実施：2011年12月 細胞が外部にある特定のDNAを取り込み，そのDNAの遺 伝子が発現することを確認する。大腸菌を用いて観察する 教材 • BIO-RAD「Biotechnology Explorerキット」を使用 目的 器具 • ウオーターバス(42℃) インキュベーター(37℃) 氷 • ピペット 植付け用ループ 緑と青のチューブ チューブ立 て(キッドに同包) 油性ペン 薬品 • 大腸菌スタータープレート(LB)１枚 • pGLOプラスミド溶液 １本 • 寒天培地(LB×１ LB/ amp×２ LB/amp/ara×１) 計４ 枚 • 形質転換用溶液(Bu) １本 • LB培地(液体) １本 材料は氷冷しておく。 (A) ＋DNA LB／amp （B） ＋DNA LB／amp／ara (C) －DNA LB／amp （D） LB 寒天培地は事前に準備しておく －DNA マーカー以外の器具は，実験キッドに同包されたものを使用する。 １ ２ ３ ４ 導入したい遺伝子を含むDNAを手に入れる。 導入したい遺伝子をベクターに組み込む。 ベクターを細胞に導入する。 遺伝子組み換えに成功した細胞の選別。 １ 緑チューブのフタに 「＋DNA」 ，青チューブの フタに 「－DNA」 と記入する。 ここでのDNAはプラスミドのことです。 ２ 緑と青チューブに形質転換溶液（Bu）を250μℓず つ加え，冷却する。 両方同じピペットを使用できる。 ３ 形質転換される大腸菌を緑と青チューブに溶解 させ，氷冷する。 大腸菌スタータープレート （LB）のコロニーを植付け用 ループですくい取り，緑チュー ブに溶かし入れる。 青いチューブも同様に行う。 大腸菌を溶かし入れたら， 液層に触らないこと。 温めないようにする。 ４ pGLOプラスミド溶液を緑（＋）チューブのみに加 える。 新しい植付け用ループを pGLOプラスミド溶液に浸し， ○部分に膜が張っていること を確認して，緑チューブに浸し， 攪拌する。 pGLOプラスミドは， オワンクラゲの蛍光 発色遺伝子を導入さ せるベクター。 ５ 緑と青チューブを10分間氷冷する。 ６ 寒天培地４枚のフタに次のサンプル名を記入す る。 それぞれに A+ B+ C- Dと記入する。 ７ ヒートショック：冷却による遺伝子の導入 緑・青チューブをチューブ立てに立て，ウオーターバス（42℃）に，50秒 浸ける。 50秒後すぐに，氷に戻し2分間冷やす。温度変化により，DNAを閉じ 込める。 DNAの細胞膜を通り 抜ける割合を増加さ せている。 ８ 氷中から緑・青チューブを取り出し，LB培地（液 体）をそれぞれ250μLずつ加える。 緑・青チューブの中身は全く異な るものになっている。 LB培地を加えるときは別々のピ ペットを使用する。 ヒートショックで弱っ た大腸菌に栄養を与 える。 ９ 10分間室温で放置する。 10 形質転換した大腸菌を培地に移し，培養する。 緑・青チューブをタッピン グして溶液を混合する。 （大腸菌がチューブ内に 沈んでいるため） 各チューブの大腸菌を以下のよ うに各培地に滴下する。 【緑チューブ（＋DNA）】 LB/amp （A） LB/amp/ara （B） 【青チューブ（－DNA）】 LB （C） LB/amp （D） 11 滴下した大腸菌の塗布。 新しい植付け用ループを使い大 腸菌サンプルを広げます。ルー プの輪の部分を培地表面と平 行に滑らせるように、手早く、プ レート表面にできるだけ広い範 囲に広げたら、蓋を閉めます。 操作はプレート１枚ず つ行い，新しいプレー ト毎に，新しいループ を使用すること。 12 37℃のインキュベーターで1週間培養する。 ラップで包んだ状態で30 分程度置いておきます。 その間に，培地に大腸菌 がなじみます。 プレートは上下逆にして， インキュベーターにいれ ます。 上下逆にすることで，蓋 からの菌や水滴の落下に よるコンタミネーションを 防ぐことができます。 結果の一例を表示します。 培養条件 37℃ (A) ＋DNA 培養期間 3～4日 LB/amp コロニ－ 346個 蛍光 無 (C) －DNA LB／amp コロニ－ 0個 蛍光 無 （B） ＋DNA LB／amp／ara コロニ－ 440個 蛍光 有 （D） －DNA コロニ－ 蛍光 無 LB ∞個 実験前後には，手を70%エタノールで消毒する。この時 実験台も拭き，それが乾いてから実験を開始する。 チューブの持ち方，ループやピペットの取り出し方など， 器具の取扱いに気をつける。 各実験段階で，大腸菌の状態を把握しておく。 使用した使い捨て器具・試薬は机の上などに置かず， 所定のゴミバックに入れる。大腸菌に触れなかったもの は普通ゴミとして処分する。 皮膚や衣類が，万が一大腸菌に触れた場合は70%エタ ノールで殺菌して，水で洗い流す。 実験室の扉・窓は閉じておく。 白衣の着用。 実験前 ・形質転換用溶液（Bu），LB培地，ﾌﾟﾗｽﾐﾄﾞ溶液は氷冷しておく。 実験中 ・植付け用ループやピペットの取り換えに注意する。 ・ヒートショックの時間を厳密に計る。 ・大腸菌の状態を考え，タッピングをむやみに行わない。 実験後 ・使用した器具・試薬の処理。 ・実験終了後は，手・机上をアルコール消毒する。 DNAリガーゼ：組み込んだDNAを組み込まれたDNAと結合させる酵素。 Green Fluorescent Protein：Green Fluorescent Protein（GFP）は生 物蛍光を発するオワンクラゲ、Aequreavictoriaから単離されたタンパク質 です。GFP遺伝子は最近になってクローン化されました。特徴的な構造ゆえ に、紫外線を照射するとそのエネルギーを吸収し、吸収されたエネルギーは 緑色のきれいな光となって放出されます。 pGLO：GFP遺伝子とアンピシリン耐性であるβ-ラクタマ－ゼ遺伝 子を含むプラスミド。 アラビノース：甘味料の１種。バクテリアが通常食物として利用する。 アンピシリン：抗生物質の１種。 形質転換用緩衝液 ：形質転換用緩衝液 （50mM CaCl2、 pH7.4）中のCa2+イオンがDNA（plasmid）の負電荷（リン酸基を 持つため）を中和し、同じく負電荷を持つ、細胞膜のリン脂質との 静電的反発をやわらげます。そして、DNAは細胞膜の外側から内 側に通り抜けることができるのです。 コロニー：寒天培地上で生育した、同じ遺伝子を持つ細胞の凝集 塊。一つのコロニーにあるすべての細胞は同じ遺伝子を持つので、 クローンと呼ばれます。 培地：液体や寒天（LB）培地は，バクテリアの生育をサポートする 固形物質。炭水化物やアミノ酸、ヌクレオチド、無機塩類、ビタミン を含みます。 ヒートショック：ヒートショックを与えることにより、DNAの細胞膜を通り 抜ける割合が増加します。細胞の種類により異なります。 プラスミド：細菌などに存在する主のDNAとは別のDNA。環状の DNAで、自己複製ができます。抗生物質耐性タンパク質やGFPの ようなクローン化された他の生物の遺伝子を組み込むことがでま す。 ベクター：運び屋DNA。今回のプラスミドのように、他の生物からの DNA断片を組み込まれ、宿主となる細胞に導入される、自己複製す るDNA分子。 ピペット：使い捨てピペットは，減菌した状態で１本ず つ袋に入っている。直前に袋から出し使用する。 100μL～1mLを採集できる。 ループは，減菌した状態で袋に入っている。直前に袋 から出し使用する。 菌を塗布するときは，ループ先の輪の部分を培地表 面と平衡に滑らせるように，手早くプレート表面をでき るだけ広範囲に広げる（右図）。 裏返して数える。 コロニー数が多い場合，4等分(8等分)してサインペンでマークして いく。それぞれ30～50個までは数えられ，4倍(8倍)する。 右端図のように全面に生えている場合は∞とする。
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![平成 27 年 5 月 14 日 [神戸大学大学院農学研究科] 李智博准教授が](http://s1.expydoc.com/store/data/006070707_1-3e6fd1585bf925076db6363e411c729d-250x500.png)
