遺伝子の解析 第2弾 DNAシークエンス法 DNAシークエンス （ABI PRISM３１０を用いて遺伝子の配列を読む） 原理 オートシークエンサー（ABI PRISM３１０）の反応では合成 されるDNAを蛍光物質で標識します。 その標識されたDNAを電気泳動し、泳動中にレーザー光を当て励起光を 自動で検出し、コンピューターで解析します。 ABI PRISM３１０について ABI PRISM３１０でのシークエンス反応はサイクルシークエンス法とよ ばれる方法で行っています。まず、PCR反応でA,G,C,Tそれぞれに、励 起する波長が異なる４種類の蛍光色素をｄｄNTPにつける方法（Dye Terminator法）を用い、その標識されたDNAフラグメントを内径５０μｍ のキャピラリー管のなかで電気泳動を行いA,G,C,Tそれぞれの蛍光を CCDカメラで検出し、塩基配列を読むことができます。 ～DNAシークエンスの流れ～ PCRにて目的のDNA量を増やす。（同時に蛍光標識も行 う） エタノール沈殿にて目的DNAの分離・精製 オートシークエンサーにて目的DNAの塩基配列の読 み取り デオキシヌクレオチド（ｄNTP）と ジデオキシヌクレオチド（ｄｄNTP） 塩 基 Ｐ OH デオキシヌクレオチド（dNTP） 塩 基 Ｐ H ジデオキシヌクレオチド（ddNTP） dNTPとddNTPはPCR法でそれぞれDNAの構成単位として利用されま す。違いは３´の位置の水酸基が水素基になっていることです。Nには A,T,G,Cの4種類の塩基が当てはまります。 dNTPとddNTPの伸長反応の違い Ｐ OH Ｐ Ｐ Ｐ OH Ｐ Ｐ Ｐ ５´末端 ５´末端 Ｇ A Ｃ T ３´末端 A Ｇ T T Ｇ A A T Ｃ T T dATPが 反応した場合 ３´末端 A Ｇ 続く ３´末端 Ｐ Ｐ Ｐ Ｐ Ｐ H Ｐ Ｐ Ｐ Ｐ Ｐ Ｐ Ｐ ５´末端 ddATPが 反応した場合 A Ｇ A A T Ｃ T T Ｇ ３´末端 Ｐ Ｐ Ｐ Ｐ 伸長反応はStop dNTPとddNTPが一緒にあるときに PCR反応をすると・・・・ dNTPをA,T,G,Cとし、ddNTPをA*,T*,G*,C*とする テンプレートDNA ５´ ３´ ACGTACG TGCATGC ３´ ５´ PCR反応 ５´ ３´ A* TGCATGC ５´ ５´ ３´ ACG* TGCATGC ５´ ５´ ３´ ACGTACG* TGCATGC ５´ ５´ ３´ ACGT* TGCATGC ５´ A*,T*,G*,C*が取り込まれると、そこで伸長反応が停止するので いろいろな長さ（分子量）のDNA断片が作られる Dye Terminator法 蛍光色素 ddNTPの４種類の塩基 （A,T,G,C）それぞれに異なっ た蛍光色素を標識することで 4種類のddNTPを見分けるこ とができる。 塩 基 Ｐ H A P H T P H G P H C P H 蛍光色素で標識することで・・・・・ ５´ ３´ ACA* TGTATGC ５´ ５´ ３´ ACT* TGAATGC ５´ ほぼ同じ長さ（分子量）だが これら４種類のDNAを ５´ ３´ ACG* TGCATGC ５´ ５´ ３´ ACC* TGGATGC ５´ 区別することができる ゲル電気泳動の分子ふるい効果 DNAは負電荷を持つ高分子なので全て＋極へ進みます。DNAの分 子量が小さいほど（短いほど）ゲルマトリックスとのふるわれ方が少な く、進みやすくなります。このように一定時間泳動すると分子量の差に よってDNAが分離されることを分子ふるい効果といいます。 ゲルマトリックス 高分子DNA 低分子DNA ＋ － Ex)塩基配列を知りたい（水色部分が知りたい部分）DNA ５´ ３´ ACGTACG TGCATGC ３´ ５´ Dye Terminator法を利 用してPCRをすると 出来上がったDNA断片 プライマー ５´ ３´ ５´ ３´ ACGT* TGCATGC ACGTA* TGCATGC ５´ ３´ ACGTAC* TGCATGC ５´ ３´ ５´ ３´ ５´ ５´ AC* TGCATGC ５´ ３´ ５´ ACGTACG* TGCATGC A* TGCATGC ５´ ３´ ５´ ５´ ５´ ACG* TGCATGC ５´ PCRで作られたDNA断片をポリマーを充填した（ゲルと同 様）キャピラリー管の中で電気泳動をすると ５´ ACGTACG* ５´ ACGTAC* ５´ ５´ ５´ ５´ ５´ ACGTA* ACGT* ACG* AC* A* － 分子ふるい効果 により短い断片 が早く＋極側へ 移動する ＋ 蛍光のついた塩基を早く＋極側についた順に並べると ACGTACG ５´ ３´ ACGTACG TGCATGC ５´ よって知りたかった塩基配列はACGTACGとなる 参考文献 改訂遺伝子工学実験ノート 羊土社 バイオ実験超基本Q&A 羊土社 実際のシークエンス結果（一部抜粋）
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