細胞と多様性の生物学第７回細胞外からの情報が核に伝わる和田勝東京医科歯科大学教養部外部の情報が細胞内へ前回はホルモンを例に取り、細胞の外からの情報が、セカンドメッセンジャーを介して代謝の調節をしたり（水溶性ホルモン）、転写の調節をしている（脂溶性ホルモン）ことを学んだ。ちょっと復習脂溶性ホルモンの作用機構Ｚｎフィンガーホルモン応答エレメント（HRE) ５’-AGGTCAnnnTGACCT-３’ 脂溶性ホルモンの作用機構ステロイドホルモンが受容体に結合 HspがはずれてDNA結合部位が露出ニ量体となってDNAのHREに結合下流の遺伝子の転写を促進タンパク質合成ふたたび転写について前回はホルモンを例に取り、細胞の外からの情報が、セカンドメッセンジャーを介して代謝の調節をしたり（水溶性ホルモン）、転写の調節をしている（脂溶性ホルモン）ことを学んだ。ちょっと復習遺伝子と形質形態遺伝子タンパク質機能タンパク質をコードする独立した遺伝子がある。遺伝子は相同染色体上にペアで存在する。遺伝子と形質優性の遺伝子は機能的なタンパク質をコードしているが、劣性の遺伝子は機能が無いタンパク質をコードしている。したがって、ヘテロであれば劣性の形質は現れないが、劣性ホモだと現れる。 (注）これはもっとも単純な場合で、実際はもっと複雑である。遺伝子の発現ふたたびセントラルドグマ実際に転写しているのは RNAポリメラーゼによる転写 RNAポリメラーゼというタンパク質がDNAと結合して転写をしている。DNAとタンパク質の結合？原核生物の転写調節 DNAには、転写の開始と終了を示す部位が存在する。 RNAポリメラーゼ着地点転写の方向 RNAポリメラーゼのプロモータ領域への着地の仕方によって、転写の方向性が決まる。実際は鋳型鎖の３’→５’を転写しているのだが、結果としてはコード鎖を５’→３’に読んだものが mRNAとなる。プロモータ領域による転写の方向性が決まれば、鋳型鎖を無視してコード鎖だけを考えればいい。そこで川の流れにたとえて、コード鎖の５’側を上流、３’側を下流という表現が使われる。 lacオペロン原核生物の遺伝子は、機能的に関係あるタンパク質をコードする領域が複数、連なっている。これをオペロンという。lacオペロンは、ラクトースを分解するβガラクトシダーゼとその他2つの酵素タンパク質をコードする領域からなり、さらにその上流にオペレータ部を含むプロモーター部位がある。リプレッサーによる転写阻害 lacオペロンのプロモーター部のさらに上流にある調節遺伝子が常にリプレッサータンパク質を作るように指令している。リプレッサータンパク質はオペレータ部位に結合してRNAポリメラーゼの結合を阻害する。ラクトースによるリプレッサーの不活化ラクトースはリプレッサータンパク質と結合してリプレッサータンパク質を不活性化する。転写のスイッチィングこの方式は、ふだんは転写スイッチをオフにしておき、必要に応じてオンにする方式。ラクト－スしか無い環境では、ラクトースをグルコースに変える酵素が必要になり、スイッチをオンにする。 trpオペロン trpオペロンの調節遺伝子が常に不活性なリプレッサータンパク質を作るように指令している。そのため、トリプトファン合成の代謝系は稼動している。トリプトファンによるリプレッサーの活性化最終産物であるトリプトファンがリプレッサーを活性化する。転写のスイッチィングこの方式は、ふだんは転写スイッチをオンにしておき、必要に応じてオフにする方式。ふだんは必要なトリプトファン合成の代謝系を稼動させているが、最終産物であるトリプトファンがだぶつくと、スイッチをオフにする。細菌と真核生物の遺伝子真核生物の遺伝子は全DNAのホンの一部、しかもコード領域が連続していない。ヒトβヘモグロビンの遺伝子プロモータ領域翻訳開始 CCCTGTGGAGCCACACCCTAGGGTTGGCCAATCTACTCCCAGGAGCAGGGA GGGCAGGAGCCAGGGCTGGGCATAAAAGTCAGGGCAGAGCCATCTATTGCT TACATTTGCTTCTGACACAACTGTGTTCACTAGCAACCTCAAACAGACACC ATGGTGCACCTGACTCCTGAGGAGAAGTCTGCCGTTACTGCCCTGTGGGGC AAGGTGAACGTGGATGAAGTTGGTGGTGAGGCCCTGGGCAGGTTGGTATCA AGGTTACAAGACAGGTTTAAGGAGACCAATAGAAACTGGGCATGTGGAGAC AGAGAAGACTCTTGGGTTTCTGATAGGCACTGACTCTCTCTGCCTATTGGT CTATTTTCCCACCCTTAGGCTGCTGGTGGTCTACCCTTGGACCCAGAGGTT CTTTGAGTCCTTTGGGGATCTGTCCACTCCTGATGCTGTTATGGGCAACCC TAAGGTGAAGGCTCATGGCAAGAAAGTGCTCGGTGCCTTTAGTGATGGCCT GGCTCACCTGGACAACCTCAAGGGCACCTTTGCCACACTGAGTGAGCTGCA CTGTGACAAGCTGCACGTGGATCCTGAGAACTTCAGGGTGAGTCTATGGGA CCCTTGATGTTTTCTTTCCCCTTCTTTTCTATGGTTAAGTTCATGTCATAG GAAGGGGAGAAGTAACAGGGTACAGTTTAGAATGGGAAACAGACGAATGAT TGCATCAGTGTGGAAGTCTCAGGATCGTTTTAGTTTCTTTTATTTGCTGTT CATAACAATTGTTTTCTTTTGTTTAATTCTTGCTTTCTTTTTTTTTCTTCT CCGCAATTTTTACTATTATACTTAATGCCTTAACATTGTGTATAACAAAAG GAAATATCTCTGAGATACATTAAGTAACTTAAAAAAAAACTTTACACAGTC TGCCTAGTACATTACTATTTGGAATATATGTGTGCTTATTTGCATATTCAT AATCTCCCTACTTTATTTTCTTTTATTTTTAATTGATACATAATCATTATA CATATTTATGGGTTAAAGTGTAATGTTTTAATATGTGTACACATATTGACC AAATCAGGGTAATTTTGCATTTGTAATTTTAAAAAATGCTTTCTTCTTTTA 紫色はエキソン１，２，３ ATATACTTTTTTGTTTATCTTATTTCTAATACTTTCCCTAATCTCTTTCTT TCAGGGCAATAATGATACAATGTATCATGCCTCTTTGCACCATTCTAAAGA 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ACAGGGGGCATGGTTTGACT…… 間にはさまれた白色はイントロン１，２翻訳終了転写とmRNAの修飾１）転写開始部位から終了部位まで転写される。この配列には、エクソン、イントロンとともに翻訳されない塩基配列を両端に含む。２）５’側に７－メチルグアノシン（Cap）構造が、３’ 側に100－250個の連続したＡ（ポリＡテイル）が付加される。３）イントロン部分がスプライシング酵素によってつまんで切られる（スプライシング、splicing）。４）完成したｍＲＮＡ（成熟ｍＲＮＡ）が核膜孔からサイトゾールへ出る。転写とmRNAの修飾真核生物の転写調節真核生物では、転写の開始に転写基本因子が不可欠で、たくさん見つかっている。これらの基本転写因子がプロモーター部に結合して複合体を作ると、RNA ポリメラーゼが結合できるようになる。真核生物の転写調節これ以外に、遺伝子調節タンパク質（リプレッサーとアクチベーター）が、転写開始に影響を及ぼす。これらはかなり離れた位置にある場合もある。原核生物ではDNAは裸だが、真核生物ではDNAはクロマチン構造をとっている。真核生物の転写調節原核生物よりかなり複雑ホルモンの作用機構ステロイドホルモン-受容体複合体は、遺伝子調節タンパク質として働く。水溶性ホルモンは、膜タンパク質である受容体に結合し、細胞内にセカンドメッセンジャーを作り、これが最終的に代謝経路を動かす酵素を活性化（スイッチをオンに）することによって、細胞の働きを調節している。ホルモンの作用機構外部の情報が細胞内へ（２）これとは逆に、セカンドメッセンジャーを介して転写の調節する、また脂溶性ホルモンが膜受容体を介して代謝の調節などをnon-genomicにおこなうことができることがわかってきた。転写のスイッチィングインシュリン受容体インシュリンが結合細胞内へ情報が伝わる受容体チロシンキナーゼ細胞内シグナルタンパク質を活性化するチロシンがリン酸化され二量体型のシグナル分子が結合すると受容体チロシンキナーゼ不活性型Rasタンパク質を活性型に変える Rasタンパク質はras遺伝子の産物で単量体 GTP結合タンパク質の一つ受容体チロシンキナーゼ活性化したRasタンパク質は、マップキナーゼリン酸化カスケードを刺激する最終のマップキナーゼは、さまざまなタンパク質をリン酸化して、活性化する。この中には、さまざまな遺伝子調節タンパク質が含まれる。リン酸化反応の相互作用これまで述べてきたリン酸化酵素、A キナーゼ、Cキナーゼ、CaMキナーゼ、マップキナーゼは、相互に作用し合って、複雑な「網」を形成している。細胞は、これらの多数のシグナルを受け取って適切に反応しているようだ。ステロイドホルモン膜受容体ステロイドホルモンは、細胞質にある受容体に結合して、核内へ入り転写の制御をするだけでなく、膜タンパク質受容体があって、転写を伴わない（ non-genomic）な作用をしているらしいことがわかってきた。ステロイドホルモン膜受容体プロゲステロンやアルドステロンなどの例が報告されているが、まだ不明な点が多い。ここではこれ以上触れないが、、、先日、プロゲステロン膜受容体 http://www.utmsi.utexas.edu/people/staff/thomas/P NAS_2003.pdf プロゲステロン膜受容体 (a) Northern blot analysis showing mRNA expression in ovarian (O, gel loading: 1mg) and other tissues (gel loading: 5mg); B, brain; T, testis; P, pituitary; H, heart; K, kidney; L, liver; S, stomach; I, intestine; G, gill; M, muscle. (c) Cellular localization of receptor by Western blot analysis using stmPRapAb1 antibody (gel loading: 10 mg). OC, oocyte cytosol; OM, oocyte membrane; Folli., follicle cell membrane; (b) Western blot analysis of solubilized ovarian membrane proteins using monoclonal antibody PR10-1. I, plasma membrane; II, cytosol; III, partially purified membrane fraction used to generate monoclonal antibodies. (d) Folli., follicle cells; PM, oocyte plasma membrane; Cyt, oocyte cytoplasm. (Magnification: 1 cm ' 20 mm.). プロゲステロン膜受容体 http://www.pnas.org/cgi/reprint/0436133100v1 遺伝子工学以下にDNAを人為的に操作する遺伝子工学の手法などを説明しているが、他で学習していると思うので、広義では触れない。遺伝子工学特定の塩基配列（回文構造）を認識して切断する制限酵素が見つかった。上の例ではAAGCTTを認識して、右のように切断する。クローニング制限酵素で切断し、リガーゼでDNA 断片を挿入することができる。 DNAライブラリーゲノムDNAの断片をプラスミドベクターに挿入して、これを大腸菌に導入すると、ゲノムDNAライブラリーができる。プローブによるコロニーの検出目的とするDNA断片が導入されたコロニーを選び出す。 DNAライブラリー mRNAから逆転写酵素によって DNAにコピーし、これを DNAポリメラーゼで2本鎖にして組み込む。 PCR(polymerase chain reaction) DNAは加熱すると水素結合が切れて、一本鎖になる。 1組のプライマーと原料となるヌクレオチドを加え、DNAを合成させる。 PCR この操作を繰り返すと、倍々に増えていく。 DNA塩基配列の決定３’に水酸基がないジデオキシヌクレオシド三リン酸を使うと、５’→３’合成がとまる。 DNA塩基配列の決定ジデオキシヌクレオシド三リン酸を原料に少し混ぜて、DNAの合成反応を進める。ジデオキシヌクレオシド三リン酸が取り込まれたところで合成が止まった、いろいろな長さの DNA断片が生じる。 DNA塩基配列の決定４種の塩基でこれを行い、ゲル電気泳動する。４つのクロマトグラムを並べ、下から読んでいくと、それが延期の配列になる遺伝子操作こうして、ヒトゲノムの塩基配列は決定された。また遺伝子を使ったさまざまな応用分野が広がった。 ●発現ベクターに有用遺伝子を導入してタンパク合成をさせる ●遺伝子導入（transgenic)マウスの作成 ●ノックアウトマウスの作成 ●反復配列の長さによるDNA鑑定