血液中のPCB全異性体分析平井哲也*，藤峰慶徳*，中野武** *：大塚製薬株式会社大塚ライフサイエンス事業部 EDC分析センター **：兵庫県立環境健康科学センターはじめに PCBは生物学的に安定かつ生体内の脂肪に蓄積されやすい事から過去に使用され環境中に放出されたPCBが食物連鎖を通じてヒトに蓄積されている．毒性としては，コプラナーPCBにおいてダイオキシン類としての毒性がある．しかし，TEFを持たないPCBについてもダイオキシン類毒性とは異なる内分泌撹乱作用があるとの報告もある． PCB分析用に開発されたHT8-PCBカラムを用い HRGC/HRMSにてヒト血液中PCB 全異性体分析を行った．インフォームドコンセントの得られた健常人血液 (n=24，男女各12名，年齢25～46才)を用いて分析を行い，健常人血液中に検出した異性体の解析と臨床検査との相関関係について検討を行ったので報告する．血液からのPCB抽出・クリーンアップ Blood 15 ml 2 M-KOH/Ethanol 10 mL 13C -PCBs 12 Internal standard solution 脂肪抽出（加算法） Serum 0.5ml Shaking 120 min Kit Method Ethanol 4 mL Water* 8 mL n-Hexane 15 mL Weigh at lipid Hexane phase Water phase Extraction with n-Hexane 15 mL under shaking 30 min n-Hexane phases (2 times) are set to one Washing up by water* 10 mL(x2) *:Water was washed up by n-Hexane Dehydration by Sodium sulfate anhydrous and concentrate Multilayer silica gel column chromatography 10%DCM / n-Hexane (V/V) 100 mL HRGC/HRMS measure （AutoSpec-Ultima） 13C -PCBs 12 syringe spike solution PCBs are concentrated to 40μL under nitrogen gas in GC vial. The Conditions of Measurement Method for PCBs Instruments HRGC / HRMS HP6890series (Hewlett Packard) / AutoSpec-Ultima ( micromass ) Analysis conditions Injection Temp. 290 ℃ Flow 1 ml / min. (constant flow) Column HT8-PCB (Kanto Chemical Co., INC.,) 60 m x 0.25 mm I.D. Oven Temp. mono ~ penta 120 ℃ ； 20 ℃ / min.；180 ℃，0 min.； 2 ℃ / min.； 252 ℃ ； 50 ℃ / min.；310 ℃ ，5 min. hexa ~ deca 120 ℃ ； 20 ℃ / min.；180 ℃，0 min.； 2 ℃ / min.； 260 ℃ ； 5 ℃ / min.；310 ℃ ，5 min. Interface Temp. 290 ℃ Source Temp. 280 ℃ Electron Energy 35 eV Resolution 12000 Monitor Ions of PCB analysis Table Monitor ions of PCB analysis 12 Congener Mono CBs Di CBs Tri CBs Tetra CBs Penta CBs Hexa CBs Hepta CBs Octa CBs Nona CBs Deca CBs 12 C 12 13 C 12 C 12 m/z m/z type m/z m/z type m/z m/z type 188.0393 222.0003 255.9613 289.9224 325.8804 359.8415 393.8024 427.7635 461.7246 497.6826 M 190.0363 223.9974 257.9584 291.9194 327.8775 361.8385 395.7995 429.7606 463.7216 499.6797 M+2 200.0795 234.0406 268.0016 303.9597 337.9207 371.8817 405.8428 441.8008 475.7619 509.7229 M M M M M+2 M+2 M+2 M+2 M+2 M+4 M+2 M+2 M+2 M+4 M+4 M+4 M+4 M+4 M+6 M M M+2 M+2 M+2 M+2 M+4 M+4 M+4 BZ Number （ Ballschmiter K and Zell M , 1980 ) Penta CBs 2,3,3',4',5-Penta CB 2,3,3',4,5'-Penta CB 2,3,3',4,6-Penta CB 2,2',3,3',4,5,6,6'-Octa CB Octa CBs 2,2',3,3',4,5',6,6'-Octa CB 2,2',3,3',4,5,5',6'-Octa CB BZ # IUPAC # 107 108 109 199 200 201 109 107 108 200 201 199 脂肪重量測定：The adding method（加算法）* TL = 1.69 × (TC - FC) + FC + PL + TG TL : Total lipid TC : Total cholesterol FC : Free cholesterol PL : Phospholipid TG : Triglyceride 40 30 y = 0.871x + 3.09 R= 0.94 20 10 10 n=32 20 30 2003年環境化学討論会望月氏発表データ 40 TEQ concentration by the adding method (pgTEQ/g-lipid) 脂肪抽出法（暫定マニュアル法（ヘキサン抽出）と加算法（Kiｔ））の違いによる血中ダイオキシン類測定値（pg/TEQ/g-lipid）の相関 * : H. Kobayashi, Medical technology, 12(8): 1004～1007, 1980 健常人血液中PCB測定結果（1~5塩素） BZ# Total-MonoCB #15 #11 Total-DiCB #37 #18 #20,33 #22 #36 #38 #32 #28 #31 Total-TriCB #77 #81 #44 #49 #52,69 #47,48 #60 #63 #58 #55 #70 #64 #42 #72 #68 #74 #43 #59 #40 #53 #66 Total-TetraCB Numbers of N.D. 20 11 16 6 5 8 16 23 19 0 1 21 19 0 20 0 0 1 11 19 14 1 9 10 17 1 0 4 20 20 20 0 Mean S.D. (pg/g-lipid) 8.3 0.9 22.5 28.6 13.6 23.6 3.1 2.8 14.3 13.0 14.3 3.6 10.1 2.7 16.3 12.9 681.9 5.9 4.0 993.0 413.9 29.4 15.7 1086.1 481.5 5.0 1.2 7.3 4.3 82.4 44.7 178.6 125.2 423.4 440.4 215.1 92.2 285.7 111.7 66.5 40.2 19.3 5.9 17.2 7.7 42.3 16.2 43.5 11.6 14.3 4.1 43.7 38.8 57.3 23.6 4524.6 2797.2 86.8 65.3 9.1 1.2 10.3 2.0 10.9 2.7 1109.9 557.1 6929.5 3062.7 BZ# Numbers of N.D. #105 #114 #118 #123 #126 #92 #85 #86,97, 117 #87,115 #93,95, 98,102 #99 #101 #107,108 #110,120 #83 #109 #103 #90 #91 #119 #113 #89 #121 #111 Total-PentaCB 0 0 0 0 1 0 1 分析使用血液量 (g) 加算法脂肪重量(mg) Mean S.D. (pg/g-lipid) 1517.9 578.3 666.4 316.4 6896.0 2927.8 115.4 50.1 50.1 20.0 301.3 182.1 81.3 41.2 0 297.5 142.2 0 147.5 54.8 0 331.1 167.0 0 0 0 0 5 23 23 22 18 10 17 23 5 2 4711.0 846.9 390.0 261.9 72.3 20.4 10.5 325.1 25.3 43.1 30.3 165.6 43.0 64.6 16834.7 2091.3 548.5 230.2 111.6 28.4 212.9 14.9 18.1 7.5 19.1 29.9 6073.1 15.8 97.9 0.4 24.2 健常人血液中PCB測定結果（6~10塩素） BZ# Numbers of N.D. #155 #156 #157 #167 #169 #128 #130 #133 #135 #137 #138 #132 #134 #154 #136 #129 #165 #141 #147 #148 #146 #149 #151 #153 #159 #162 #158 #163,164 #166 Total-HexaCB 5 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 21 5 0 1 1 3 0 0 21 0 0 0 0 5 5 0 0 0 Mean (pg/g-lipid) 12.4 2830.9 699.9 963.6 47.1 198.0 538.6 460.5 134.4 743.1 10449.6 89.8 14.2 59.9 35.4 315.8 50.9 90.9 174.1 7.0 4079.7 271.7 394.5 27998.2 16.5 42.5 237.4 6387.4 109.2 57329.5 S.D. BZ# Numbers of N.D. 8.3 1481.4 351.8 506.0 23.1 109.8 219.2 217.2 52.6 340.5 4618.3 38.5 4.8 34.3 16.5 197.7 27.9 41.4 87.2 3.1 1855.1 121.1 175.2 14015.3 8.5 23.7 97.1 3080.6 56.7 26601.5 #188 #189 #170 #171 #172 #174 #175 #176 #177 #178 #181 #179 #180 #182,187 #183 #184 #185 #192 #190 #191 Total-HeptaCB #202 #205 #194 #195 #199 #197 #201 #200 #196,#203 Total-OctaCB #206 #208 #207 Total-NonaCB #209 Total-DecaCB 10 0 0 0 0 0 1 15 0 0 3 0 0 0 0 9 14 19 0 0 Total-PCBs 0 0 0 0 8 3 0 15 0 0 0 0 0 Mean (pg/g-lipid) 7.2 319.0 3825.6 501.9 753.6 88.1 107.3 6.4 1363.8 1528.5 20.6 103.0 14856.4 8301.4 1776.2 11.0 12.3 7.5 965.3 208.6 34732.6 792.5 93.1 1857.2 405.6 1739.4 52.7 1074.3 137.9 1924.4 7404.5 508.2 203.9 106.4 818.5 344.5 344.5 3.0 161.6 2072.9 257.0 387.4 36.6 54.2 1.5 626.2 818.3 9.9 43.5 8299.1 4246.7 888.2 3.4 5.9 3.6 533.5 109.7 18179.4 453.2 45.6 1122.1 241.7 1105.6 95.2 1559.9 64.6 1090.7 4265.3 255.9 110.6 51.7 413.5 163.3 163.3 125.5 56745.1 (ng/g-lipid) S.D. 健常人血液中のPCB測定結果（主異性体・総濃度） Congener BZ# 2,4,4',5-TetraCB Levels ( ng / g-lipid ) 01 02 03 04 05 06 07 08 09 10 11 12 #74 7 4 5 3 6 2 4 2 3 2 2 8 2,3',4,4',5-PentaCB #118 8 8 8 3 8 4 10 3 5 4 7 6 2,2',4,4',5-PentaCB #99 8 6 7 3 9 2 3 2 4 3 3 4 2,2',3,4,4',5'-HexaCB #138 16 12 12 6.5 19 5 8 6 7 6 5 14 2,2',3,4',5,5'-HexaCB #146 4 4 7 1.5 7 2 4 2 3 3 2 5 13 57 11 22 15 18 18 13 41 2,2',4,4',5,5'-HexaCB #153 31 30 35 2,3,3',4',5,6- / 2,3,3',4',5',6-HexaCB #163,164 7 7 9 3 10 3 6 4 5 4 3 9 2,2',3,3',4,4',5-HeptaCB #170 3 4 4 0.9 8 2 3 2 2 3 1 6 2,2',3,4,4',5,5'-HeptaCB #180 12 16 17 5 32 7 13 8 8 12 5 24 2,2',3,4,4',5,6'- / 2,2',3,4',5,5',6-HeptaCB #182,187 7 9 12 3 17 3 7 4 6 7 4 11 140 143 163 54 228 59 104 66 86 85 65 169 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 Total PCBs Levels ( ng / g-lipid ) Congener BZ# 2,4,4',5-TetraCB #74 5 8 3 3 2 9 3 6 4 8 5 2,3',4,4',5-PentaCB #118 9 8 4 5 3 13 4 9 4 12 2,2',4,4',5-PentaCB #99 4 7 3 4 3 5 2 6 3 2,2',3,4,4',5'-HexaCB #138 10 16 7 7 7 15 5 12 2,2',3,4',5,5'-HexaCB #146 4 5 4 3 3 6 2 Mean S.D. 12 5 3 9 11 7 3 7 8 6 5 2 6 15 16 18 10 5 4 2 7 7 7 4 2 2,2',4,4',5,5'-HexaCB #153 25 34 21 20 21 47 13 29 14 45 46 53 28 14 2,3,3',4',5,6- / 2,3,3',4',5',6-HexaCB #163,164 6 8 6 4 5 11 3 6 4 11 10 14 6 3 2,2',3,3',4,4',5-HeptaCB #170 4 5 3 3 3 8 1 4 2 6 7 7 4 2 2,2',3,4,4',5,5'-HeptaCB #180 14 16 11 10 13 31 6 13 6 23 26 28 15 8 2,2',3,4,4',5,6'- / 2,2',3,4',5,5',6-HeptaCB #182,187 7 9 8 6 7 14 3 8 3 13 14 16 8 4 120 154 96 93 91 214 63 129 67 201 200 220 125 57 Total PCBs ＃28 Tri-CBs ＃31 Tetra-CBs ＃74 ＃80 Penta-CBs ＃118 ＃99 ＃153 Hexa-CBs ＃163/ ＃164 Hepta-CBs ＃182/187 ＃138 ＃180 ＃170 健常人PCB血液クロマトグラム（3~7塩素） Levels of the predominant PCB congeners in human blood (n=24) Congeners Mean±2S.D. Existence Ratio* (BZ#) (ng /g-lipid) (%) #153 #180 #138 #182,187 #118 #163,164 #99 #74 #146 #170 #156 Sum 28.0±28.0 14.9±16.6 10.4±9.2 8.3±8.5 6.9±5.9 6.4±6.2 4.7±4.2 4.6±2.6 4.1±3.7 3.8±4.1 2.8±3.0 22.3 11.8 8.3 6.6 5.5 5.1 3.8 3.6 3.3 3.0 2.3 75.6 * Mean is compare to total PCBs level 存在比率(%) 50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 1 2 3 4 5 6 塩素数 7 8 9 健常人血液中P C B 塩素数別存在比率 10 PCB異性体濃度と臨床検査結果との相関係数臨床検査：年齢・性別・遊離T3 ・遊離T4 ・ TSH ・遊離コレステロール・総脂質・リン脂質・中性脂肪・総コレステロール総P C B #153 #180 #118 #138 #74 #99 #146 #170 0.605** 0.578** 0.437* 0.573** 0.505* 0.509* 0.604** 0.621** 0.600** 0.609** 0.001 0.002 0.003 0.033 0.003 0.012 0.011 0.002 0.001 0.002 0.002 24 24 24 24 24 24 24 24 24 24 24 0.480* 0.502* 0.155 0.445* 0.338 0.297 0.31 0.444* 0.369 0.456* 0.038 0.018 0.012 0.470 0.029 0.107 0.158 0.140 0.300 0.076 0.025 24 24 24 24 24 24 24 24 24 24 24 年齢 P earsonの相関係数 0.620** 有意確率（両側） N TSH P earsonの相関係数 0.425* 有意確率（両側） N **　相関係数は1%水準で有意（両側）です。 *　相関係数は5%水準で有意（両側）です。 #163,164 #182,187 まとめ・HRGC / HRMSとHT8-PCB カラムを用いてPCB全異性体分析を行い健常人血液中PCB異性体の解析を行った. 血液中の主要なPCB異性体は2,4,5-位に塩素が置換したもの（#153,138,118,180,187,74,99）を高濃度に検出した. ・血液中総PCB濃度と主異性体について年齢・臨床検査結果との相関係数について解析した． ① 年齢については解析したすべての異性体で有意な正の相関関係を認めた. ② TSHについても総PCBと数種異性体において若干正の相関関係を認めた. ③ 他の臨床検査値とは，特に相関を認めなかった．