濃縮
濃縮
LC/MS-SIM
約0.5 mLまで
精製水で1.0 mLに
定容
ジラム：Pos+
マンゼブ：Neg-
クリーンアップ
Sep-Pak Plus C18 + Sep-Pak Plus Alumina N
負荷、アセトニトリル 1 mLで洗浄負荷
アセトニトリル 7 mL + 25 mLで溶出
分析条件（LC）
LC
機種
カラム
Agilent 1100 LC
移動相
A:0.1%ギ酸 B:アセトニトリル
0→20 min A:70%→5%
B:30%→95% Linear gradient
0.2 mL/min
30℃
20 µL
流量
カラム温度
注入量
SUMIPAX ODS K-03-2015
（2 mm×150 mm, 3 µm）
分析条件（ＭＳ）
MS
機種
キャピラリー電圧（Vcap)
ネブライザー
ドライングガス流量及び温度
イオン化法
モニターイオン
Agilent 1100 MSD SL
3000 V
N2（50 psi）
N2（10.0 L/min, 320℃）
ESI-SIM
ジラム：Pos+, マンゼブ：Negジラム 136/138
マンゼブ 239/191
標準物質測定クロマトグラム
ジラム(定量イオン)： 2 ng
6000
4000
2000
0
8
10
12
14
16
18
min
14
16
18
min
16
18
min
16
18
min
6000
ジラム(確認イオン)
4000
2000
0
8
10
12
マンゼブ(定量イオン)： 0.2 ng
6000
4000
2000
0
8
10
12
14
マンゼブ(確認イオン)
6000
4000
2000
0
8
10
12
14
標準物質測定クロマトグラム
LC/MS測定条件の検討

測定モードと感度 (単位：pg、約S/N=3)
測定モード
APCI
ESI
Positive
Negative
Positive
Negative
ジラム
100
-
100
-
マンゼブ
100
100
10
10


APCIモードでは、ベースラインの異常上昇及び感度変動
などが顕著
→ ESIモードでの測定
ESI-Positive モードでは、マンゼブ定量イオン(m/z 241)
のベースラインが上昇
→ ジラムはESI-Positiveモード、
マンゼブはESI-Negativeモードで測定
ホモジナイズ後抽出方法の検討

既報における問題点

クロロホルム/ヘキサン(3:1)によるメチル化・抽出
→ LC/MSでの測定においてイオン源に白い粉末や油状の
物質が付着
→ ベースラインの著しい変動や感度の低下
→ 生物試料を使用しない前処理操作でも低い回収率

抽出溶剤変更の検討
ジクロロメタン/ヘキサン(3:1)、ヘキサン
及びアセトン/ヘキサン(1:2) 採用
市販のDMDTC-Me及びEBDTC-2Me (林純薬工業株式
会社)の測定結果
→ DMDTC-Me：66.8%、EBDTC-2Me：69.4%

濃縮方法の検討

エバポレーター濃縮による回収率の低下
ジラム：
 マンゼブ：


揮散
分解
防止策
酸化防止剤：1% L-システイン含有メタノール添加
 濃縮は約2 mLまでとし、乾固を避ける

回収率の改善
検量線の作製方法

本法の誘導体化効率(回収率)
 ジラム：
66.8%
 マンゼブ： 69.4%

検量線用の標準溶液
 試料と同様の操作を行い調整
検量線
DMDTC-Me, MSD1 136
Area = 12680.7058*Amt +0
EBDTC-2Me, MSD2 239
Area = 60573.097*Amt +0
Area
Area
120000
250000
7
7
100000
200000
80000
150000
6
6
60000
100000
40000
5
5
50000
20000
4
12
12
0
Correlation: 0.99996
0
4
3
10
Amount[ng]
ジラム(0.2～20 ng)
3
0
Correlation: 0.99955
0
1
Amount[ng]
マンゼブ(0.02～2 ng)
IDL、MDL

IDL

成分
ジラムマンゼブ
試料量
10
10
(g)
最終液量
1
1
(mL)
注入液濃度
25
2.5
(µg/L)
装置注入量
20
20
(µL)
IDL (ng)
IDL (µg/kg)
0.064 0.0072
0.32
0.036
MDL
成分
ジラムマンゼブ
試料量
10
10
(g)
最終液量
1
1
(mL)
注入液濃度
25
2.5
(µg/L)
装置注入量
20
20
(µL)
MDL (µg/kg) 0.53
0.074
MQL (µg/kg) 1.37
0.191
操作ブランク、添加回収試験

操作ブランク


検出せず
添加回収試験（カレイ）
物質名
ジラム
マンゼブ
試料量添加量
検出濃度回収率変動係数
測定回数
(g)
(ng)
(µg/kg)
(%)
(%)
10
25
7
10
150
3
10
10
2.5
15
7
3
60
12.0
80
0.168
67
1.58
106
1.51
9.1
6.3
11.4
8.3
環境試料分析例
1500
ジラム(定量イオン)：不検出
1000
500
8
10
12
14
16
18
min
12
14
16
18
min
14
16
18
min
14
16
18
min
1500
1000
500
ジラム(確認イオン)
8
10
マンゼブ(定量イオン)：不検出
1500
1000
500
8
10
12
マンゼブ(確認イオン)
1500
1000
500
8
10
12
カレイ測定クロマトグラム
環境試料分析例
MSD1 136, EIC=135.7:136.7 API-ES, Pos, SIM, Frag: 90
ジラム(定量イオン)：試料濃度 15 µg/kg
1000
750
500
250
8
10
MSD1 138, EIC=137.7:138.7 API-ES, Pos, SIM, Frag: 90
12
8
10
MSD2 239, EIC=238.7:239.7 API-ES, Neg, SIM, Frag: Var
12
8
10
MSD2 191, EIC=190.7:191.7 API-ES, Neg, SIM, Frag: Var
12
14
16
18
min
14
16
18
min
ジラム(確認イオン)
1000
750
500
250
マンゼブ(定量イオン)：試料濃度 1.5 µg/kg
1000
750
500
250
14
16
18
min
16
18
min
マンゼブ(確認イオン)
1000
750
500
250
8
10
12
14
添加回収試験クロマトグラム（カレイ）
まとめ

本法により、生物試料中ジラム1 μg/kgレベ
ルおよびマンゼブ0.1 μg/kgレベルの定量が
可能である。

なお本検討の内容は、環境省より委託された
「平成17年度化学物質環境実態調査暴露量
調査(生物)分析調査」によるものである。

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