絶対値発光量測定法とホタルの量子収率東大物性研A, CREST・JSTB, アトーC, 産総研D, 静岡大E 安東頼子A,B, 山田展之C, 入江勉C, 榎本敏照C, 久保田英博B,C 丹羽一樹E, 近江谷克裕D,E, 秋山英文A,B Motivation • ホタルルシフェリン発光量子収率初報告 88±25% (pH 7.6) by Seliger & McElroy in 1969 H. H. Seliger, W. D. McElroy, Arch. Biohem. Biophys, 88, 136 (1969). この値を出した実験に用いられたサンプルが劣化（ラセミ化）していた可能性がある事を同じグループが後に報告している。しかし、現在まで追試が行なわれてこなかった。 • ホタルルシフェリンBioluminescenceの発光色決定機構については諸説あるが、まだ解明されていない発光スペクトルがpHやホタルルシフェラーセ（酵素）の種類によって変化する → 発光量子収率を測定 → 発光スペクトルの定量解析により、発光色決定機構に関するインフォメーションを得る Outline ホタルルシフェリン Bioluminescence • • • • 発光量子収率 Photon Yield スペクトル発光スペクトル pH依存性の定量解析発光減衰時間絶対値発光量測定 • セルの集光効率較正法 Measurements 溶液からの生物・化学発光絶対値発光量測定系測定系の較正 ①セルの集光効率 ②測定系のスループット ③検出器の絶対感度ホタルルシフェリン発光過程 Concentration（Ｍ) Mg2+ LH2 + ATP + LUC LUC・LH2-AMP + PPi LUC・LH2-AMP + O2 → LUC・AMP・Oxyluciferin* + CO2 LUC・AMP・ Oxyluciferin* → LUC + Oxyluciferin + AMP + hν M. DeLuca, Firefly luciferase, Adv. Enzymol. 44, 37 (1976). B.R. Branchini, et al., J. Ame. Chem. Soc., 43, 7255 (2004). Volume（μｌ） Luciferin (LH2) 1.0×10-7 5 Luciferase (LUC) 2.0×10-5 5 MgSO4 0.1 5 ATP 1.0×10-3 50 Buffer Tris 0.1 GTA 0.3 Glycylglycine 0.025 35 ＊発光基質ルシフェリンに対して、酵素、 ATP等が大過剰になっている。発光量子収率 pH依存性発光量子収率 = 放出された総フォトン数 / ルシフェリン分子数 Tris QY± 測定のバラツキ pH 8.5 40.7 ± 1.1 % pH 8.1 40.1 ± 1.0 % ＊測定系較正での誤差の見積もり ±18％発光量子収率 40.7 ± 7.3 % (pH 8.5) Photon Yield スペクトル＊縦軸は光子数（/eV）を表す。スペクトルを積分し、その値を分子数で割った値が量子収率である。 peak a peak b peak c Peak Energy 2.2 eV (560nm) 2.0 eV (620nm) 1.85 eV (670nm) ホタルルシフェリンの発光スペクトルは 3成分のガウス分布によって再現出来る発光スペクトル定量解析 Peak Energy 半値全幅量子収率 Total 量子収率 (QY) pH依存性あり Peak a QY Peak b QY pH依存性殆ど無し Peak c QY Total QYの pH依存性は peak a 成分由来発光減衰時間 pH依存性発光減衰 • pH • Luciferase, ATP, Mg2+ 濃度 • Bufferの種類によって発光減衰時間は著しく変わる。一方、量子収率はpHに依存する。発光減衰時間それぞれを決定する要因発光減衰時間→上記によって決まる反応時間量子収率 → オキシルシフェリンの発光効率 pH依存性発光スペクトルshape pH依存性規格化発光スペクトル pH 7.8 – 8.9 “Yellow-green emission” pH 6.5 – 7.5 pHの減少と共にpeak a成分が減少 pH < 6.0 “Red emission” 発光色決定機構に関係する事 •pH 7.8 – 8.5は Peak a 成分が最も発光収率が高い領域である •pHが下がるごとに peak a 成分の発光に阻害が掛かるのか?! •pH 6.0付近では Red emission のみの発光が観測される発光色決定の諸説 • モノアニオン・ジアニオン説発光生成物オキシルシフェリンの励起一重項状態モノアニオン → Red emission ↑↓±H+ O ジアニオン → Yellow-green emission - McCapra, R. and D. G. Richardson, Tetrahedron Lett., 3167-3172 (1964). N S ＊ S N H+ S -O O S ＊ N Keto-form N enolate-form • 回転角説 C2-C2’ bondの回転によって発光色が変わる MaCapra, F., Gilfoyle, D. J., Young, D. M., Church, N. J., Spencer, P., Bioluminescence and Chemiluminescence, John Wiley & Sons, p387 (1994). N Φ -O S S ＊ N O Twisted keton • オキシルシフェリンのpolarization説 Luciferaseに取り込まれているオキシルシフェリンの電子状態によって決まる Ugarova, N. N., Brovko, L. Y., Luminescence, 17, 321 (2002). etc… O- 集光効率較正用セル様々なセルの集光効率集光効率液量依存性 Cell type Color h(%) Platelet cell Clear 0.258 Acrylate tube cell Clear 0.26 ± 0.01 Clear 0.18 ± 0.02 Black 0.15 ± 0.02 White 1.7 ± 0.2 384-well microplate ＊色が付いているセル（white, Black等）は反射率波長依存性を考慮する必要あり＊348-well microplate → full : 100ul まとめ • ホタルルシフェリンの量子収率は、ｐＨ 8.5, 8.0 付近で最も高い値を示し、 40.7±7.3% (Tris pH8.5) であった。 • 量子収率はｐＨの減少と共に値が小さくなり、ｐＨ 5.5以下では発光が見られなくなる。 • Photon Yield スペクトル測定により、スペクトル変化のｐＨ依存性と定量的に解析する事が出来た。その結果､2.2eV付近にピークをもつ発光成分のｐＨ依存性が量子収率、スペクトル変化に影響を与えている事が分かった。 • 発光減衰時間を決めている要因と、量子収率を決めている要因は別である。量子収率は、オキシルシフェリンの励起発光効率によって決まる。