UNIVERSIDAD NACIONAL DE COSTA RICA
INSTITUTO TECNOLOGICO DE COSTA RICA
UNIVERSIDAD ESTATAL A DISTANCIA DE COSTA RICA
Doctorado en Ciencias Naturales para el Desarrollo
EFECTIVIDAD DE EXTRACTOS VEGETALES EN EL MANEJO
DE LA MONILIASIS (Moniliophthora roreri) DEL CACAO
(Theobroma cacao L.) EN MÉXICO
Sustentante:
MC. SANDRA ISABEL RAMÍREZ GONZÁLEZ
DIRECTOR
DR. ORLANDO LÓPEZ BÁEZ
Trabajo sometido a consideración del Tribunal Evaluador como
requisito al Grado de Doctora en Ciencias Naturales para el
Desarrollo, con énfasis en Sistemas de Producción Agrícolas
Universidad Nacional
Heredia, Costa Rica
2013
UNIVERSIDAD NACIONAL DE COSTA RICA
INSTITUTO TECNOLOGICO DE COSTA RICA
UNIVERSIDAD ESTATAL A DISTANCIA DE COSTA RICA
Sustentante:
MC. SANDRA ISABEL RAMÍREZ GONZÁLEZ
TRIBUNAL EXAMINADOR:
_____________________________________
Dr. Orlando López Báez
Universidad Autónoma de Chiapas – México
Director de Tesis
____________________________________
Dr. Tomás de Jesús Guzmán
Instituto Tecnológico de Costa Rica
Asesor
___________________________________
Dra. Sayra Munguía Ulloa
Universidad Nacional de Costa Rica
Asesora
___________________________________
Dr. Willy Soto Acosta
Representante del SEPUNA
___________________________________
Dr. Freddy Araya Rodríguez
Coordinador General del DOCINADE
Universidad Nacional. Heredia. Costa Rica
2013
2
DEDICATORIA
A Dios ….
por que sin él nada puede pasar en mi vida.
A mi familia …..
por su apoyo, paciencia y todo el cariño que me dan.
A mis dos grandes amores Orlando y Carolina….
Gracias por su comprensión y amor y por ser mi soporte y mi
inspiración para ser mejor cada día.
3
AGRADECIMIENTOS
A la Universidad Nacional de Costa Rica, el Instituto Tecnológico de Costa
Rica, y la Universidad Nacional a Distancia Costa Rica, por su invaluable
esfuerzo y la oportunidad que nos han brindado con la creación y puesta en
Marcha del Doctorado en Ciencias Naturales para el Desarrollo, un gran aporte
para el desarrollo de nuestros países Latinoamericanos.
A mis Profesores del DOCINADE, gracias por sus enseñanzas y los grandes
aportes que me brindaron en mi formación.
A la Universidad Autónoma de Chiapas, la Fundación Produce Chiapas y
los productores de cacao, por su apoyo en la realización de esta
investigación.
Al Dr. Freddy Araya Rodríguez, Coordinador General del DOCINADE.
Gracias por su apoyo y gestión enfrente del programa.
Al Dr. Orlando López Báez, Director de la Tesis, gracias por su apoyo y sus
grandes enseñanzas, las cuales me han permitido lograr esta meta tan
importante en mi vida.
Al Dr. Tomás de Jesús Guzmán, Asesor de la Tesis, de quien desde el inicio
del Doctorado y a pesar de la distancia he recibido un gran apoyo y
entusiasmo, gracias por sus enseñanzas y por la gran labor que ha realizado
en el DOCINADE que nos ha permitido a muchos cursar un Doctorado.
A la Dra. Sayra Munguía Ulloa, Asesora de la Tesis, gracias por su apoyo en
el transitar del doctorado y en el desarrollo de la Tesis, pilar fundamental del
DOCINADE y de quien siempre recibí comentarios oportunos para lograr
culminar esta meta.
Al Dr. Guillermo Pinieres Carrillo, Profesor de la Universidad Nacional
Autónoma de México y del DOCINADE, gracias por su disponibilidad y apoyo
en el desarrollo de la tesis.
Al Dr. Benjamín Velasco Bejarano, Profesor del DOCINADE y Director del
Laboratorio Nacional de Prevención y Control del Dopaje-CONAD, por su
invaluable apoyo en la realización de los análisis fitoquímicos.
A la M.Sc. Martha Beatriz Ramírez, Profesora de la Universidad Pedagógica y
Tecnológica de Colombia, por su asesoría y apoyo en el desarrollo de la Tesis.
A la QFB. Julieta Méndez Ramírez, Asistente del Laboratorio de Cacao de la
UNACH, gracias por tu gran apoyo y colaboración en el desarrollo de la tesis.
4
INDICE GENERAL
Página
DEDICATORIA
AGRADECIMIENTO
ÍNDICE GENERAL
ÍNDICE DE CUADROS
ÍNDICE DE FIGURAS
ÍNDICE DE ANEXOS
RESUMEN
SUMMARY
INTRODUCCIÓN
CAPÍTULO 1. INTRODUCCIÓN AL ESTUDIO
1.1. Antecedentes
1.2. Planteamiento y definición del problema
1.3. Justificación
1.3.1. Magnitud del problema
1.3.2. Trascendencia del problema
1.4. Alcances de la investigación
1.5. Objetivos
1.5.1. Objetivo General
1.5.2. Objetivos Específicos
1.6. Supuestos o Hipótesis
CAPÍTULO 2. MARCO TEÓRICO
2.1. El cacao, origen, distribución e importancia mundial
2.2. El cacao en México
2.2.1. Situación actual del cacao en México
2.3. La moniliasis del cacao
2.3.1. Origen y dispersión
2.3.2. Importancia económica de la moniliasis del cacao
2.3.3. Clasificación Taxonómica
2.3.4. Etiología
2.3.5. Sintomatología
2.3.6. Ciclo del hongo
2.3.7. Epidemiología
2.3.7.1. Fuentes de inóculo
2.3.7.2. Condiciones ambientales favorables a la enfermedad
2.3.7.3. Diseminación de Moniliophthora roreri
2.3.8. Tecnologías generadas para el manejo de la moniliasis
2.4. Los extractos de plantas y su poder para el manejo de
problemas fitosanitarios
2.4.1. Metabolitos Secundarios
CAPITULO 3. METODOLOGIA
3.1. Diseño de la investigación
iii
iv
v
viii
x
xii
xv
xvi
xvii
1
2
5
6
6
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9
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20
21
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22
23
25
25
27
29
32
33
5
3.2. Ubicación geográfica
3.3. Materiales
3.3.1. Material biológico
3.3.2. Material de Laboratorio
3.4. Métodos
3.4.1. Obtención de extractos vegetales
3.4.1.1. Presurizado
3.4.1.2. Hidrolato por destilación
3.4.1.3. Fermentado aeróbico
3.4.1.4. Fermentado anaeróbico
3.4.2. Aislamiento del patógeno
3.4.3. Trabajo en condiciones de laboratorio
3.4.3.1. Evaluación de extractos mediante el método de difusión
en Agar
3.4.3.2. Método de discos de papel
3.4.3.3. Método de disco de papel Kirby-Bauer
3.4.3.4. Determinación del medio para la formación y
germinación de conidias de monilia
3.4.3.5. Evaluación de tratamientos sobre la formación y
germinación de conidias de M. roreri
3.4.4. Trabajo en condiciones de campo
3.4.4.1. Determinación del ciclo de la enfermedad
3.4.4.2. Efecto de extractos sobre inhibición de la germinación
3.4.4.3. Efecto de extractos sobre el desarrollo de la
enfermedad en árboles de cacao
3.4.5. Caracterización fitoquímica de los extractos
34
34
34
34
35
35
35
35
35
35
36
36
CAPÍTULO 4. ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS
4.1. Fase 1. Trabajo en condiciones de laboratorio
4.1.1. Evaluación de extractos mediante el método de difusión
en Agar
4.1.1.1. Determinación de la concentración mínima inhibitoria
(CMI)
4.1.2. Evaluación de extractos sobre M. roreri mediante el
método de discos de papel
4.1.2.1. Determinación de un control químico
4.1.3. Evaluación de los extractos sobre M. roreri mediante el
método de discos de papel Kirby-Bauer
4.1.3.1. Determinación de un control químico
4.1.4. Determinación del medio para la germinación de conidias
de monilia
4.1.5 Evaluación de tratamientos sobre la formación y
germinación de conidias de M. roreri
4.2. Fase 2. Trabajo en condiciones de campo
4.2.1. Determinación del ciclo de la enfermedad
4.2.1.1. Síntomas y signos de la moniliasis en frutos inoculados
con M. roreri
4.2.1.2. Porcentaje de la ocurrencia de síntomas y signos
desarrollados por la inoculación de M. roreri sobre
frutos de cacao
51
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74
76
6
4.2.1.3. Severidad interna en frutos de cacao inoculados con M.
Roreri
4.2.2. Efecto de extractos sobre inhibición de la germinación
4.2.2.1. Incidencia de M. roreri
4.2.2.2. Severidad externa ocasionada por la inoculación de M.
Roreri
4.2.2.3. Severidad interna ocasionada por la inoculación de M.
Roreri
4.2.3. Efecto de extractos sobre el desarrollo de la enfermedad
en árboles de cacao
4.2.3.1. Incidencia de la enfermedad
4.2.3.2. Producción de cacao
4.3. Análisis económico
4.4. Análisis de los compuestos de los extractos
CONCLUSIONES
RECOMENDACIONES
BIBLIOGRAFÍA
ANEXOS
77
81
81
82
84
87
87
92
94
99
111
113
114
124
7
INDICE DE CUADROS
Página
Cuadro 1. Tratamientos a evaluar.
Cuadro 2. Comparación de tres Métodos de evaluación de la
efectividad reguladora de extractos de plantas y productos de
síntesis química sobre el crecimiento de M. roreri.
Cuadro 3. Comparación de medias por la prueba de Rango múltiple
de Tukey del efecto de medios con sucrosa al 2% y con
extracto de cacao sobre la cantidad de conidias totales de M.
roreri.
Cuadro 4. Comparación de medias por la prueba de Rango múltiple
de Tukey del efecto de medios con sucrosa al 2% y con
extracto de cacao sobre la cantidad de conidias germinadas
de M. roreri.
Cuadro 5. Tiempo de aparición de síntomas y signos en frutos de
cacao inoculados con M. roreri.
Cuadro 6. Porcentaje de ocurrencia de síntomas y signos
desarrollados por la inoculación de M. roreri sobre frutos de
cacao.
Cuadro 7. Índice de severidad interna en frutos inoculados con M.
roreri.
Cuadro 8. Comparación de medias por la prueba de Rango múltiple
de Tukey del Índice de Severidad Externa del efecto de los
hidrolatos de clavo, canela y pimienta en frutos de cacao
inoculados con M. roreri.
Cuadro 9. Comparación de medias por la prueba de Rango múltiple
de Tukey del Índice de Severidad Interna del efecto de los
hidrolatos de clavo, canela y pimienta en frutos de cacao
inoculados con M. roreri.
Cuadro 10. Comparación de medias por la prueba de Rango múltiple
de Tukey del efecto de tratamientos de los hidrolatos de clavo,
canela y pimienta en la incidencia de M. roreri, en una
plantación de cacao.
Cuadro 11. Comparación de medias por la prueba de Rango múltiple
de Tukey del efecto en la producción de cacao seco de la
aplicación de hidrolatos de canela, clavo y pimienta para el
manejo de M. roreri, en una plantación comercial.
Cuadro 12. Costo de labores culturales desarrolladas en una
hectárea de cacao del Clon UNACH 130.
Cuadro 13. Costo de aplicación por hectárea de los tratamientos
sobre el clon de cacao UNACH 130.
Cuadro 14. Ingresos por venta de semillas de cacao seco producido
en cada uno de los tratamientos aplicados sobre el Clon
UNACH 130.
Cuadro 15. Análisis económico de cada uno de los tratamientos
aplicados sobre el Clon UNACH 130.
36
68
70
70
75
77
78
84
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91
94
95
97
97
99
8
Cuadro 16. Comparación de los tiempos de retención (TR) y
porcentaje de abundancia obtenidos en GC-MS de los
extractos de canela y clavo.
Cuadro 17. Tiempos de retención, porcentajes y la propuesta del
compuesto dada por el equipo de GC-MS del hidrolato de
canela.
Cuadro 18. Tiempos de retención, porcentajes y la propuesta del
compuesto dada por el equipo de GC-MS del Hidrolato de
clavo.
100
100
102
9
INDICE DE FIGURAS
Página
Figura 1. Conidióforos de M. roreri aislados de frutos infectados en
plantaciones de Pichucalco, Chiapas – México.
Figura 2. Efecto de extractos de C. zeylanicum y P. dioica sobre el
crecimiento de M. roreri.
Figura 3. Efecto de extractos de S. aromaticum L. O. vulgare, T.
spathacea y Z. officinale sobre el crecimiento de M. roreri.
Figura 4. Efecto de extractos de C. zeylanicum y P. dioica sobre la
formación de conidias de M. roreri.
Figura 5. Efecto de extractos de S. aromaticum L. O. vulgare, T.
spathacea y Z. officinale sobre la formación de conidias de
M. roreri.
Figura 6. Efecto de cuatro concentraciones de extractos de C.
zeylanicum sobre el crecimiento de M. roreri.
Figura 7. Efecto de cuatro concentraciones de extractos de P.
dioica sobre el crecimiento de M. roreri.
Figura 8. Efecto de cuatro concentraciones de extractos de S.
aromaticum sobre el crecimiento de M. roreri.
Figura 9. Efecto de cuatro concentraciones de extractos de O.
vulgare, T. spathacea y Z. officinale sobre el crecimiento de
M. roreri.
Figura 10. Efecto de cuatro concentraciones de extractos de C.
zeylanicum sobre la producción de conidias de M. roreri.
Figura 11. Efecto de cuatro concentraciones de extractos de P.
dioica sobre la producción de conidias de M. roreri.
Figura 12. Efecto de cuatro concentraciones de extractos de S.
aromaticum sobre la producción de conidias de M. roreri.
Figura 13. Efecto de cuatro concentraciones de extractos de O.
vulgare, T. spathacea y Z. officinale sobre la producción de
conidias de M. roreri.
Figura 14. Efecto de los tratamientos sobre la formación de
conidias de M. roreri.
Figura 15. Efecto de los tratamientos sobre la germinación de
conidias de M. roreri.
Figura 16. Síntomas y signos presentes en frutos de cacao
infectados con Moniliophthora roreri.
Figura 17. Ciclo de M. roreri sobre clon UNACH 130, en
condiciones de Tapachula, Chiapas – México.
Figura 18. Efecto de extractos vegetales sobre la Incidencia de M.
roreri en cacao por inoculación artificial.
Figura 20. Efecto de la aplicación de extractos vegetales y
compuesto mineral sobre la severidad externa producida
por M. roreri en frutos de cacao por inoculación artificial.
Figura 21. Efecto de la aplicación de extractos vegetales y
compuesto mineral sobre la severidad interna producida por
M. roreri en frutos de cacao por inoculación artificial.
Figura 22. Efecto de la aplicación de hidrolatos de canela, clavo y
20
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60
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10
pimienta y de polisulfuro de calcio sobre el porcentaje de
incidencia de M. roreri en chilillos de cacao.
Figura 23. Efecto de la aplicación de extractos vegetales y
compuesto mineral sobre el porcentaje de incidencia de M.
roreri sobre mazorcas de cacao.
Figura 24. Efecto de la aplicación de extractos vegetales y
compuesto mineral sobre el porcentaje de incidencia de M.
roreri sobre frutos de cacao.
Figura 25. Efecto de la aplicación de hidrolatos de canela, clavo y
pimienta y de polisulfuro de calcio sobre el porcentaje de
incidencia de M. roreri en una plantación de cacao.
Figura 26. Efecto de la aplicación de extractos vegetales y
compuesto mineral sobre la producción de cacao.
Figura 27. Cromatograma del hidrolato de canela con diferentes
solventes.
Figura 28. Cromatograma del hidrolato de clavo con diferentes
solventes.
Figura 29. Espectro de masas del compuesto mayoritario del
hidrolato de canela: Aldehído cinámico.
Figura 30. Espectro de masas del compuesto mayoritario del
hidrolato de clavo: Acetato de eugenol.
Figura 31. Espectro de masas del Eugenol compuesto del
hidrolato de clavo.
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88
89
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93
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108
110
11
INDICE DE ANEXOS
Anexo 1. Produccion Mundial de cacao.
Anexo 2. Producción de cacao en México.
Anexo 3. Análisis de varianza para extractos a concentración del
50% (v/v) sobre el crecimiento de M. roreri.
Anexo 4. Comparación de medias por la Prueba de Rango
múltiple de Tukey (P<0.05) para extractos de evaluados a
concentración del 50% (v/v) sobre el crecimiento de M.
roreri.
Anexo 5. Análisis de varianza para extractos a concentración del
50% (v/v) sobre la formación de conidias de M. roreri.
Anexo 6. Comparación de medias por la Prueba de Rango
múltiple de Tukey (P<0.05) para extractos de evaluados a
concentración del 50% (v/v) sobre la formación de
conidias de M. roreri.
Anexo 7. Análisis de varianza para extractos a cuatro
concentraciones sobre el crecimiento de M. roreri.
Anexo 8. Comparación de medias por la Prueba de Rango
múltiple de Tukey (P<0.05) para extractos de evaluados a
cuatro concentración sobre el crecimiento de M. roreri.
Anexo 9. Análisis de varianza para extractos de clavo, jengibre,
orégano y maguey, a cuatro concentraciones sobre el
crecimiento de M. roreri.
Anexo 10. Comparación de medias por la Prueba de Rango
múltiple de Tukey (P<0.05) para extractos de clavo,
jengibre, orégano y maguey, evaluados a cuatro
concentraciones sobre el crecimiento de M. roreri.
Anexo 11. Análisis de varianza para extractos de canela y
pimienta evaluados a cuatro concentraciones sobre la
formación de conidias de M. roreri.
Anexo 12. Comparación de medias por la Prueba de Rango
múltiple de Tukey (P<0.05) para extractos de canela y
pimienta evaluados a cuatro concentraciones sobre la
producción de conidias de M. roreri.
Anexo 13. Análisis de varianza para extractos a cuatro
concentraciones sobre la formación de conidias de M.
roreri.
Anexo 14. Comparación de medias por la Prueba de Rango
múltiple de Tukey (P<0.05) para extractos de evaluados a
cuatro concentraciones sobre la producción de conidias de
M. roreri.
Anexo 15. Análisis de varianza de productos de síntesis química
sobre el crecimiento de M. roreri mediante el Método de
disco de papel.
Anexo 16. Comparación de medias por la Prueba de Rango
múltiple de Tukey (P<0,05) para productos de síntesis
química evaluados sobre la producción de conidias de M.
roreri mediante el Método de discos de papel.
Página
125
125
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126
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130
131
132
133
133
12
Anexo 17. Análisis de varianza del efecto de extractos vegetales
sobre el crecimiento de M. roreri mediante el método de
Disco de papel.
Anexo 18. Comparación de medias por la Prueba de Rango
múltiple de Tukey (P<0,05) de extractos vegetales sobre el
crecimiento de M. roreri mediante el Método de discos de
papel.
Anexo 19. Análisis de varianza de productos de síntesis química
sobre el crecimiento de M. roreri mediante el Método de
Disco de papel Kirby-Bauer.
Anexo 20. Comparación de medias por la Prueba de Rango
múltiple de Tukey (P<0.05) para productos de síntesis
química evaluados sobre la producción de conidias de M.
roreri mediante el Método de discos de papel Kirby-Bauer.
Anexo 21. Análisis de varianza del efecto de extractos vegetales
sobre el crecimiento de M. roreri mediante el método de
Disco de papel Kirby-Bauer.
Anexo 22. Comparación de medias por la Prueba de Rango
múltiple de Tukey (P<0.05) de extractos vegetales sobre el
crecimiento de M. roreri mediante el Método de discos de
papel Kirby-Bauer modificado.
Anexo 23. Análisis de varianza (Anova), del efecto de medios
con sucrosa al 2% y con extracto de cacao en el número
de conidias totales de M. roreri, de las 12 a las 72 horas.
Anexo 24. Análisis de varianza (Anova), del efecto medios con
sucrosa al 2% y con extracto de cacao en el número de
conidias germinadas de M. roreri, de las 12 a las 72
horas.
Anexo 25. Análisis de varianza (Anova), del efecto de los
hidrolatos de canela, clavo y pimienta en el número de
conidias totales de M. roreri, de las 12 a las 96 horas.
Anexo 26. Comparación de medias por la prueba de Rango
múltiple de Tukey del efecto de tratamientos de los
hidrolatos de clavo, canela y pimienta sobre la cantidad de
conidias de M. roreri.
Anexo 27. Análisis de varianza (Anova), del efecto de los
hidrolatos de canela, clavo y pimienta en el número de
conidias germinadas de M. roreri, de las 12 a las 96
horas.
Anexo 28. Comparación de medias por la prueba de Rango
múltiple de Tukey del efecto de tratamientos de los
hidrolatos de clavo, canela y pimienta sobre la cantidad de
conidias germinadas de M. roreri.
Anexo 29. Análisis de varianza (Anova), del Porcentaje de
incidencia de M. roreri del efecto de la aspersión de
hidrolatos de canela, clavo y pimienta en frutos de cacao
inoculados.
Anexo 30. Comparación de medias por la prueba de Rango
múltiple de Tukey del Porcentaje de Incidencia de M.
roreri en frutos de cacao asperjados con hidrolatos de
133
134
134
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140
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141
13
clavo, canela y pimienta.
Anexo 31. Análisis de varianza (Anova), del Índice de Severidad
Externa (ISE) del efecto de los hidrolatos de canela, clavo
y pimienta en frutos de cacao inoculados con M. roreri.
Anexo 32. Análisis de varianza (Anova), del Índice de Severidad
Interna (ISI) del efecto de los hidrolatos de canela, clavo y
pimienta en frutos de cacao inoculados con M. roreri.
Anexo 33. Porcentaje de mazorcas afectadas con M. roreri por
tratamiento y sus índices de severidad interna (ISI) y
externa (ISE) luego de 60 días de la inoculación artificial
con 9 x 104 conidias*mL-1. Tapachula, Chiapas – México.
Anexo 34. Análisis de varianza (Anova), del efecto de los
hidrolatos de canela, clavo y pimienta en la incidencia de
M. roreri, en una plantación de cacao.
Anexo 35. Análisis de varianza (Anova), del efecto en la
producción de cacao seco de la aplicación de hidrolatos
de canela, clavo y pimienta para el manejo de M. roreri,
en una plantación comercial.
Anexo 36. Análisis de sensibilidad de los tratamientos para
diferentes niveles de rendimiento de cacao.
141
142
142
142
143
143
144
14
RESUMEN
La moniliasis causada por Moniliophthora roreri, es señalada como la
enfermedad más devastadora que afecta al cacao (Theobroma cacao L.), está
presente en 11 países de sur y centro américa; ingresó a México en el 2005,
dejando a su paso pérdidas superiores al 50% de la producción, el abandono y
derribo de plantaciones. Entre las alternativas desarrolladas para su manejo
resaltan prácticas culturales, aspersiones de fungicidas de síntesis química, y
la resistencia genética. En ésta investigación se planteó como alternativa
“Desarrollar y caracterizar extractos vegetales con efectividad en el manejo de
M. roreri, los cuales puedan incorporarse en un sistema de producción orgánica
de cacao en México”. Se estudiaron extractos obtenidos de: Pimienta dioica L.,
Zingiber officinale Roscoe, Syzygium aromaticum L, Origanum vulgare L.,
Tradescantia spathacea Swartz y Cinnamomum zeylanicum Nees. La
investigación se realizó en el periodo 2008-2012, en tres fases: la primera en
laboratorio, realizando la selección y determinación de la concentración mínima
inhibitoria de los extractos obtenidos. En la segunda fase se probaron los
mejores extractos, en una plantación monoclonal ubicada en el Municipio de
Tapachula, Chiapas. En la tercera etapa mediante cromatografía de gases
acoplado a espectrometría de masas (GC-MS) se determinaron los posibles
componentes de aquellos extractos que mostraron la mejor efectividad contra
el patógeno. Los resultados obtenidos muestran que todas las plantas
evaluadas poseen metabolitos con capacidad para inhibir en mayor o menor
grado el desarrollo del hongo. En ensayos In vitro, el hidrolato resultó ser la
mejor forma de obtención de extractos, seguido por el presurizado y la
fermentación aeróbica. Los hidrolatos de canela, clavo y pimienta fueron los
que mostraron la mayor inhibición bajo los tres métodos evaluados; en medio
líquido inhibieron la multiplicación y la germinación de las conidias del hongo.
Tanto en frutos inoculados como en la plantación comercial con incidencia
natural de 69,6% de M. roreri, los hidrolatos de clavo y canela al 20%
mostraron la mayor efectividad, permitiendo obtener el 98% de frutos sanos y
un incremento en la producción entre un 800 y un 1000%, con respecto al
testigo. El análisis económico, resultó en una relación Beneficio/Costo mayor a
2 y una rentabilidad del 127,95% y 138% para los hidrolatos de clavo y canela
respectivamente, lo que indica una alta viabilidad técnica y económica para
incorporarlos dentro de un plan de manejo de la enfermedad. Para el hidrolato
de canela se identificaron 17 compuestos siendo los mayoritarios el aldehído
cinámico (74,08%), eugenol (6,8%) y acetato de cinamilo (5,18%); mientras que
para el hidrolato de clavo los compuestos mayoritarios son el Acetato de
Eugenol (58,95%) y el Eugenol (15,96%).
15
SUMMARY
Monilia pod rot caused by Moniliophthora roreri, is the most devastating disease
affecting cocoa (Theobroma cacao L.), is present in 11 countries in South and
Central America, It’s arrived in Mexico in 2005, causing losses exceeding 50%
of harvest, abandonment and deforestation by demolition of plantations. Among
the alternative studied for the monilia control are the cultural practice, chemical
fungicide sprays, and the natural genetic resistance. The goal in this research
was, develop and characterize plant extracts effective against M. roreri, which
can be incorporated into a system of organic cocoa production in Mexico.In this
study investigated extracts obtained from Pimienta dioica L. Zingiber officinale
Roscoe, Syzygium aromaticum L. Origanum vulgar L. Tradescantia spathacea
Swartz and Cinnamomum zeylanicum Nees. The research was achieved on the
2008- 2012 period, in three phases: the first on in vitro assays, in order to make
a screening and determination the minimum inhibitory concentration (MIC) of
the best extracts and the extraction method. The selection criterion was the
regulation of the growth and sporulation of M. roreri. The second phase consist
of field test of the selected extracts, using a clonal commercial plantation of
cacao, the criterion for evaluation was the effectiveness and the economic
analysis of the treatments with plant extracts performed as foliar application.
The third phase with chromatography and spectrophotometric analysis (GC-MS)
identified possible compounds of those extracts that showed the best
effectiveness against the pathogen. With regard to the best way of obtaining
extracts, the hidrolato was the most efficient and best regulatory effect on M.
roreri, followed by pressurized and aerobic fermentation. The results showed
that all plants evaluated possess metabolites with ability to inhibit a greater or
lesser degree fungal growth. The hydrolato extracts of C. zeylanicum, S.
aromaticum and P. dioica showed the greatest inhibition of conidia germination
and multiplication of M. roreri in liquid medium. In field conditions, both fruits
with artificial inoculation of M. roreri as commercial plantation under natural
incidence of 69.6% of M. roreri, the S. aromaticum and C. zeylanicum
hodrolatos at 20% concentration showed high effectiveness in control of monilia
disease. Treatment with these products yielded 98% of healthy fruits and
increased cocoa production by 800% by 1000%, compared with the control.
Economic analysis, resulted in a rate benefit / cost greater than 2 and a return
tax of 127.95% and 138% of S. aromaticum and C. zeylanicum extracts
respectively, indicating a high technical and economic feasibility to incorporate
these treatments into a management plan of moniliasis on cocoa plantation, in
either a traditional or organic management. For the C. zeylanicum hidrolato 17
compounds have been identified to be the major cinnamic aldehyde with
74.08% with 6.8% eugenol and cinnamyl acetate with 5.18%, while the majority
compounds of hidrolato of S. aromaticum resulted eugenol acetate (58.95%)
and eugenol (15.96%).
16
INTRODUCCION
El cultivo del cacao (Theobroma cacao L.) desde la época prehispánica ha
tenido gran relevancia para la dieta humana, hoy en día es la materia prima para
la chocolatería y para algunos productos farmacéuticos.
A nivel mundial, se cultiva principalmente en 13 países de los cuales Costa de
Marfil, Camerún, Ghana, Malasia, Indonesia y Brasil, de los cuales se obtiene
el 80% de la producción. Se estima que más de 20 millones de personas
dependen directamente de este cultivo para subsistir y que el 90% de la
producción es cosechada de minifundios (menor de 5 ha). México hace un
aporte del 0,6% a la producción mundial de cacao, procedente de 61,344.25
ha., de plantaciones ubicadas en los estados Tabasco, Chiapas, Oaxaca y
Guerrero (Servicio de información Agroalimentaria y pesquera - SIAP de la
Secretaria de Agricultura, Ganadería, Desarrollo Rural, Pesca y Alimentación SAGARPA, 2011).
Es importante destacar que el cacao tiene amplias perspectivas para
desarrollarse en Tabasco y Chiapas, especialmente bajo las normas de
producción orgánica. Existen expectativas a corto y mediano plazo en la
demanda de cacao orgánico en el ámbito mundial, dado el aumento en los
últimos años en el consumo de chocolates y derivados del cacao, así como la
apertura de nuevos mercados y los sobre precios, circunstancias que motivan a
fomentar la producción de este cultivo bajo sistemas de producción orgánica.
Por otra parte, las plantaciones de cacao constituyen agroecosistemas que por
su estructura y función se asemejan al ecosistema tropical húmedo, se
considera por lo tanto que en los estados de Chiapas y Tabasco el cacao
posee un alto valor ecológico, contribuyendo a la conservación de los recursos
naturales del trópico.
La enfermedad fungosa denominada moniliasis del cacao (Moniliophthora
roreri) es uno de los más graves problemas fitosanitarios que enfrentan los
17
productores de cacao, ya que ocasiona pérdidas totales de la cosecha. Este
patógeno de reciente entrada a México, esta ocasionando que los productores
abandonen o derriben las plantaciones al no lograr producción alguna,
situación que pone en peligro la cacaocultura Mexicana.
Es de hacer notar que hasta el momento, las investigaciones orientadas al
manejo orgánico de esta enfermedad son escasas y por lo tanto se carece de
tecnologías eficientes para su manejo.
Diversas investigaciones han mostrado el potencial que posee el uso de
extractos plantas dentro del manejo orgánico de problemas fitosanitarios dada
su alta efectividad, buena aceptación de los productores hacia su uso, bajos
costos del insumo y reducido o nulo impacto ambiental. De esta manera es
factible que el uso de extractos vegetales puede ser una buena alternativa
para el manejo el hongo M. roreri que afecta el cacao.
Es por ello que esta investigación pretende desarrollar y caracterizar extractos
vegetales que tengan efectividad en el manejo de M. roreri, los cuales puedan
incorporarse en un sistema de producción orgánica de cacao en México, para
lo cual se plantea el estudio del efecto regulador de extractos obtenidos de las
plantas: Pimienta dioica L., Zingiber officinale Roscoe, Syzygium aromaticum L,
Origanum vulgare L., Tradescantia spathacea Swartz y Cinnamomum
zeylanicum Nees., sobre el patógeno causante de la moniliasis del cacao.
La investigación se llevó a cabo en tres fases: la primera en condiciones de
laboratorio con el fin de hacer una selección y la determinación de la
concentración mínima inhibitoria de los extractos obtenidos de las seis plantas
bajo cuatro formas de extracción. Esta selección se realizó tomando como
criterio el efecto en la regulación del crecimiento y esporulación de M. roreri. La
segunda fase consistió en probar los mejores extractos seleccionados en la
primera fase, en condiciones de campo utilizando para ello una plantación de
cacao y seleccionar así los extractos con la mejor efectividad. La tercera fase
permitió mediante pruebas fitoquímicas determinar los posibles componentes
de los extractos que mostraron la mejor acción contra el patógeno.
18
CAPÍTULO 1.
INTRODUCCIÓN AL ESTUDIO
19
CAPÍTULO 1. INTRODUCCIÓN AL ESTUDIO
1.1.
Antecedentes
Se cree que el cacao se originó en las cabeceras de la Cuenca del Amazonas y
que en tiempos antiguos una población natural de Theobroma cacao se
diseminó por toda la parte Central de la zona Amazónica-Guayana, hacia el
Oeste y al Norte, llegando hasta el Sur de México y que estas dos poblaciones
se desarrollaron en formas separadas geográficamente por el Istmo de
Panamá. La primera de ellas, constituyó el grupo de los llamados Forastero Amazónico y el segunda grupo denominado Criollo, el cual tiene buena
aceptación en el mercado dadas sus altas calidades organolépticas (Foniap,
1993; Moreno, L. et al., 1983; Ruiz, 2003; Castillo, 2003).
En la actualidad, este árbol se cultiva comercialmente en Asía y Oceanía;
Centro y sur América y África, con una participación mundial con respecto a
la producción del 12,5%, 12,7 y 74,8% respectivamente. La mayor parte del
cacao destinado al comercio internacional se cultiva en África, siendo Costa
de Marfil el mayor productor y el cacao de Ghana el de mayor calidad
(International Cocoa Organization – ICCO, 2011).
Para México el cacao más que un producto alimenticio, representa una
tradición, un gran legado cultural por preservar y una gran fuente de riquezas
naturales, así como fuente generadora de empleos. En la actualidad están
sembradas 61,344.25 ha., ubicadas en cuatro estados, generando más de ocho
millones de jornales al año, con una contribución de 27,173.61 toneladas, el
rendimiento promedio reportado para el año 2010 fue de 320 kg/ha (SIAP,
2011).
El cultivo del cacao en México ha sido manejado principalmente por pequeños
productores, los cuales dependen casi exclusivamente de la mano de obra
familiar para atender las plantaciones, quienes además tienen bajo nivel
educativo y poca capacidad económica de reinvertir en sus plantaciones.
20
Los bajos rendimientos que presenta la cacaocultura actual de México es
generada en gran medida por la presencia de plantaciones viejas de más de 40
años, material genético de bajos rendimientos y susceptible a plagas y
enfermedades, bajo o nulo manejo cultural y presencia de una gran diversidad
de problemas fitosanitarios.
Las anteriores condiciones han originado alta incidencia de plagas y
enfermedades,
de
tal
manera
que
para
manejarlas
se
hace
uso
fundamentalmente y muchas veces de manera indiscriminada de productos de
síntesis química, sin que ejerzan el control esperado sobre organismos
fitoparásitos provocando a la vez deterioro ambiental. Esta situación se agudiza
en un tipo de ecosistema tropical como en el que se encuentra el cacao, de
gran diversidad biológica y elevados recursos hídricos, además de que se
afecta la salud de los productores y consumidores del ecosistema cacao y se
aumentan los costos de producción (Estrada, 2010).
Dentro de la diversidad de problemas fitosanitarios presentes en el cultivo del
cacao, los principales con los ocasionados por los hongos: Phytophthora
palmivora, Colletrotrichum gloesporioides y Moniliophthora roreri; éste último
patógeno produce la denominada moniliasis del cacao, enfermedad que
ingreso a México a principios del año 2005 y cuyo primer reporte se dio en el
norte del estado de Chiapas y en la actualidad ya está presente en las
plantaciones de los estados de Tabasco (primer productor de cacao de México)
y Chiapas (Torres de la Cruz, 2010).
La moniliasis tiene su centro de origen en Colombia y se ha diseminado a
países productores de cacao de Sur y Centro América (Phillips-Mora, 2006),
dejando a su paso el derribo de gran número de hectáreas sembradas,
abandono de plantaciones, bajas considerables de la producción, aumento de
costos de producción y por consecuencia baja rentabilidad del cultivo,
empobrecimiento de los productores y deterioro ambiental, problemática que ya
se está viviendo en México.
21
El ingreso de la moniliasis al territorio azteca tambaleó la producción ya que
este hongo que ataca directamente a los frutos ocasionó pérdidas totales de la
producción en muchas de las regiones de producción en los estados de
Chiapas y Tabasco. En el Anexo A se pueden apreciar los datos de la
evolución del cultivo del cacao durante la última década, en la que se resalta
como antes del ingreso de la moniliasis (2004) el área sembrada era de
81964.11 ha, la cual se redujo en un 23,51% a un año de su ingreso y para el
año 2010 en un 25,15%. De la misma manera la producción antes del ingreso
de este patógeno a territorio mexicano era de 43974.52 toneladas, la cual se
redujo en un 17,30% a un año de su ingreso, en el año 2010 en un 38,20% y
en el 2011 se redujo en 50,95%; en tanto que el rendimiento por hectárea se ha
reducido en un 18,5% (Servicio de Información Agroalimentaria y Pesquera
SIAP, 2011).
Esta situación ha originado que mientras para el año 2004 el precio de la
tonelada de cacao era de USD$ 1382.48, en seis años el precio ha aumentado
el 108,5% (Servicio de Información Agroalimentaria y Pesquera -SIAP, 2011),
debido a la reducción del área cultivada, de la producción y de los
rendimientos. Pese a los esfuerzos realizados por los Gobiernos de los
principales estados productores de cacao, es evidente el gran impacto
ocasionado por el ingreso de esta enfermedad.
En el caso de los dos principales estados productores de cacao las
plantaciones forman parte de las cuencas de dos de los ríos más importantes
de México que son el Grijalva y el Usumacinta. Dado el alto impacto de la
enfermedad los productores en medio de la desesperación por no tener
producción y por consecuencia ingresos están optando por el derribo de las
plantaciones para cambiar de cultivo principalmente a pastos y maíz, lo cual de
seguir así estaría amenazando el sistema de captación y amortiguamiento y
reserva que representan los cultivos de cacao incluyendo la gran diversidad de
árboles de sombra, generando así un problema ambiental de graves
consecuencias.
22
Las alternativas que se han estudiado para el manejo de la moniliasis han
demostrado que se requiere de un manejo cultural basado fundamentalmente
en bajar el porte de los árboles, así como podas de formación y saneamiento
permanentemente, recolección y manejo eficiente, oportuno y adecuado de
frutos enfermos, así como manejo de los árboles de sombra (López, 2006a;
Federación Nacional de Cacaoteros, 2004).
Se han realizado diversas investigaciones utilizando aplicaciones de fungicidas
de síntesis química, las cuales han demostrado que pueden permitir un buen
nivel de control del patógeno, sin embargo se elevan los costos de la
producción y se ocasiona deterioro ambiental. Otra alternativa que se esta
estudiando es la resistencia genética pero sin que hasta el momento se tengan
resultados masificables (Sánchez, et al., 2003; Merchán, 1980; Barros, 1982;
Suárez, 1982; González et al., 1984; Brenes, 1983; Arguello, 2000, Torres de
la Cruz, 2010).
El uso de extractos vegetales ha demostrado en diversas investigaciones ser
un insumo de gran efectividad para manejar diversos problemas fitosanitarios,
sin embargo se requieren más investigaciones que permitan generar opciones
eficientes, fácilmente implementables por el productor y económicamente
viables, así como de llevar a cabo estudios para determinar los metabolitos
secundarios que ejercen actividad sobre los microorganismos fitopatógenos y
que contribuyan en el avance del conocimiento de esta alternativa de control.
1.2.
Planteamiento y definición del problema
Teniendo en cuenta las grandes pérdidas ocasionadas en el cultivo del cacao
por la presencia de la moniliasis y que en México no se han realizado
investigaciones para realizar un manejo orgánico de esta enfermedad, se
plantea el siguiente problema de investigación.
¿Es posible que mediante la aplicación de extractos vegetales de Pimienta
dioica L., Zingiber officinale Roscoe, Syzygium aromaticum L, Origanum
23
vulgare L., Tradescantia spathacea Swartz, Cinnamomum zeylanicum Nees se
reduzca la incidencia de la moniliasis en plantaciones de cacao de México?
El mercado de productos orgánicos durante los últimos años ha venido en
aumento dado los beneficios de este tipo de agricultura y el cacao no se
escapa de esta tendencia, el cual además tiene un sobreprecio; sin embargo la
producción de este tipo no alcanza a abastecer el consumo, haciendo de este
mercado un potencial para los productores de cacao en México. Es por ello que
los dos principales estados productores de cacao (Tabasco y Chiapas) están
incentivando a este tipo de producción, pero desafortunadamente falta
investigación sobre un manejo de la moniliasis del cacao mediante alternativas
de producción orgánica que permitan generar tecnologías para apoyar la
reconversión hacia la producción orgánica de cacao o mantener las ya
existentes.
Dentro de la agricultura orgánica existen diversas alternativas para el manejo
de problemas fitosanitarios entre las cuales están el control biológico, manejo
cultural, diversificación y uso de extractos de plantas, entre otros.
El estudio del uso de extractos de plantas para el manejo de problemas
fitosanitarios se practica desde hace siglos con buenos resultados y con gran
aceptación por parte de los productores, haciendo de esta alternativa de
manejo de enfermedades una buena opción dentro de la producción orgánica,
por su bajo o nulo impacto ambiental, bajo costo y gran efectividad.
Dada la gran diversidad de plantas y de sus respuestas a diversos problemas
de plagas en cultivos, existe un gran vacío de conocimientos acerca de esta
alternativa de manejo en cultivos como el cacao y que pudieran ser una buena
opción para el combate de M. roreri.
1.3. Justificación
1.3.1. Magnitud del problema. Para el año 2004 estaban sembradas en
México 81,964.11 ha, ubicadas en cinco estados, las cuales eran susceptibles
24
de ser afectadas por la enfermedad denominada moniliasis del cacao. Para el
año 2005 se realizó el primer reporte de la presencia de esta enfermedad en el
norte del estado de Chiapas y para el 2006 ya se dieron reportes de la
afectación de plantaciones en la región de la “Chontalpa”, principal área
productora del estado de Tabasco y para finales del mismo año se encontró la
enfermedad en el municipio de Tuzantán perteneciente a otra de las zonas más
importantes como lo es la del Soconusco en el estado de Chiapas. A la fecha el
hongo ya se encuentra disperso en las principales áreas de producción de
cacao en México, lo cual ha causado reducción del 25,15% en el área de
siembra, del 50,95% en la producción nacional y de 18,5%, en el rendimiento
por hectárea, después del ingreso de esta enfermedad a territorio mexicano
hace seis años.
Para los estados de Tabasco y Chiapas (México), el cacao es un cultivo
estratégico, por su repercusión social, económica y ecológica, en el año 2000,
éste cultivo generaba más de ocho millones de jornales al año los cuales se
han reducido dado el gran impacto que tiene la enfermedad, además buena
parte de la población de cacaocultores son pequeños productores que basan
su sustento en este cultivo de tal manera que al no tener producción, el ingreso
de estas familias se ve amenazado aumentando con ello la migración de la
población rural y la desintegración familiar.
1.3.2. Trascendencia del problema. Dado que la afectación de la enfermedad
puede llegar al 100% de pérdidas de la producción, y la baja capacidad
económica de los productores para darle manejo a su plantación, éstos por una
parte están optando por abandonarlas incentivando de esta manera la
diseminación de la enfermedad, y por otra parte, están derribando las
plantaciones para cambiar de cultivo o actividad principalmente a maíz o
pastizales para implementar la ganadería bovina, lo cual ambientalmente afecta
el sistema de captación y amortiguamiento y reserva que representan los
cultivos de cacao incluyendo la gran diversidad de árboles de sombra y de la
fauna y flora asociada a este cultivo, generando así un problema ambiental de
graves consecuencias a mediano plazo, así como la pérdida de germoplasma
25
de cacao de éstas regiones, las cuales poseen el legendario cacao criollo de
gran aceptación por parte del mercado chocolatero dada sus buenas
características organolépticas.
De otra parte, los bajos o nulos ingresos que tienen los productores con cacao
afectado por monilia, hacen que ellos salgan a buscar otras fuentes de
ingresos, incentivando así la migración de los pobladores rurales a otros
lugares del país o a Estados Unidos, generando el abandono de las zonas
rurales, desintegración familiar y escasez de mano de obra en etapa activa.
Teniendo en cuenta los buenos beneficios que trae consigo la producción de
tipo orgánico, los dos principales estados productores de cacao: Tabasco y
Chiapas, están incentivando este tipo de producción de tal manera que ya
existen plantaciones de cacao certificadas y en proceso de transición con
mercados que les dan un sobre precio, pero con el ingreso de la enfermedad y
la falta de alternativas de manejo bajo este sistema de producción hace
tambalear la economía de este sistema productivo y con ello los ingresos de
los productores y sus condiciones de vida.
1.4.
Alcances de la investigación
A continuación se presentan los alcances de esta investigación:
Económico: Se da una nueva opción económicamente rentable para el manejo
de la moniliasis del cacao tanto para sistemas de producción convencional
como para sistemas de tipo orgánico.
Social: Dado que la producción de cacao la realizan principalmente pequeños
productores y es una actividad familiar, el manejo de la moniliasis mediante el
uso de extractos vegetales permitirá a los productores que opten por este tipo
de manejo obtener una mayor producción y si ingresan a mercados
especializados podrían obtener mayor ingreso económico, lo cual repercutiría
en la mejora de su calidad de vida, arraigo a su población, generación de
empleos y con ellos reducción de la migración.
26
Científico: Los resultados de la investigación permitirán generar conocimiento
acerca del potencial de extractos de plantas en el manejo de fitoparásitos, uso
de extractos de plantas como alternativa al manejo de la moniliasis del cacao,
así como avanzar en el estudio de sistemas de producción orgánica y de
manejo ecológico de la moniliasis del cacao en México.
1.5. Objetivos
1.5.1. Objetivo General
Desarrollar y caracterizar extractos vegetales que tengan efectividad en el
manejo de Moniliophthora roreri, en el cultivo de cacao (Theobroma cacao L.)
en México, con el fin de incorporarlos en un sistema de producción orgánica.
1.5.2. Objetivos Específicos
1. Determinar in vitro la forma de obtención de extractos a partir de seis
plantas con efectos biofungicidas sobre M. roreri.
2. Determinar la concentración mínima inhibitoria de los extractos de
plantas seleccionadas con mayor efectividad en la regulación del
crecimiento y desarrollo del hongo Moniliophthora roreri, en condiciones
de laboratorio.
3. Establecer la eficiencia en condiciones de plantaciones de cacao de
extractos vegetales sobre Moniliophthora roreri.
4. Determinar la factibilidad económica del uso de extractos vegetales para
el manejo orgánico de la moniliasis del cacao.
5. Realizar la caracterización fitoquímica del extracto que ejerza en campo
mayor efectividad de control sobre M. roreri.
1.6.
Supuestos o Hipótesis
1. La aplicación de extractos de plantas reduce la incidencia de la
moniliasis en plantaciones de cacao.
27
2. La implementación de un manejo orgánico integral incorporando
extractos
vegetales
resulta
eficiente
técnica,
económica
y
ambientalmente en el manejo orgánico de la moniliasis del cacao.
3. La forma de obtención influye en el efecto antifungico del extracto sobre
M. roreri.
28
CAPÍTULO 2.
MARCO TEÓRICO
29
CAPÍTULO 2. MARCO TEÓRICO
2.1. El cacao, origen, distribución e importancia mundial.
El cacao (Theobroma cacao L.) es una planta ancestral que ha llegado a tener
gran importancia cultural, ecológica y económica. En la época precolombina la
semilla se utilizaba para obtener una bebida la cual fue considerada como
alimento de los dioses y de ahí su nombre genérico científico theo = dios y
broma = alimento; y fue usado por los Mayas, Aztecas y otros grupos como
moneda. Su centro de origen fue la cuenca del río Amazonas, dispersándose
hasta el sur de México donde en la actualidad se encuentra uno de las mayores
reservas de germoplasma y del legendario cacao criollo (Estrada, 2010).
Según la Organización Internacional del Cacao (OCCO, 2011), el cultivo se ha
extendido, desde la colonización española, a otros países que hoy son líderes
en la producción mundial. Se cultiva principalmente en 13 países, Costa de
Marfil, Ghana, Nigeria y Camerún en el continente Africano aportan el 74,8% de
la cosecha mundial, que significan 3,18 millones de toneladas para el período
estimado de cosecha 2010-2011. También es cultivado en países de Asía y
Oceanía los cuales aportan el 12,5% de la producción y el restante 12,7% en el
continente americano donde los mayores productores son Brasil y Ecuador,
seguidos de República Dominicana, Colombia, Perú, México, Venezuela.
Con relación a la superficie destinada al cultivo de cacao en el mundo, ésta se
encuentra alrededor de los 7 millones de hectáreas. El 70% de esta área se
ubica en África, el 20% en América y el 8% en Asia. El rendimiento de la
producción de cacao a nivel mundial alcanza un valor promedio de 0,51 t/ha.
Asia presenta el mayor rendimiento a nivel mundial con 0,8 t/ha., seguido de
África con 0,53 t/ha y finalmente América con un rendimiento de 0,3 t/ha. Los
países con mayores rendimientos son Granada y Madagascar los cuales son
superiores a 0,95 t/ha, Indonesia y Malasia con rendimientos mayores a 0,8
t/ha. El Salvador, Santa Lucía y Bolivia con rendimientos entre 1,0 y 0,73 t/ha
en promedio.
30
Se estima que más de 20 millones de personas dependen directamente de
este cultivo para subsistir y que el 90% de la producción es cosechada de
minifundios (menor de 5 ha) (ICCO, 2011).
Durante los últimos años se ha querido aumentar la productividad de los
cultivos y para ello se ha hecho uso del mejoramiento genético, de fertilizantes
y principalmente de fungicidas e insecticidas, ya que se calcula que alrededor
del 30% de la producción mundial se pierde a causa de plagas y
enfermedades. Desafortunadamente el cultivo del cacao en América Latina
atraviesa por un grave problema causado por la diseminación de enfermedades
tales como escoba de bruja (Moniliophthora pernisiosa) y la moniliasis, esta
última de ingreso reciente en México ha producido efectos devastadores
llegando a generar pérdidas que superan el 90% de la producción (Palencia,
2003; Pinzón, 2004; Federación Nacional de cacaoteros, 2004; Arias, 2007).
2.2. El cacao en México
El cacao, como cultivo es nativo de México y en la actualidad están plantadas
61,344.25 ha ubicadas en los estados de Tabasco, Chiapas, Guerrero y
Oaxaca. El SIAP de la SAGARPA (2011) reporta que el estado de Tabasco
cuenta con la mayor superficie sembrada, con el 67,25%, seguido de Chiapas
con el 32,32%, y el área restante se ubica en los estados de Oaxaca y
Guerrero.
En el Contexto Internacional, actualmente México se encuentra dentro de los
20 principales países productores y con mayor superficie en el mundo ya que
con 23 mil toneladas aporta el 0,6% de la producción mundial de cacao según
el ICCO para el período de cosecha 2010-2011 (ICCO, 2011). Sin embargo
está considerado entre los países de bajo consumo, con 2,5 kg. per cápita al
año (Fideicomisos Instituidos en Relación a la Agricultura- FIRA, 2004).
En el caso del rendimiento, según el SIAP de la SAGARPA para el año 2011,
reporta 0,35 t/ha, es importante señalar que los países con mayores
rendimientos (Granada, Madagascar, Indonesia, Malasia, El Salvador, Santa
31
Lucía y Bolivia) tienen rendimientos reportados entre 0,73 y 1,0 t/ha en
promedio.
Los dos principales estados productores Tabasco y Chiapas tienen plantadas
60,744.33 ha., con unas 21,18 mil toneladas de grano, sin embargo, la
característica de cacao fino y aromático, ubica a México en un lugar
preponderante, sobre los grandes productores en el mundo debido a la calidad
de su materia prima usada principalmente para la chocolatería fina. El cacao
producido abastece parcialmente a 213 empresas, de las cuales ocho de éstas
dominan lo que se conoce como mercado de volumen o el gran mercado:
Nestlé y Pepsico, que en conjunto manejan el 59% del cacao nacional. La
mayoría de las empresas pertenecen a la Asociación Nacional de Fabricantes
de Chocolate, Dulces y similares que en conjunto procesan 67231 toneladas de
cacao anualmente. (Hernández, et al.,. 2010) y la disminución de la producción
nacional obliga a la importación de materia prima, lo cual afecta a la industria
nacional. Con respecto al mercado de exportación, principalmente se
abastecen mercados de Estados Unidos y Europa (SAGARPA, 2003).
Se estima que al cierre de 2008, el volumen de exportaciones de México de
este producto haya alcanzado las 103,017 toneladas, lo cual representaría una
disminución de 35,7% respecto al 2007. Los principales productos exportados
son el cacao en polvo con adición de azúcar u otro edulcorante (31%), las
barras de cacao con un peso superior a 2 kg (31%) y el chocolate y otras
preparaciones con cacao (15%) (Financiera Rural, 2012).
Dada la extensión de las plantaciones, la gran biodiversidad presente en ellas y
el número de productores que dependen de este cultivo, el cacao constituye
uno de los pilares de la conservación ambiental y sustentabilidad de los
recursos naturales, así como de uno de los cultivos estratégicos para esta parte
del territorio mexicano.
Por otra parte, las plantaciones de cacao constituyen agroecosistemas que por
su estructura y función se asemejan al ecosistema tropical húmedo, se
32
considera por lo tanto que el cacao posee un alto valor ecológico contribuyendo
a la conservación de los recursos naturales del trópico (Salgado, 2006).
Además el 69% de las plantaciones de cacao se ubica en terrenos de
pequeños propietarios y el 31% restante en terrenos del sector social; el
tamaño medio de la superficie cultivada con cacao es de 3 ha por productor,
con un rango que varia de 1 a 50 ha, según datos reportados para el Estado de
Chiapas (Toledo, 2003, Ruiz, 2003). Según Hernández, et al., (2010),
aproximadamente 46000 productores y 197100 personas dependen de manera
directa e indirecta de éste cultivo, generándose poco más de 2 millones de
jornales al año (SAGARPA, 2003).
2.2.1. Situación actual del cacao en México: El cultivo del cacao en México
ha sido manejado principalmente por pequeños productores, los cuales
dependen casi exclusivamente de la mano de obra familiar para atender las
plantaciones, quienes además tienen bajo nivel educativo y poca capacidad
económica de reinvertir en sus plantaciones.
Trabajos realizados en el 2006 por la Universidad Autónoma de Chiapas,
determinaron que el 73% del cacao que se cultiva en el estado de Chiapas es
por tradición y el 27% lo han sembrado los productores por considerar que el
cacao es rentable y les permite obtener ganancias. El 65% de los productores
heredó la plantación de su papá, y esto refleja la explotación tradicional del
cultivo de cacao en las regiones productoras del Estado de Chiapas.
Dado que México es una confederación de estados, los programas de los
gobiernos estatales han sido diferentes y con variados resultados, en el caso
de Tabasco se ha dado últimamente apoyo al proceso de beneficio del cacao
con el montaje de plantas fermentadoras, buscando con ello mejorar la calidad
de éste proceso, mientras que en el Estado de Chiapas se han hecho trabajos
para la renovación de plantaciones.
En los dos principales estados productores Chiapas y Tabasco, las densidades
de las plantaciones son bajas (600 árboles/ha), utilizan materiales genéticos de
33
baja calidad, realizan usualmente un inadecuado manejo de las plantaciones,
con plantas que van de los 6 a los 7 metros de altura, existe un alto número de
plantaciones viejas con más de 30 años y algunas de ellas están abandonadas.
A lo anterior se suma la alta incidencia de enfermedades e insectos plaga,
principalmente
Mancha
negra
(Phytophthora
palmivora),
Antracnosis
(Colletotrichum gloesporioides) y recientemente Monilia (M. roreri).
Diferentes
programas
gubernamentales
han
realizado
esfuerzos
por
proporcionar material vegetativo para la renovación de las miles de hectáreas
existentes, así como brindar capacitación; sin embargo los esfuerzos realizados
son lentos y no permiten visualizar un repunte importante en la producción.
Uno de los factores tal vez más limitantes detectados, es la escasez de
técnicos y profesionales capacitados en la producción de cacao, así como de
las escasas instituciones e investigaciones realizadas en este sector
productivo,
sustentadas
principalmente
en
el
Investigaciones Forestales, Agrícolas y Pecuarias -
Instituto
Nacional
de
INIFAP, la Universidad
Autónoma de Chiapas y el Colegio de Posgraduados (Estrada, 2010).
Desde el punto de vista ecológico el cacao está situado principalmente en tres
regiones que alimentan a los principales ríos que abastecen de agua tanto para
consumo como para generación de energía mediante plantas hidroeléctricas.
Además se tiene el reporte de la existencia de una gran biodiversidad existente
en las plantaciones de cacao, algunas de ellas plantadas bajo selva y otros con
diversidad de árboles para que les generen sombra. Esto hace que el cultivo de
cacao tenga una gran repercusión en el ciclo hidrológico, en la conservación de
la biodiversidad regional, en la captura de carbono y la regulación de ciclos
biológicos de diversas especies.
Se sabe que los cacaotales mantienen una diversidad de aves, murciélagos,
mamíferos no voladores e invertebrados (especialmente hormigas) similar a la
34
de los bosques naturales y superior a la de los habitas agrícolas más
intervenidos (Salgado, 2006).
2.3. La moniliasis del cacao
2.3.1. Origen y dispersión: Durante muchos años se afirmó que la moniliasis
inició en el año 1914 en Ecuador (Ampuero, 1967; Barros, 1980), pero
recientes estudios realizados por Phillips-Mora et al., (2006) mencionan que el
origen de esta grave enfermedad se dio en Colombia hacia el año 1800; desde
entonces se ha dispersado a 11 diferentes países sur y centro americanos
productores de cacao: Colombia, Ecuador en 1917 (Rorer, 1918), Venezuela
en 1941 (Muller, 1941), Perú en 1950 (McLaughlin, 1950) , Panamá en 1956
(Orellana, 1956), Costa Rica en 1978 (Enríquez y Suarez, 1978), Nicaragua en
1980 (López y Enríquez, 1980), Honduras en 1997 (Porras y Enríquez, 1998),
Guatemala en 2002 (Phillips-Mora y Wikilson, 2007), Belice en el 2004 (PhillipsMora et al., 2006b) y finalmente ingresó a México en el año 2005 (PhillipsMora et al., 2006a), ocasionando a su paso pérdidas superiores al 50% de la
producción y al abandono del cultivo por miles de productores a lo largo del
continente americano, lo cual ha ocasionado efectos negativos en la
comunidad de cacaocultores y en estos agroecosistemas.
La moniliasis es producida por el hongo Moniliophthora roreri (Cif. & Par),
basidiomiceto del orden Agaricales, familia Marasmiaceae. Trabajos realizados
por Phillips (2006), con la ayuda de genética molecular, mostraron que existen
cinco variedades del hongo de la moniliasis, todos con origen colombiano,
algunos son endémicos ya que nunca salieron de ese país, pero otros, a través
del movimiento de material de siembra, se esparcieron por otros países de
América. Así, los cultivos de Colombia, Perú y Bolivia hoy se ven amenazados
por una variedad de la moniliasis distinta a la que acabó con el cultivo en
Panamá, Costa Rica y que se ha dispersado hasta cultivos del sur de México,
detectada a principios del año 2005.
2.3.2. Importancia económica de la moniliasis del cacao: La enfermedad
denominada moniliasis del cacao ocasiona pérdidas en rendimiento de acuerdo
35
con las condiciones ambientales, el manejo del cultivo, las medidas de control
que se apliquen y las variedades cultivadas. En plantaciones ubicadas en
zonas húmedas, con poca tecnificación y sin control, es frecuente observar
pérdidas superiores al 90%. Sin embargo, bajo condiciones culturales óptima
de manejo, control y germoplasma mejorado, los daños disminuyen
considerablemente, y esta situación genera una alternativa para el desarrollo
del cultivo del cacao en áreas infestadas por la enfermedad.
En Colombia, donde el hongo apareció inicialmente en Tumaco y en el golfo de
Urabá, disminuyó el rendimiento de los cultivos de cacao entre el 30 y 70%, el
país cuenta con unas 100.000 hectáreas sembradas y produce 36.000
toneladas anuales, volumen que no abastece a la industria local, por lo que la
industria procesadora debe importar alrededor de 30.000 toneladas anuales.
(Domínguez, 2007). En Colombia, Barros (1980) y Campuzano (1980) indican
que las pérdidas por la enfermedad fluctúan alrededor del 40% de la
producción nacional.
Se conoce que la moniliasis y la escoba de bruja causaron un grave perjuicio
en la industria del cacao en el Ecuador en 1933 (en ese entonces uno de los
mayores productores a nivel mundial), donde las exportaciones bajaron de
47.000 Toneladas a 10.800 Toneladas, Ampuero (1967) señala además que
las pérdidas estimadas fueron desde un 15 hasta un 80%, en las diversas
regiones productoras.
En Perú, desde su primer reporte, en Bagua Grande, departamento de
Amazonas, en 1988, esta enfermedad se ha diseminado prácticamente a todas
las áreas productoras de cacao en el país, según lo ha podido establecer el
Ministerio de Agricultura y servicio nacional de sanidad agraria del Perú; sin
embargo, la superficie cacaotera aumentó a unas 60.000 hectáreas, de las
cuales 30.000 están en producción (Ministerio de Agricultura y Servicio
Nacional de Sanidad Agraria del Perú).
Por otra parte, en Costa Rica, Enríquez y Suárez (1978) y Enríquez y
colaboradores (1979) mencionan que la producción nacional en 1978 fue de
9,500 toneladas por año; sin embargo debido a la presencia de la enfermedad
36
el rendimiento se redujo en 1982 a 3,500 toneladas. Funcionarios del Centro
Agronómico Tropical de Investigación y Enseñanza (CATIE) reportan que por
culpa de la enfermedad, de las 20.000 hectáreas sembradas en 1978 en ese
país centroamericano, quedan en la actualidad unas 1.200 ha, porque los
productores erradicaron los cultivos para sembrar plátano, banano y tubérculos.
Se tiene el reporte que en cinco años de ingresada la enfermedad la
producción cayó 72% y las exportaciones 96% (Programa Cooperativo en
Investigación y Tecnología Agrícola para la Región Norte, 2005).
En Honduras la producción de cacao en 1997, antes de la llegada de la
moniliasis fue de 4,500 toneladas de cacao, en 2003 por efecto de la moniliasis
la producción tan solo alcanzó 900 toneladas (Programa Cooperativo en
Investigación y Tecnología Agrícola para la Región Norte, 2005).
En el caso de México la voz de alerta sobre la presencia de la moniliasis del
cacao se dio en marzo de 2005, por funcionarios de la Universidad Autónoma
de Chiapas. Este primer reporte fue en el municipio de Pichucalco, Ranchería
Zaragoza del estado de Chiapas. A partir de esta localidad se empezó a
diseminar a municipios cercanos y llegando hasta plantaciones del estado de
Tabasco; a finales del año 2006 se detectó en el municipio de Tuzantán y en
mayo del 2007 se reportó ya en plantaciones de Huehuetán pertenecientes al
Soconusco, otra de las regiones de mayor producción de cacao del estado
Chiapas y poseedores del legendario cacao criollo del Soconusco, hoy en día
esta presente en las principales regiones productoras de cacao de México
(Phillips-Mora, 2006, Estrada, 2010, Torres de la Cruz, 2010).
2.3.3. Clasificación Taxonómica: De acuerdo con Galindo y Enríquez (1985)
el organismo causante de la enfermedad fue descrito morfológicamente en
1933 por Ciferri y Parodi, quienes lo clasificaron como un hongo imperfecto, de
la clase deuteromicete, orden Moniliasis, género Monilia y especie roreri. Sin
embargo, en 1978, Evans y colaboradores y más tarde Pudrí (1986)
presentaron evidencias de que el hongo posee características propias de un
basidiomiceto y proponen su ubicación taxonómica como del Phylum: Hongos
37
mitospóricos, Clase: Hyfomycetes, Orden: Moniliales, Familia: Moniliacea,
Género: Moniliophthora y Especie: M. roreri (Cif. & Par).
2.3.4. Etiología: Thorold (1975), Kranz y colaboradores (1978) y Evans et al.,
(1978) describen que el hongo posee hifa hialina, septada, septa sin
conexiones de gancho pero con doliporo, de 1,5 a 5 milimicras de ancho. Las
conidias son de formación basal, su forma varia de globosa a elipsoidal; son
hialinas, forman cadenas de 4 a 10 conidias y miden de 7 a 10 de ancho por 9
a 14 milimicras de largo.
Los conidióforos son más o menos verticales, ligeramente ramificados y
ocasionalmente aislados y erectos. Algunas veces trifurcados, hialinos,
pluriseptados, con una constricción en la septa y miden de 9 a 50 milimicras de
longitud (Figura 1).
Figura 1. Conidióforos de M. roreri aislados de frutos infectados en
plantaciones de Pichucalco, Chiapas – México. Fuente Autora.
2.3.5. Sintomatología: Las investigaciones desarrolladas han permitido
determinar que los síntomas varían con la edad del fruto al momento de la
infección, y la velocidad de desarrollo está influenciada por las condiciones
ambientales, básicamente la temperatura y la humedad ambiental.
En condiciones naturales, la moniliasis ataca únicamente a los frutos, en
cualquier etapa de desarrollo, y al infectar los frutos menores de dos meses y
medio de edad, continúa su crecimiento aparentemente normal y luego
desarrolla protuberancias o tumefacciones de los tejidos del exocarpo, con una
38
coloración más clara y brillante que el resto de la mazorca. Después del
desarrollo de las protuberancias ocurre la muerte del chilillo.
Cuando los frutos infectados han completado la mitad o más de su desarrollo,
el síntoma más característico de la enfermedad es una mancha de color
marrón, oscuro y con borde irregular, denominado “mancha chocolate”, que se
manifiesta inicialmente en forma de pequeñas manchas aceitosas. Estas
manchas, crecen
rápidamente hasta
tornarse
de
color café
oscuro,
frecuentemente rodeadas de un halo amarillento y pueden llegar a cubrir
totalmente la mazorca, dando la apariencia de una pudrición; el necrosamiento
del tejido va del interior al exterior. Otro síntoma externo es la maduración
prematura de las mazorcas afectadas, que se manifiesta por una coloración
amarillenta de distribución irregular (López, et al., 2006).
2.3.6. Ciclo del hongo: Galindo y Enríquez (1983) indican que la fuente de
inóculo conocida capaz de producir infecciones son los conidios. El origen de
éstos para desarrollar una nueva infección define dos ciclos de vida del hongo:
Primario y secundario.
En el primer caso el inóculo llega a una mazorca sana procedente de un fruto
con infección reciente sobre el cual se ha desarrollado un estroma esporulante.
En el segundo caso, las esporas proceden de frutos infectados y momificados
en ciclos anteriores que permanecen en el árbol durante mucho tiempo.
Es posible que se sucedan ciclos primarios alternativos para el origen del
inóculo, como es la ocurrencia de la fase sexual del hongo o la posibilidad de
que el hongo permanezca infectando otras partes de la planta de cacao, o bien
que los conidios permanezcan en dormancia de una estación a otra.
Una vez desarrollados, los conidios son diseminados por los animales, los
insectos, el viento, la lluvia o el movimiento de los frutos esporulando durante la
labor de cosecha.
39
La espora germina y penetra la mazorca en todos los estados de crecimiento.
La penetración ocurre directamente a través de la epidermis y ocasionalmente
a través de los estomas, sin que sea necesaria la presencia de heridas.
Suárez (1980) describe que la penetración se realiza mediante uno a cinco
tubos germinativos que se extiende sobre la epidermis y produce las hifas de
infección. Estas hifas pueden observarse, después de ocho horas, creciendo
intercelularmente debajo de la epidermis; más tarde desarrollando los
conidióforos y conidios dentro de la corteza de la mazorca.
El período desde el inicio de la infección hasta la aparición de las manchas
color café varía con la edad del fruto atacado; se conoce que el fruto es más
susceptible en sus primeras etapas de desarrollo. En frutos que tienen entre
uno y dos meses de edad, la aparición de síntomas ocurre entre 30 a 45 días
después de la infección, mientras que en aquellos con edad mayor, los
síntomas aparecen entre 60 y 90 días.
A los tres o nueve días siguientes a la aparición de las manchas se forma el
estroma y tres o cuatro días después, aparecen las fructificaciones
reproductivas o esporas.
2.3.7. Epidemiología
2.3.7.1. Fuentes de inóculo: En cada región, las plantaciones sin manejo
agronómico y donde no se practica ninguna medida de control sanitario,
constituyen la principal fuente de la enfermedad y de donde se dispersa a otras
plantaciones. En el cacao debido a la producción permanente de mazorcas y la
presencia de microclimas favorables a la enfermedad, se produce una gran
cantidad de inóculo y muchos frutos son infectados.
Dentro de cada plantación, los frutos infectados, adheridos a las plantas
constituyen la fuente única y permanente de estructuras infectivas del hongo.
Se ha determinado que en estos frutos, el patógeno produce sus esporas por
periodos prolongados.
40
La cantidad de inóculo que se forma en una mazorca esporulante es abundante
y su máxima intensidad ocurre entre los primeros días. Al respecto,
Campuzano (1980) indica que un cm2 de micelio esporulante puede producir un
total de 45 millones de esporas y una mazorca completamente infectada está
en capacidad de producir 700 millones de esporas infectivas. Porras (1984)
cuantificó que la capacidad de liberación de conidios de frutos esporulantes fue
máxima en el primer mes, con un promedio de 546 mil conidios por mazorca,
pero se redujo después de dos meses.
Se ha observado una relación inversa entre la humedad relativa y la capacidad
de liberación de conidios, según lo señalan González (1982), quienes
cuantificaron 166 mil conidios por hora por mazorca en días soleados y secos y
43 mil conidios por hora por mazorca en días húmedos. El mismo autor (1984)
concluyó que a niveles superiores del 80% de humedad relativa, la liberación
de conidios es muy reducida.
Porras (1982) determinó que la mayor cantidad de esporas en el aire ocurrió
durante el día, reduciéndose considerablemente en la noche, especialmente
durante las horas de la madrugada.
Los quebraderos y lugares donde se colocan la cáscara de los frutos
cosechados, constituye una importante fuente de inoculo. Sirven de sustrato
para que M. roreri pueda desarrollarse, esporular e infectar frutos sanos,
ocasionando nuevas infecciones.
2.3.7.2. Condiciones ambientales favorables a la enfermedad: Las
condiciones ambientales que propician la infección y el desarrollo de la
epidemia, generalmente ocurren en la temporada de lluvias. Las esporas
requieren de agua o de una humedad relativa cercana al 100% para su
germinación. El crecimiento vegetativo requiere de una temperatura de 24 a
26°C y el desarrollo favorable de la enfermedad se sucede a una temperatura
entre 22 a 30 °C. Por encima o por debajo de estos valores, la agresividad de
la infección se reduce.
41
De acuerdo con Suárez (1979) una alta humedad relativa (mayor del 80%) y
temperaturas cercanas a los 22°C favorecen la germinación de los conidios, en
cambio Campuzano (1980) cuantificó la mayor germinación de esporas a una
temperatura de 20°C y una humedad relativa del 100%.
Dentro de las plantaciones, las condiciones que favorecen alta humedad y por
lo tanto el desarrollo de la moniliasis, son el drenaje deficiente del suelo,
plantas muy altas y con exceso de sombra y sin la ejecución de labores
culturales, especialmente la poda, la regulación de la sombra y el control de las
malas hierbas.
La magnitud del daño y la diseminación de la enfermedad dependen, en gran
medida, de las condiciones ambientales existentes en cada región.
En
Colombia, Merchán (1980) indica que en áreas con períodos de sequía
relativamente largos, con precipitación media inferior a 1500 mm y humedad
relativa menor del 80%, el grado de incidencia de la enfermedad no sobrepasa
el 60% de los frutos atacados; mientras que, en áreas de precipitación mayor a
los 2000 mm y humedad relativa ambiental del 90%, la incidencia puede
alcanzar el 95% de frutos infectados. El mismo autor encontró una correlación
positiva entre la incidencia de la moniliasis y la cantidad de lluvia ocurrida dos o
tres meses atrás. Según Porras (1982) una correlación similar fue observada
por Desrosiers y colaboradores en 1951 – 1954 entre la incidencia de la
enfermedad y la lluvia caída cuatro meses antes.
Jorgensen (1970) considera que la incidencia de la moniliasis en Pichilingue y
Costa del Pacifico en Ecuador, está directamente relacionada con la cantidad
de precipitación cuando los frutos son jóvenes.
Suárez (1980) describe que en Ecuador la moniliasis es más grave en los
lugares próximos a la Cordillera de los Andes, donde las pérdidas alcanzan del
85 al 90%, y en años y lugares de máxima precipitación, las pérdidas promedio
se elevan del 50 al 80%.
42
2.3.7.3. Diseminación de Moniliophthora roreri: Las esporas de M. roreri se
diseminan fácilmente; debido a que las esporas del hongo son secas, éstas se
desprenden fácilmente al golpear los frutos o por efecto del viento y de las
gotas de lluvia. Esto se repite continuamente, liberándose una gran cantidad de
esporas infectivas que al llegar a frutos sanos desarrollan la enfermedad.
El hombre, al transportar frutos o semillas procedentes de áreas infectadas a
las áreas libres, también ha jugado un papel importante en la diseminación de
la moniliasis. De esta forma es probable que el patógeno se haya dispersado a
diferentes regiones cacaoteras, superando barreras geográficas naturales. En
otros materiales, como costales, herramientas de trabajo, etc., es posible que
se transporten esporas, las cuales podrían producir infecciones en caso de
llegar a frutos en condiciones ambientales favorables (López, et al., 2006).
2.3.8. Tecnologías generadas para el manejo de la moniliasis: El manejo de
esta enfermedad se basa en la integración de prácticas agronómicas como son
la tecnificación, la reducción del inóculo primario, la siembra de clones de alta
productividad, y la implementación permanente de prácticas de saneamiento y
de manejo cultural.
Los factores ambientales son determinantes para la germinación y desarrollo
de las esporas. Por esta razón, las prácticas orientadas a la reducción del agua
sobre la superficie de los frutos o la disminución de la humedad dentro de la
plantación, ayudan a reducir la intensidad de la enfermedad.
De esta manera las prácticas culturales son hasta el momento las que han
brindado mejores resultados tanto en la reducción de la incidencia de la
enfermedad como en los costos del manejo de la misma, se recomienda el
remover del árbol los frutos afectados en cualquier estado de desarrollo y
dejarlos en el piso tapados con hojarasca.
Otras prácticas están relacionadas con el tratamiento de los quebraderos y
residuos de cosecha, el derribo de plantaciones abandonadas o sin manejo, la
mejora del sistema de drenaje, la regulación de la sombra, la cual no debe
43
sobrepasar el 50% y la realización de podas de los árboles del cacao bajando
el porte de los mismos a 3 m.
Se recomienda el reemplazo total de plantaciones muy viejas y poco
productivas con material genético de alto rendimiento, así como suministrarles
fertilizantes o abono orgánico.
Para el control de la moniliasis del cacao han sido probados en diversos
lugares fungicidas de síntesis química; sin embargo, los resultados no son del
todo satisfactorios o son inconsistentes de año a año. Otro punto que se
cuestiona son las altas frecuencias de aplicación y el costo de los productos ya
que resulta a menudo antieconómico para el cacaotero (Meza y León, 1972;
Sánchez, et al., 2003; Merchán, 1980 y Barros, 1982). De acuerdo con las
Investigaciones realizadas en Ecuador y en Costa Rica (Suárez, 1979;
González, 1982) los fungicidas Bravo 500  (i.a.Clorotalonil) y Macuprax  (i.a.
mancozeb 80%) son promisorios en el combate de esta enfermedad, Torres de
la Cruz (2010) reporta que una sola aplicación de Azoxystrobin (250 g.i.a.ha-1)
a frutos menores de dos meses de edad y después tres aplicaciones de
hidróxido de cobre son efectivos en la reducción de la incidencia de la
enfermedad.
En la actualidad se evalúan cepas nativas de hongos y bacterias para su
manejo, los resultados en laboratorio muestran buena eficiencia de control, sin
embargo falta mayor desarrollo de los mismos (Evans, 1999; Rodríguez, 2005).
El uso de la resistencia genética se inició desde que se detectó la enfermedad
Sánchez (1982), por medio de clones clasificados como resistentes; trabajos
recientes desarrollados en Costa Rica por Phillips, 2004 reportan más de 100
clones, los cuales están siendo probados en diversos ambientes, pero sin que
hasta la fecha se haya masificado su uso. Además, aun es necesario estudiar
si esta resistencia es heredable, así como el mecanismo de transmisión de los
clones a las descendencias híbridas, y por otra parte, si éstas resultan de buen
rendimiento y calidad organoléptica (Brenes, 1983; Arguello, 2000; Palencia,
2003; Phillips, 2004, Pinzón, 2004, Phillips, 2006).
44
2.4. Los extractos de plantas y su poder para el manejo de problemas
fitosanitarios.
La humanidad tuvo conocimiento de las virtudes toxicológicas, farmacológicas
y alucinógenas de las plantas con mucha anterioridad a su real descubrimiento
por la fitoquímica.
Los plaguicidas naturales han sido usados en la agricultura como una
alternativa para el manejo de problemas fitosanitarios, los que comprenden:
fungicidas,
fungistáticos,
insecticidas,
antialimentarios,
inhibidores
de
crecimiento, hormonas juveniles de muda, deterrentes de la oviposición,
atrayentes, repelentes y disuasores. Estos pueden constituirse en buenos
modelos para el desarrollo de productos sintéticos análogos o ser usados como
ingredientes activos si están disponibles en abundancia (Ayyangar y
Nagasampagi, 1993, citados por Vergara, 1997).
La importancia de las plantas, se debe a que contienen principios activos en
algunos de sus órganos, los cuales, extraídos en forma adecuada y
administrados en dosis suficientes, producen efectos curativos que permiten el
manejo de microorganismos fitopatógenos y de insectos – plaga en los cultivos.
El estudio de los componentes de las plantas medicinales se centra en las
sustancias que ejercen una acción farmacológica sobre los seres vivos. Los
principios activos de las plantas pueden ser sustancias simples (como
alcaloides) o bien mezclas complejas (resinas, aceites esenciales, etc.). Los
compuestos más comunes son los azúcares y heterósidos, que pueden ser
glucósidos, galactósidos, etc. Otros componentes activos de las plantas son
alcaloides, lípidos, gomas, mucílagos, principios amargos, taninos, aceites
esenciales, resinas, bálsamos, oleorresinas, ácidos orgánicos, enzimas y
vitaminas. Los principios vegetales que ejercen acción farmacológica
generalmente son los producidos por la planta en su metabolismo secundario.
Para Vergara (1997), las especies de plantas que pueden ser utilizadas para
obtener extractos con poder plaguicida, deben poseer las siguientes
45
características: ser perennes, ocupar poco espacio y necesitar de poco agua y
fertilizantes; no destruirse cada que se obtienen sus partes para elaborar
extractos, que no se conviertan en maleza ni traigan plagas de cultivos y que
además posean usos complementarios. Los extractos crudos de estas
especies podrían obtenerse con tecnologías sencillas, ser de fácil consecución
y ambientalmente seguros sin que ocasionen problemas ecológicos.
Según Godfrey (1994), los productos naturales han jugado un papel
significativo en el descubrimiento de nuevos fungicidas y bactericidas, ya sea
por aplicación directa de los productos obtenidos de las plantas o desarrollo de
análogos en los que se les optimiza propiedades biológicas o físicas. El uso de
fungicidas naturales se remonta a agricultores romanos quienes usaron varios
extractos en el control de infecciones fúngicas en sus cultivos.
Los productos naturales pueden ser explorados en varias vías en el desarrollo
de nuevos fungicidas para la agricultura. Los extractos pueden ser usados
como un extracto crudo para aplicación directa a los cultivos. Alternativamente
una vez purificado el ingrediente activo puede ser formulado en mezclas o
puede ser usado con productos sintéticos. Cuando un producto natural tiene
una actividad insuficiente se le realiza una semisíntesis o modificación química,
con el propósito de optimizar sus propiedades, reducir la fitotoxixidad e
incrementar la fotoestabilidad. Por último el ingrediente activo del producto
natural puede ser la base para la síntesis de otras moléculas para la
formulación de pesticidas de síntesis química (Godfrey, 1994).
Para Ramírez, (2006) la elaboración de extractos debe ser basado en el uso de
técnicas simples y fácilmente reproducibles por los productores, utilizando
métodos como el de infusión, extracción con alcohol o fermentación, entre
otros.
Existen diversas investigaciones que demuestran el potencial de los extractos
de plantas en el manejo de problemas fitosanitarios ocasionados por hongos,
tal es el caso del control de mildeo polvoso (Sphaeroteca panosa var. rosae) en
rosa en condiciones de invernadero, con el lixiviado del raquis del plátano al
46
5% (Álvarez et al., 2002). Se evaluaron 20 extractos hidroalcoholicos (hojas,
raíces, tallos, botones florares, frutos) pertenecientes a 13 familias para el
control de sigatoka (Mycosphaerrela fijiensis) en plátano, de los cuales ocho
presentaron buen nivel de control (Arciniegas et al., 2002).
Trabajos realizados en condiciones de laboratorio y campo por Miño y
Uricohechea (2001),
Velosa et al., (2003) y Gutiérrez et al., (2003),
demuestran como la forma de extracción de una misma planta puede variar el
efecto de control del moho gris (Botrytis cinerea Pers. Ex. Fr.) en el cultivo de
mora (Rubus glaucus Benth), siendo las mejores el purin, presurizado e
hidrolato y que las mejores plantas para el manejo de éste patógeno fueron la
canela y el ajo.
Investigaciones desarrolladas por La-Rotta y Avila, (2002) y Ramírez y Avila
(2002), establecieron que los hidrolatos de uchuva (Physalis peruviana),
hierbamora (Solanum nigrum) y sauco (Sambucus nigra), al 2, 5 y 10%
respectivamente ejercen un buen nivel de control de Cladosporium sp. y
Stemphylium sp. en cebolla de bulbo (Allium cepa) y para Sclerotium cepivorum
la mezcla de hidrolatos de manzanilla (Matricaria chamomilla), hierbamora
(Solanum nigrum) y eucalipto (Eucalipto globulus) fue una de las mejores.
2.4.1. Metabolitos Secundarios: Un gran porcentaje de los principios activos
de plantas está comprendido dentro de los llamados productos naturales o
metabolitos secundarios (alcaloides, esteroides, terpenoides, flavonoides, etc.),
que son compuestos químicos de estructura relativamente compleja que no
tienen utilidad aparente para el ser que los sintetiza, y de distribución más
restringida y más característica de fuentes botánicas específicas, que los
llamados metabolitos primarios o productos bioquímicos que presentan una
utilidad definida y que son comunes a todos los seres vivos (proteínas, ácidos
grasos, polisacáridos, etc.). La clasificación de los metabolitos secundarios
puede hacerse de acuerdo a su estructura, a su bioformación, a la fuente de
producción y a su acción biológica.
47
La mayoría de los agentes alelopáticos son metabolitos secundarios derivados
de las rutas acetato- mevalonato o del ácido shikimico. Provienen de la ruta
metabólica del acetato- melovato: terpenos, esteroides, ácidos orgánicos
solubles en agua, alcoholes de cadena lineal, aldehídos alifáticos, cetonas,
ácidos grasos insaturados, insaturados simples, ácidos grasos de cadena
larga, poliacetilenos, naftoquinonas, antroquinonas, quinonas complejas y
floroglucidos. Provienen de la vía metabólica del shikímico: fenoles simples, el
ácido benzoico y sus derivados, el ácido cinámico y sus derivados, cumarinas,
sulfuros, glicósidos, alcaloides, cianhidrinas y algunos derivados de quinonas y
taninos hidrolizables y condensados. Existen también compuestos como los
flavonoides en cuya síntesis participan metabolitos de las dos rutas.
Las concentraciones de estos compuestos en los tejidos varían según el ritmo
de la biosíntesis, almacenamiento y degradación. También son afectados por
los balanceos internos de reguladores de crecimiento vegetal y otros factores
bióticos y abióticos (Samprieto 2002; Hoss 1999).
Para Lindsey (1989), la importancia biotecnológica de los metabolitos
secundarios es triple: primero puede tratarse de compuestos químicos de valor
comercial, segundo una serie de ellos son tóxicos y deben eliminarse de los
alimentos; y tercero, podría actuar como agentes protectores, utilizados por la
planta contra agentes patógenos e insectos y animales herbívoros. Un gran
número de compuestos químicos importantes desde el punto de vista comercial
derivan directamente de material comercial y se trata casi invariablemente de
metabolitos secundarios, con frecuencia difíciles de sintetizar químicamente. La
aplicación de estos productos puede clasificarse en cinco grupos: fármacos,
aromas, perfumes, pigmentos y plaguicidas.
Para Pedrozo (2006), en los agroecosistemas, las plantas están expuestas a
factores bióticos y abióticos con los cuales han co-evolucionado. La presión de
selección ejercida por estos factores a lo largo del proceso evolutivo provocó el
desarrollo, en los mismos vegetales, de numerosas rutas biosintéticas a través
de las cuales producen y acumulan en sus órganos una gran variedad de
48
metabolitos secundarios, muchos de los cuales juegan un importante papel en
interacciones complejas entre organismos vivos (efectos aleloquímicos) en el
entorno natural.
49
CAPITULO 3.
METODOLOGÍA
50
CAPITULO 3. METODOLOGÍA
3.1. Diseño de la investigación
En el siguiente esquema se aprecian los pasos que se siguieron para el
cumplimiento de los objetivos planteados, los cuales se desarrollaron en tres
fases.
AISLAMIENTO DE
Moniliophthora roreri
RECOLECCIÓN DE
MATERIAL VEGETAL
MULTIPLICACIÓN In vitro
de Moniliophthora roreri
OBTENCIÓN DE
EXTRACTOS
SCREENING DE LABORATORIO
SELECCIÓN DE MEJORES
EXTRACTOS
DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN
MINIMA INHIBITORIA (CMI)
SELECCIÓN MEJORES
EXTRACTOS Y CMI
PRUEBAS DE CAMPO PARA DETERMINAR EFECTIVIDAD DE
EXTRACTOS SELECCIONADOS
PRUEBAS FITOQUIMICAS PARA DETERMINACIÓN DEL
PRINCIPIO ACTIVO DEL EXTRACTO SELECCIONADO
EN CAMPO
51
3.2. Ubicación geográfica
La primera fase de la investigación se desarrolló en el Laboratorio de
Biotecnología de la Facultad de Ciencias Agrícolas de la Universidad Autónoma
de Chiapas en Huehuetán, Chiapas – México; en la cual se realizaron pruebas
para la determinación in vitro de la efectividad de los extractos, y determinar su
concentración mínima inhibitoria (CMI).
3.3. Materiales
3.3.1. Material biológico
Las plantas evaluadas fueron las siguientes:
Nombre
común
Pimienta dioica L.
Pimienta
Zingiber officinale Roscoe
Cinnamomum zeylanicum
Nees
Jengibre
Syzygium aromaticum L
Clavo
Origanum vulgare L.
Tradescantia spathacea
Swartz
Orégano
Parte
utilizada
Semilla
Hoja
Rizoma
Hoja
Astilla
Hoja
Semilla
Parte aérea
Maguey
Hojas
Nombre Científico
Canela
Familia
Myrtaceae
Zingiberáceas
Lauraceae
Myrtaceae
Labiateae
Commelinaceae
Patógeno evaluado: Moniliophthora roreri.
3.3.2. Material de Laboratorio
Autoclave, cámara de flujo laminar, destilador de agua, equipo para obtención
de hidrolatos, microscopio, cámara fotográfica, hemacitómetro, estufa, agitador
magnético, cajas de petri, erlemeyers, beakers, barras de vidrio, medio Papa –
Dextrosa – Agar (PDA), agar, jugo de verduras V8 , jugo de la cáscara del
fruto de cacao, agua destilada, bolsas de tela, sala de cultivos climatizada.
52
3.4. Métodos
3.4.1. Obtención de extractos vegetales
3.4.1.1. Presurizado: Proceso de extracción que consiste en hacer cocer el
material vegetal en una olla de presión para la obtención de un caldo vegetal.
Se
colocó dentro de una olla a presión 300 g. de material vegetal fresco
finamente picado en 1 litro de solvente que consistió de una solución de agua
destilada. Se tapó herméticamente y se sometió a calor por un periodo de 15
minutos sin permitir la salida del vapor, se dejó enfriar sin quitar la tapa y
posteriormente se filtró.
3.4.1.2. Hidrolato por destilación: Para el proceso de extracción se utilizó 3
kg de material vegetal fresco bien picado y macerado en 10 litros de solvente
que consistió de una solución de agua. Para la obtención del extracto se
empleó un destilador adaptado para obtención de extractos. El material vegetal
se colocó dentro de la marmita del destilador junto con el solvente, se tapó
herméticamente para hacer el proceso de extracción continuo mediante la
aplicación de calor y presión constante, el vapor es conducido a un
condensador y mediante enfriamiento con agua corriente se obtuvo el
Hidrolato.
3.4.1.3. Fermentado aeróbico: Se colocó el material vegetal (300 gramos)
finamente picado en un recipiente de vidrio adaptado como biofermentador y se
le agregó un litro de agua destilada. La mezcla se revolvió todos los días para
que se oxigene y fermente, hacia el día 14 se filtró.
3.4.1.4. Fermentado anaeróbico: En su elaboración se emplearon 300
gramos de materia fresca en un litro de agua destilada. El material finamente
picado es colocado en un recipiente de vidrio cerrado herméticamente,
adaptado para el proceso de biofermentación con una válvula de seguridad
para salida de gases. El proceso de fermentación duró 14 días, tiempo después
del cual el extracto se obtuvo por filtración del compuesto.
53
3.4.2. Aislamiento del patógeno.
El hongo M. roreri se obtuvo de muestras de tejido enfermo colectado en
plantaciones de cacao de productores del municipio de Pichucalco del estado
de Chiapas, para lo cual se colectaron frutos enfermos de donde fue aislado el
hongo y cultivado en condiciones de laboratorio, en cajas de petri de plástico
estéril de 60 mm de diámetro en medio de cultivo compuesto por papadextrosa-agar (PDA) marca Difco®.
3.4.3. Trabajo en condiciones de laboratorio
3.4.3.1. Evaluación de extractos mediante el método de difusión en Agar
Montaje de ensayo al 50% de concentración. Se realizó un ensayo
exploratorio en la que cada extracto se añadió de manera individual al medio
de cultivo, a una concentración del 50% (volumen/volumen); una vez preparado
el medio con el extracto se procedió a la inoculación del hongo, fueron
mantenidos en sala de cultivo bajo condiciones controladas de 23oC +/- 2 oC.
Se incluyó como testigos; uno absoluto en el cual el hongo fue cultivado en el
medio original (PDA) sin ningún control y otro testigo mineral en el cual se
incorporó el polisulfuro de calcio al 10%. El total de tratamientos fueron 38 y se
presentan en el Cuadro 1.
Cuadro 1. TRATAMIENTOS EVALUADOS
Nombre Científico
Parte a
utilizar
Semilla
Pimienta dioica L.
Hoja
Zingiber officinale
Roscoe
Rizoma
Cinnamomum
Hoja
Forma de extracción
Hidrolato
Presurizado
F. aeróbico
F. anaeróbico
Hidrolato
Presurizado
F. aeróbico
F. anaeróbico
Hidrolato
Presurizado
F. aeróbico
F. anaeróbico
Hidrolato
Codificación del
tratamiento
T1
T2
T3
T4
T5
T6
T7
T8
T9
T10
T11
T12
T13
54
zeylanicum Nees
Astilla
Hoja
Syzygium aromaticum L
Semilla
Origanum vulgare L.
Parte aérea
Tradescantia spathacea
Swartz
Hojas
Testigo Absoluto
Testigo Mineral
Presurizado
F. aeróbico
F. anaeróbico
Hidrolato
Presurizado
F. aeróbico
F. anaeróbico
Hidrolato
Presurizado
F. aeróbico
F. anaeróbico
Hidrolato
Presurizado
F. aeróbico
F. anaeróbico
Hidrolato
Presurizado
F. aeróbico
F. anaeróbico
Hidrolato
Presurizado
F. aeróbico
F. anaeróbico
PDA
Polisulfuro de
calcio
T14
T15
T16
T17
T18
T19
T20
T21
T22
T23
T24
T25
T26
T27
T28
T29
T30
T31
T32
T33
T34
T35
T36
T37
T38
El efecto inhibitorio se cuantificó mediante el crecimiento cada 24 horas del
diámetro del micelio del patógeno, midiendo para ello el crecimiento presentado
por el hongo dentro de cada placa petri, durante 12 días. También se cuantificó
la producción de esporas, para ello se realizó un raspado superficial del hongo,
y se realizó un lavado de este raspado con agua y se empleó la dilución
apropiada hasta lograr contarlas en la cámara de Neubauer y se empleó la
siguiente fórmula para determinar el número de esporas por mililitro:
No esporas/ml = No. esporas contadas * dilución * 2500.
La unidad experimental fue constituida por una caja de petri y los tratamientos
fueron distribuidos en un diseño completamente al azar con cinco repeticiones.
Para determinar los efectos de los tratamientos estudiados, a los datos
obtenidos se realizó un análisis de varianza y la prueba de comparación de
medias de Tukey al 5%.
55
Determinación de la concentración mínima inhibitoria
Los extractos que presentaron inhibición total del crecimiento y desarrollo del
patógeno, se utilizaron para los ensayos correspondientes a la etapa en la
que se determinó la concentración mínima inhibitoria; estos productos fueron
evaluados a concentraciones del 40, 30, 20 y 10%.
Se preparó el medio de cultivo con PDA al cual se añadió cada uno de los
extractos a las concentraciones a estudiar, posteriormente se realizó la
inoculación del patógeno.
Como variable indicadora del efecto inhibitorio se midió cada 24 horas el
diámetro de crecimiento del micelio del patógeno durante 12 días también se
cuantificó la producción de esporas mediante el uso de la cámara de conteo de
esporas Neubauer, tal como se describió anteriormente.
Los tratamientos fueron distribuidos en un diseño completamente al azar con
cinco repeticiones cada uno; la unidad experimental consistió de una caja de
petri. En todas las pruebas se incluyó un testigo absoluto y uno químico (i.a.
polisulfuro de calcio). Para determinar los efectos de los tratamientos
estudiados, a los datos obtenidos se les practicó un análisis de varianza y la
prueba de comparación de Tukey al 5%.
3.4.3.2. Método de discos de papel. Con el fin de poder tener un control de
tipo químico, para la realización de las pruebas mediante el Método de discos
de papel se probaron seis productos de síntesis química, con reportes de
actividad sobre hongos algunos de ellos con reporte sobre el género Monilia y
otros sobre la especie roreri. Los productos probados fueron los siguientes:
56
PRODUCTO COMERCIAL
INGREDIENTE ACTIVO
DOSIS DEL
FABRICANTE
Ziram granuflo®
Bis- dimetil ditiocarbamato de Zn 76%
5 g/L
Tamis®
Carbamida 21%
5 mL/L
Eco 720®
Clorotalonil 54%
5 mL/L
Barrida®
Clorotalonil 72%
5 g/L
Ridomil gold Bravo 76.5
PH®
Clorotalonil + Metalaxil
1.5 g/L
Ranman®
Cyanoimidazole
1 mL/L
El método de discos de papel es una prueba cualitativa, en la cual se usaron
cajas de petri de 100 mm con medio PDA donde se realizó la siembra en el
centro de cada caja de un disco del hongo previamente cultivado en medio
PDA y con un tiempo de incubación de 8 días; a una distancia de 3 cm del
disco con hongo se colocaron los discos de celulosa de grosor 9 mm y 7 mm
de diámetro previamente impregnados con cada uno de los extractos, por caja
petri se colocaron las cuatro formas de extracción por cada planta y un testigo
químico. Se dejó en incubación en sala de cultivo bajo condiciones controladas
de 23°C +/- 2°C y se realizó la lectura de los halos de inhibición que se
presentaron en torno a los discos de papel que contenían las muestras. Se
utilizaron cuatro repeticiones por tratamiento. El testigo químico fue Ziram ® con
i.a. ditiocarbamato de Zn.
Para el caso de las pruebas para determinación del control químico se usaron
discos de papel Whatman No. 2 de 7 mm de diámetro y cajas petri de 50 mm.
3.4.3.3. Método de disco de papel Kirby-Bauer: Se preparó el medio de
cultivo PDA y se mantuvo en baño María a 45°C, se inoculó la solución
homogeneizada del hongo M. roreri y se vertió 15 mL en placas petri de 100
mm. Una vez solidificado el medio, se colocaron discos de celulosa de grosor 9
mm y de 7 mm de diámetro impregnados con los extractos sobre el medio a un
radio de 30 mm del centro de la caja, posteriormente se incubó a 23°C.
Después de 24 horas de incubación cada placa fue examinada. El testigo
químico fue Ziram® con i.a. ditiocarbamato de Zn.
57
Para el desarrollo del método de disco de papel Kirby-Bauer también se
realizaron pruebas para la determinación del control químico, para este caso se
usaron discos de papel Whatman No. 2 de 7 mm de diámetro y cajas petri de
50 mm.
Para la interpretación de los resultados respecto a la actividad del extracto
(propuesto por Monks et al., (2002)), se establecen las siguientes categorías
interpretativas para los diámetros de las zonas de inhibición:
(-) No hay actividad
(+) Actividad leve o débil (diámetro entre 7 -11 mm)
(++) Actividad moderada (diámetro entre 11-16mm)
(+++) Actividad fuerte (diámetro mayor a 16 mm)
3.4.3.4. Determinación del medio para la formación y germinación de
conidias de monilia. Para determinar el mejor medio para la germinación de
conidias de M. roreri, se evaluaron tres medios de cultivo: agua destilada
estéril, agua destilada estéril con sucrosa al 2% y agua destilada estéril con
extracto de cacao. Para su realización se emplearon tubos de ensayo en los
cuales se agregaron los medios correspondientes y se esterilizaron, una vez
fríos en cámara de flujo laminar se agregó tween 80 al 0,01% y se realizó el
raspado del hongo de una placa de petri de 60 mm (de 12 días de crecimiento),
para cada uno de los tubos. Cada una de estas soluciones se llevaron a
dilución de 1x10-2, para realizar la lectura del número de conidias totales y el
número de conidias germinadas en el microscopio en la cámara Neubauer,
realizando lecturas a las 12, 24, 48 y 72 horas.
3.4.3.5. Evaluación de tratamientos sobre la formación y germinación de
conidias de M. roreri. Para este propósito se preparó una solución madre que
contenía 80 mL de agua destilada estéril y 20 mL de extracto de cacao, se
tomaron conidias jóvenes de M. roreri previamente cultivadas en seis placas
petri en medio agar-extracto de cacao- jugo V8 de 12 días de edad, las cuales
fueron raspadas y lavadas con una parte de la solución madre a la cual se le
agregó tween 80 al 0,01% y su contenido agregado a la solución madre, la cual
58
se homogenizó con un ayuda de agitador magnético por una hora. Una parte
se agregó en cuatro tubos de ensayo a los cuales previamente se les había
vertido la concentración correspondiente al tratamiento a evaluar y otra parte a
otros cuatro tubos con agua destilada que correspondieron al testigo absoluto.
Los tubos de ensayo que contenían estas suspensiones fueron incubados a
25ºC en oscuridad y cada 24 horas se realizó diluciones de 1x10-2 para poder
hacer la lectura en el microscopio con la ayuda de una cámara de Neubauer y
contabilizar el número de esporas totales y las germinadas de las 12, 24, 48, 72
y 96 horas.
Variables:
Las variables que se evaluaron fueron: número de conidias totales y número de
conidias germinadas, empleando para su cálculo las siguientes fórmulas:
Conidias totales = No. Conidias totales *2500*Dilución.
Conidias germinadas = No. Conidias germinadas *2500*Dilución.
Tratamientos:
Los tratamientos evaluados fueron seis, hidrolatos de canela corteza al 50%,
clavo semilla al 50% y pimienta semilla al 50%, polisulfuro de calcio 50%, Ziram
i.a. ditiocarbamato de zinc al 5 mg/mL y un testigo absoluto consistente en
agua destilada.
Diseño Experimental:
Se empleó un diseño experimental completamente al azar con seis
tratamientos. Cada tratamiento tuvo cuatro repeticiones y en cada repetición se
realizaron tres lecturas. La unidad experimental fue un tubo de ensayo. Para
determinar si existieron diferencias significativas en cada uno de los
tratamientos se realizó el análisis de varianza y se aplicó la prueba de
comparaciones de medias de Tukey al nivel de significancia de 5%, cuando
existió diferencia significativa. Los datos fueron procesados en el programa
SPSS versión 13.0 para Windows.
59
3.4.4. Trabajo en condiciones de campo
La fase 2 de la investigación comprendió tres ensayos en condiciones de
campo,
los ensayos se realizaron en el periodo de noviembre de 2008 a
diciembre de 2009. Ensayo 1, consistente en la determinación del ciclo de la
enfermedad, y los Ensayos 2 y 3 destinados a evaluar el efecto de los extractos
vegetales sobre la incidencia de M. roreri en cacao; los tres ensayos se
realizaron sobre una plantación monoclonal (clon UNACH 130) de cacao,
ubicada a 14° 52’ 33.4’’ de latitud norte y 92° 21’ 28.8’’ de longitud oeste, a una
altitud de 47 m, en el municipio de Tapachula, estado de Chiapas, México.
El clon registra las siguientes características:
PARAMETROS
Clon UNACH 130
Cacao real del soconusco
Rendimiento
6 kg/planta/año
Mazorcas por kilo
18
Semillas por Kilo
732
Peso promedio por grano
1,37 g
% de Testa
12,5 %
Contenido de grasa
50,5 %
pH
5,53
Semillas
Largo
2,22 cm
Ancho
1,32 cm
Diámetro
0,83 cm
3.4.4.1. Determinación del ciclo de la enfermedad. Para la realización de
este ensayo se obtuvieron frutos de cacao por polinización artificial; los cuales
fueron inoculados con M. roreri a diferentes edades de desarrollo de los frutos
(1, 2, 3, 4 y 5 meses de edad después de la polinización), determinando sobre
ellos los días en que se presentaron los síntomas y signos de la enfermedad.
Se realizó la polinización manual de flores de cacao recién abiertas, con la
finalidad de tener frutos de la misma edad. Inmediatamente después de la
polinización, se protegieron las flores con frascos de plástico, para asegurar
que los frutos fueran producto de la polinización manual y no de la natural.
Permitiendo así asegurar la misma edad de todos los frutos y que no hubiera
infección alguna por M. roreri, antes de la inoculación manual. A los ocho días
60
de la polinización se retiraron los frascos de plástico y se procedió a realizar el
embolsado de cada uno de los frutos, con bolsas de polietileno, esto para evitar
que los frutos se contaminaran con esporas del medio ambiente.
Se preparó el inoculo (conidias) de M. roreri a partir de mazorcas provenientes
del campo en estado de mancha, éstas se lavaron, desinfectaron por 10
minutos en una solución de hipoclorito de calcio al 10% y se colocaron a
esporular en una cámara húmeda ubicada en el laboratorio. Una vez que la
mazorca esporuló y las conidias alcanzaron la madurez (coloración crema),
éstas se colectaron por gravedad en cajas de Petri colocadas en la base de la
cámara (Merchán, 1991).
Para determinar la concentración de inóculo presente en una aguja de
disección, se realizaron 10 conteos, disolviendo las conidias adheridas a la
punta de una aguja de disección en 200 ml de agua destilada con 2 gotas de
Tween 80 al 0,1% esta solución se llevó a agitación por un tiempo aproximado
de 10 minutos. En la cámara de Neubauer se determinó la concentración
promedio de esta solución.
Se realizó la inoculación de M. roreri en frutos de uno, dos, tres, cuatro y cinco
meses de edad; utilizando conidias secas adheridas a la punta de una aguja de
disección (9 x 104 conidias/mL), las cuales se depositaron en una zona de dos
centímetros cuadrados de la zona previamente marcada con esmalte y
humedecida con agua estéril. Posterior a la inoculación los chilillos fueron
protegidos en una cámara húmeda constituida por una bolsa de polietileno y
una toalla de papel empapada con agua estéril, con el propósito de humedecer
el ambiente interno y favorecer la germinación de las esporas; la toalla de papel
se retiró dos días después cortando uno de los extremos de la bolsa y con
ayuda de una pinza. El sitio de inoculación se marcó para facilitar el
seguimiento del desarrollo de la enfermedad y la aparición de los síntomas
iniciales y finales en el ensayo (Adaptado de la metodología de Merchán,
1981).
61
Variables cuantificadas:
Fueron síntomas, signos e índice de severidad interna, la toma de datos se
realizó todos los días a partir del primer mes de inoculación, hasta que terminó
el ensayo.
 Síntomas. Son manifestaciones visibles; éstas resultan de la interacción
entre los mecanismos del ataque del patógeno y los mecanismos de
defensa del hospedante y de los efectos fisiológicos de la enfermedad
(Arauz, 1998). Para el caso de M. roreri se cuantificó la presencia y días
en que aparecieron gibas, manchas mosaico, decoloración y mancha
aceitosa.
 Signos. Manifestaciones del patógeno discernibles a simple vista; entre
los signos comúnmente asociados a una enfermedad, están las
estructuras reproductoras o vegetativas del hongo (Arauz, 1998). Se
cuantificó la presencia y los días en que su manifestaron tanto el Inicio
de la esporulación (esporas - polvo blanco) y las esporas maduras
(polvo color crema).
 Índice de severidad interna. A los seis meses de edad todos los frutos
fueron cosechados, se abrieron longitudinalmente, agrupado según cada
mes de inoculación y se evaluó el daño ocasionado en el interior de los
frutos, por M. roreri. Para determinar la severidad interna de los frutos se
utilizó la escala propuesta por Sánchez et al., (1987), donde mide el
porcentaje de área necrosada desarrollada por M. roreri, así: grado 0=
0%; 1=1-20%; 2= 21-40%; 3= 41-60%; 4= 61-80%; 5=100%. Esta
variable muestra la capacidad de daño interno que puede causar el
hongo en la mazorca afectando los granos.
 La unidad de muestreo fueron 10 frutos inoculados con M. roreri por
cada mes de edad de los frutos, donde cada fruto fue una repetición, es
un ensayo de tipo descriptivo.
62
3.4.4.2. Efecto de extractos sobre inhibición de la germinación. Para
desarrollar este ensayo se realizó la polinización artificial de las flores del clon
UNACH 130, con la finalidad de obtener frutos de la misma edad y sin
incidencia de monilia, para lo cual se tomaron flores abiertas y se les quitaron
los pétalos y se unieron sus anteras con el estigma de la flor también abierta
que estaba en el árbol, luego se colocó un dispositivo plástico para aislar la flor
y se esperó a su desarrollo; posteriormente se preparó el inoculo de M. roreri
según la metodología descrita por Merchán, (1991).
Sobre frutos de una edad cercana a los 70 días se realizó la aspersión de cada
uno de los extractos y del polisulfuro de calcio y se cubrieron con una bolsa de
polietileno y se colocó una toalla húmeda por espacio de tres días, luego se
destapó y se realizó la inoculación de M. roreri, utilizando conidias secas
adheridas a punta de una aguja de disección (9 x 10 4 conidias/mL), las cuales
se depositaron en una zona de dos centímetros cuadrados de la zona
previamente marcada con esmalte y humedecida con agua estéril. Posterior a
la inoculación los chilillos fueron protegidos en una cámara húmeda constituida
por una bolsa de polietileno y una toalla de papel empapada con agua estéril,
con el propósito de humedecer el ambiente interno y favorecer la germinación
de las esporas; la toalla de papel se retiró dos días después cortando uno de
los extremos de la bolsa y con ayuda de una pinza. El sitio de inoculación se
marcó para facilitar el seguimiento del desarrollo de la enfermedad y la
aparición de los síntomas iniciales y finales en el ensayo.
A otro grupo de frutos se realizó la inoculación de M. roreri con la metodología
ya descrita y un día después se realizó la aspersión de los tratamientos
manteniendo la cámara húmeda.
Tratamientos:
Se probaran los extractos de clavo, canela y pimienta en forma de hidrolatos,
así como el polisulfuro de calcio, tanto antes como después de la inoculación
del hongo, y se incluyó un testigo sin inocular y uno inoculado con M. roreri.
63
Descripción de Tratamientos
Efecto de extractos sobre inhibición de la germinación
Tratamiento
Aplicación
antes
inoculación
Clavo semilla hidrolato
Canela corteza hidrolato
Pimienta semilla hidrolato
Polisulfuro de calcio
Aplicación
Clavo semilla hidrolato
después
Canela corteza hidrolato
inoculación
Pimienta semilla hidrolato
Polisulfuro de calcio
Testigo sin inoculación (aplicación solo agua)
Testigo inoculado
Dosis
20%
30%
30%
10%
20%
30%
30%
10%
Evaluación: Para finalizar el ensayo, 80 días después de la inoculación, se
realizó un muestreo destructivo de las mazorcas de cada tratamiento con el
propósito de medir las variables incidencia, severidad externa (SE) y severidad
interna (SI).
 Incidencia: porcentaje de frutos enfermos en relación al total de frutos
inoculados.
 Severidad externa: esta basada en la apariencia externa del fruto y los
signos del patógeno, utilizando la escala: grado 0=fruto sano, 1= jiba;
2=mosaico; 3= mancha (necrosis); 4= micelio hasta un 25% de la mancha;
5= micelio en más del 25% de la mancha (Adaptado de Brenes, 2003). Esta
variable mide el nivel de daño externo causado por el hongo y su habilidad
para producir propágalos.
 Severidad interna: basada en el porcentaje de necrosis interna observada
en el fruto cuando este cortado longitudinalmente y medido con relación a la
escala desarrollada por Sánchez, et al., 1982. Donde: grado 0= cero área
necrosada; 1=1-20% del área necrosada; 2= 21-40% área necrosada; 3=
41-60% área necrosada; 4= 61-80% área necrosada; 5=100% área
necrosada. Esta variable muestra la capacidad de daño interno que puede
causar el hongo en la mazorca afectando los granos.
64
Diseño experimental:
Se utilizó un diseño completamente al azar con cuatro tratamientos y 10
repeticiones, siendo la unidad experimental un fruto para un total de 40 frutos
para el ensayo.
Análisis estadístico:
Los datos de Índice de severidad interna (ISI) y de Índice de severidad externa
(ISE) fueron transformados mediante la fórmula (valor+0,5)1/2. Para determinar
si existieron diferencias significativas en cada uno de los tratamientos se realizó
el análisis de varianza y se aplicó la prueba de comparación de medias de
Tukey al nivel de significancia de 5%, cuando existió diferencia significativa.
Los datos fueron procesados en el programa SAS para Windows 9.0.
3.4.4.3. Efecto de extractos sobre el desarrollo de la enfermedad en
árboles de cacao.
Acondicionamiento del sitio Experimental: Para el acondicionamiento de los
árboles del Clon UNACH 130 correspondientes al área de estudio se llevaron a
cabo las siguientes labores; limpia, poda, eliminación de frutos enfermos por
moniliasis y otras enfermedades, y trazado de la parcela experimental.
Aplicación de extractos: Cada uno de los extractos fue mezclado con agua
para completar el volumen correspondiente. Las aplicaciones se realizaron
cada 15 días con aspersora manual a todos los árboles de cada una de las
parcelas, en las horas de la mañana.
Tratamientos: Se probaron los extractos seleccionados de la fase 1, hidrolatos
de: clavo, canela y pimienta y el polisulfuro de calcio, los cuales se aplicaron
mediante aspersiones quincenales con el uso de bombas de aspersión de
capacidad de un galón destinadas exclusivamente para esta prueba, además
se incluyó un testigo con manejo cultural y un testigo absoluto al cual no se le
realizó ningún manejo con el fin de apreciar el comportamiento natural de la
65
enfermedad en el lote de ensayo. Los tratamientos y sus dosis se describen a
continuación:
Tratamiento
Dosis
Clavo hidrolato
20%
Canela hidrolato
30%
Pimienta hidrolato
30%
Polisulfuro de calcio
10%
Testigo manejo cultural (eliminación semanal de frutos enfermos)
Testigo absoluto
Diseño experimental:
Se utilizó un diseño completamente al azar con cinco repeticiones por
tratamiento y seis tratamientos. La unidad experimental fue de seis árboles
para un total de 30 árboles.
Evaluación
Las variables dependientes se cuantificaron cada 15 días, determinadas a
partir de cada uno de los árboles de cada tratamiento; las variables fueron:
 Incidencia de la enfermedad
Para cuantificar esta variable se evaluaron:
Número de chilillos sanos
Número de chilillos enfermos por M. roreri
Número de mazorcas sanas
Número de mazorcas enfermas por M. roreri
Utilizando la fórmula:
Número de frutos enfermos
% Incidencia= ------------------------------------Número total de frutos
X 100
66
 Severidad externa. Se contabilizó tanto en chilillos como en mazorcas
la apariencia externa del fruto y los signos del patógeno, utilizando la
escala: grado 0= fruto sano, 1= giba; 2= mosaico; 3= mancha
(necrosis); 4= micelio hasta un 25% de la mancha; 5= micelio en más
del 25% de la mancha. Esta variable mide el nivel de daño externo
causado por el hongo y su habilidad para producir propágalos.
 Severidad interna. Está basada en el porcentaje de necrosis interna
observada en el fruto cuando este se corta longitudinalmente y medido
con relación a la escala desarrollada por Sánchez et al., 1982.
 Producción. Para determinar la producción de cacao se determinó
cada ocho días el número y peso total de los frutos sanos cosechados,
así como el peso seco de los granos.
Análisis estadístico:
Los datos obtenidos de incidencia se transformaron mediante la fórmula
arcoseno (porcentaje/100)1/2 y los de ISI e ISE mediante la fórmula (valor
+0,5)1/2; se les realizó un análisis de varianza y prueba de comparación de
medias de Tukey al 5%. Los datos fueron procesados en el programa SAS para
Windows 9.0.
3.4.5. Caracterización fitoquímica de los extractos
El análisis de la caracterización y contenidos de compuestos presentes en los
extractos
se
realizó
mediante
cromatografía
de
gases
acoplado
a
espectrometría de masas (GC-MS), se realizó en el Laboratorio Nacional de
Prevención y Control del Dopaje-CONADE - México.
Para el estudio de GC-MS se utilizó un Cromatógrafo de Gases (modelo 6890
N) acoplado a un Espectrómetro de Masas (Modelo 5973N) ambos de marca
Agilent Technologies, fabricado en China; equipado con un puerto de inyección
67
slip/splitless (12:1). Columna Agilent 19091A-002, Methyl Siloxane, capilar, con
las siguientes características: largo 25,0 m, diámetro 200,0 µm con un tamaño
de partícula de 0,11 µm, gas de arrastre, Helio, con flujo inicial de 1 mL/min y
luego flujo constante. Volumen de inyección 1 µL. Temperatura inicial 60°C, a
temperatura final de 325°C, Tiempo de corrido 114.67 min.
Para la identificación de los compuestos se compararon con la base de datos
NIST MS 2.0.
Para el hidrolato de clavo se sometió a análisis con cloroformo, diclometano y
metanol y para el hidrolato de canela con éter de petróleo y cloroformo. Una
vez realizado el análisis de Espectrometría de Masas (MS), y considerando la
abundancia de picos entre los solventes de cada hidrolato, se realizó el análisis
GC-MS para el caso del hidrolato de clavo con cloroformo y para canela con
éter de petróleo.
68
CAPÍTULO 4.
ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS
69
CAPÍTULO 4. ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS
4.1. Fase 1. Trabajo en condiciones de laboratorio
4.1.1. Evaluación de extractos mediante el método de difusión en Agar
Montaje de ensayo al 50% de concentración.
En un primer ensayo se probaron los 36 extractos; los resultados obtenidos con
respecto al efecto de los tratamientos sobre el crecimiento del hongo se
muestran en las Figuras 2 y 3.
Con respecto a la hoja de canela las formas de extracción más efectivas
fueron: hidrolato, presurizado y fermentación aeróbica, ya que inhibieron
totalmente el crecimiento del patógeno, mientras que la fermentación
anaeróbica la redujo en un 77,2% con respecto al testigo absoluto que presentó
el mayor crecimiento con 50 mm, mientras que con la corteza de canela solo el
hidrolato inhibió completamente el crecimiento.
50
45
C
R
E
C
I
M
I
E
N
T
O
(mm)
40
35
30
Hidrolato
Presurizado
F.aerobica
F.anaeob
25
20
15
10
5
0
Canela Hoja
Canela Asti
Pimienta Hoja Pimienta sem TESTIGOABS TESTQUIM
TRATAMIENTOS
Figura 2. Efecto de extractos de C. zeylanicum y P. dioica sobre el crecimiento
de M. roreri.
70
EXTRACTOS DE CLAVO, OREGANO, MAGUEY Y JENGIBRE EN EL
CRECIMIENTO DE M. roreri
50
45
C
R
E
C
I
M
I
E
N
T
O
(mm)
40
35
30
Hidrolato
Presurizado
F.aerobica
F.anaeob
25
20
15
10
5
0
Clavo Hoja Clavo sem Oregano
Maguey
Jengibre Testigo Abs Testigo
quim
TRATAMIENTOS
Figura 3. Efecto de extractos de S. aromaticum L. O. vulgare, T. spathacea y Z.
officinale sobre el crecimiento de M. roreri.
Para el caso de la pimienta tanto para los extractos obtenidos a partir de la hoja
como los de la semilla, las formas de hidrolato y presurizado inhibieron
totalmente al patógeno, mientras que las fermentaciones redujeron el
crecimiento entre un 55 y un 35%.
En el clavo, los extractos elaborados a partir de las hojas que mostraron el
mejor efecto de inhibición del crecimiento de M. roreri fueron el hidrolato y el
presurizado con 100% y 58% de inhibición respectivamente; mientras que para
los preparados a partir de la semilla las cuatro formas de extracción inhibieron
totalmente el desarrollo de M. roreri. Para los extractos de maguey, orégano y
jengibre el hidrolato fue la única forma que inhibió al 100% el crecimiento del
hongo.
Estos resultados son corroborados por el análisis estadístico practicado, ya que
según éste existen diferencias altamente significativas entre tratamientos
(Anexo 3). La prueba de comparación de medias de Rango múltiple de Tukey
71
(P<0,05) separó los 16 mejores tratamientos que inhibieron completamente el
crecimiento (canela hoja hidrolato, canela hoja presurizado, canela hoja
fermentación aeróbica, canela corteza hidrolato, pimienta hoja hidrolato,
pimienta hoja presurizado, pimienta semilla hoja, pimienta semilla presurizado,
clavo hoja hidrolato, clavo semilla hidrolato, clavo semilla presurizado, clavo
semilla fermentación anaeróbica, orégano hidrolato, maguey hidrolato, jengibre
hidrolato) de otro grupo de extractos que permitieron cierta inhibición del hongo
y un tercer grupo que permitió el crecimiento total del patógeno como fueron el
maguey en fermentaciones aeróbica y anaeróbica, así como el testigo absoluto
(Anexo 4).
Con respecto a la producción de conidias es interesante observar como todos
los extractos obtenidos de las hojas y corteza de canela, así como los
procedentes de la pimienta y orégano inhibieron la cantidad de conidias entre
un 98,6 y un 70,64%, a pesar que, como se vio anteriormente, se presentó
formación de micelio, es decir que los extractos muestran actividad
antiesporulante (Figuras 4 y 5). Sin embargo las fermentaciones aeróbica y
anaeróbica de extractos a partir de clavo hoja, maguey y la anaeróbica de
jengibre estimularon la formación de las conidias entre un 18 y un 10%.
El Análisis de varianza indica diferencias altamente significativas entre los
tratamientos, tal como se aprecia en el Anexo 5. La Prueba de Rango múltiple
de Tukey (P<0,05), registra como las cuatro formas de extracción de canela
hoja hidrolato, canela hoja presurizado, canela hoja fermentación aeróbica,
canela corteza hidrolato, pimienta hoja hidrolato, pimienta hoja presurizado,
pimienta semilla hoja, pimienta semilla presurizado, clavo hoja hidrolato, clavo
semilla hidrolato, clavo semilla presurizado, clavo semilla fermentación
anaeróbica, orégano hidrolato, maguey hidrolato, jengibre hidrolato, canela hoja
anaeróbica,
canela
corteza
presurizado,
canela
corteza
fermentación
anaeróbica, pimienta semilla fermentación aeróbica y el testigo químico,
registraron diferencias con el testigo absoluto (el cual mostró el mayor valor con
34 x107 conidias/mL) y con los demás tratamientos, además del grupo de
extractos que estimularon la producción de conidias (fermentaciones de: clavo
72
hoja anaeróbica, jengibre anaeróbica, maguey anaeróbica, clavo hoja aeróbica,
maguey aeróbica) (Anexo 6).
35
30
25
20
C
O
N
I
D
I
A
S
Hidrolato
15
Presurizado
10
F.aerobica
F.anaeob
5
(mL)
X 107
0
TRATAMIENTOS
Figura 4. Efecto de extractos de C. zeylanicum y P. dioica sobre
la formación de conidias de M. roreri.
45
40
35
30
C
O
N
I
D
I
A
S
25
Hidrolato
Presurizado
F.aerobica
F.anaeob
20
15
10
(mL)
X 107
5
0
Clavo Hoja Clavo sem Oregano
Maguey
Jengibre Testigo Abs Testigo
quim
TRATAMIENTOS
Figura 5. Efecto de extractos de S. aromaticum L. O. vulgare, T. spathacea y Z.
officinale sobre la formación de conidias de M. roreri.
73
Los extractos de hoja de canela (hidrolato, presurizado, fermentación aeróbica),
corteza de canela (hidrolato), pimienta hoja (hidrolato y presurizado), pimienta
semilla (hidrolato y presurizado), clavo semilla (hidrolato, presurizado,
fermentación aeróbica y fermentación anaeróbica), y los hidrolato de orégano
maguey y jengibre que presentaron el mejor efecto regulador sobre M. roreri
pasaron a la siguiente prueba con el fin de determinarles la concentración
mínima inhibitoria.
4.1.1.1. Determinación de la concentración mínima inhibitoria (CMI).
Tal como se aprecia en las figuras 6 y 7, los hidrolatos elaborados a partir de
hojas de canela y de pimienta registraron las CMI más bajas (20% V/V),
seguido por el hidrolato de la canela corteza y la semilla de pimienta con 30% ,
La CMI de los presurizados elaborados con hojas de canela y semilla de
pimienta fue de 40%, mientras que el presurizado procedente de hojas de
pimienta y el fermentado aeróbico de hojas de canela, aún al 40%, presentaron
crecimiento del hongo, lo que indica que su CMI es del 50%.
50
45
40
C
R
E
C
I
M
I
E
N
T
O
(mm)
35
30
40
30
20
10
25
20
15
10
5
0
Canela hoja
hidrol
Canela hoja
Presu
Canela hoja Canela astilla Testigo abs Testigo quim
F. ae
Hidrol
TRATAMIENTOS
Figura 6. Efecto de cuatro concentraciones de extractos de C. zeylanicum
sobre el crecimiento de M. roreri.
74
50
45
40
C
R
E
C
I
M
I
E
N
T
O
(mm)
35
30
40
30
20
10
25
20
15
10
5
0
Pim hoja
hidrol
Pim hoja pres
Pim sem
hidro
Pim semilla
presu
Testigo abs Testigo quim
TRATAMIENTOS
Figura 7. Efecto de cuatro concentraciones de extractos de P. dioica
sobre el crecimiento de M. roreri.
Los anteriores resultados son corroborados con el análisis estadístico
practicado, ya que según este existen diferencias altamente significativas entre
tratamientos (Anexo 7). La Prueba de comparación de medias de Rango
múltiple de Tukey (P<0,05) (Anexo 8), agrupa a las concentraciones que
inhibieron completamente el crecimiento del patógeno (40, 30 y 20% de canela
hoja hidrolato, la de 40% del extracto de canela hoja presurizado, las de 40 y
30% de canela corteza hidrolato, pimienta hoja hidrolato 40, 30 y 20%, pimienta
semilla hidrolato al 40 y 30% y pimienta semilla presurizado al 40% y el testigo
químico) del resto de tratamientos incluido el testigo absoluto, siendo estas
concentraciones las que evidencian la CMI para cada extracto.
Con respecto a las extractos de clavo, en la figura 8 se puede apreciar como
para los extractos del botón floral en forma de hidrolato y presurizado a las
concentraciones de 40, 30 y 20% inhibieron completamente el crecimiento
siendo la CMI la de 20%, mientras que para el fermentado aeróbico la CMI fue
del 30% y la de la fermentación anaeróbica requiere del 40% para ser efectiva.
Con respecto a la hoja de clavo en forma de hidrolato en las cuatro
75
concentraciones evaluadas permitió el desarrollo del hongo, por lo que su CMI
es del 50%.
En la figura 9 se muestran los resultados del comportamiento de los hidrolatos
de orégano, maguey y jengibre frente al crecimiento de M. roreri, en el cual se
aprecia como para el caso del jengibre éste a concentraciones del 40 y 30%
inhibe completamente el desarrollo del hongo, siendo la concentración más
baja la considerada como su CMI; mientras que para el orégano y el maguey
se presentó crecimiento en las cuatro concentraciones evaluadas, por lo que su
CMI es del 50%.
50
45
40
C
R
E
C
I
M
I
E
N
T
O
(mm)
35
30
40
30
20
10
25
20
15
10
5
0
Clavo hoja Clavo sem Clavo sem Clavo sem Clavo sem Testigo abs
hidrol
Hidrol
pres
F. aer
F. anae
Testigo
quim
TRATAMIENTOS
Figura 8. Efecto de cuatro concentraciones de extractos de S. aromaticum
sobre el crecimiento de M. roreri.
76
50
45
40
C
R
E
C
I
M
I
E
N
T
O
(mm)
35
30
40
30
20
10
25
20
15
10
5
0
Oregano hidrol
Maguey hidrol
Jengibre hidrol
Testigo abs
Testigo quim
TRATAMIENTOS
Figura 9. Efecto de cuatro concentraciones de extractos de O. vulgare, T.
spathacea y Z. officinale sobre el crecimiento de M. roreri.
El análisis estadístico practicado, corrobora lo anteriormente mencionado ya
que según éste existe diferencias altamente significativas entre tratamientos
(Anexo 9). La Prueba de comparación de medias de Rango múltiple de Tukey
(P<0.05), señala que los tratamientos que inhibieron completamente el
crecimiento del patógeno muestran diferencias estadísticas con los demás
tratamientos, sin embargo es de resaltar que todas las concentraciones al 10%
y los hidrolatos de maguey y jengibre al 20% no registraron diferencias con el
testigo absoluto, pero si con los demás tratamientos (Anexo 10).
La siguiente variable evaluada fue la producción de conidias, para los
extractos obtenidos de canela los resultados se muestran en la figura 10,
siendo interesante resaltar que para todas las concentraciones evaluadas la
cantidad de conidias fue inferior al testigo absoluto, el cual registró el valor más
alto con 40 x 107 conidias/mL, la CMI siguen siendo las mismas que para el
crecimiento micelial.
77
45
40
35
C
O
N
I
D
I
A
S
(mL)
X 107
30
25
40
30
20
10
20
15
10
5
0
Canela hoja
hidrol
Canela hoja
Presu
Canela hoja Canela astilla Testigo abs Testigo quim
F. ae
Hidrol
TRATAMIENTOS
Figura 10. Efecto de cuatro concentraciones de extractos de C. zeylanicum
sobre la producción de conidias de M. roreri.
45
40
35
C
O
N
I
D
I
A
S
(mL)
X 107
30
25
40
30
20
10
20
15
10
5
0
Pim hoja
hidrol
Pim hoja pres
Pim sem
hidro
Pim semilla
presu
Testigo abs Testigo quim
TRATAMIENTOS
Figura 11. Efecto de cuatro concentraciones de extractos de P. dioica sobre
la producción de conidias de M. roreri.
78
Con respecto a los extractos obtenidos de pimienta ninguna concentración de
los cuatro extractos obtenidos de esta planta mostraron efecto de estimulación
en la producción de conidias, al contrario el hidrolato de la semilla registró al
20% una de las cantidades mas bajas de conidias/mL, aún a pesar que registro
crecimiento micelial, al igual que el presurizado de hoja, sin embargo la CMI
siguen siendo las mismas descritas para el crecimiento (Figura 11).
El análisis estadístico practicado, corrobora lo anteriormente mencionado ya
que según éste existe diferencias altamente significativas entre tratamientos
(Anexo 11). La Prueba de comparación de medias de Rango múltiple de Tukey
(P<0,05), señala que las concentraciones de 40, 30 y 20% de los hidrolatos de
canela hoja y pimienta hoja; las de 40 y 30% de los hidrolatos de canela
corteza y pimienta semilla y la de 40% de los presurizados de canela hoja y
pimienta semilla, presentaron inhibición total y no mostraron diferencias
estadísticas con pimienta semilla hidrolato 20%, pimienta hoja presurizado
40%, canela hoja presurizado 30% y canela hoja hidrolato 10%, pero si con los
demás tratamientos y todos los tratamientos mostraron diferencias con el
testigo absoluto (Anexo 12).
Los resultados de las CMI del clavo, se aprecian en la figura 12, en la cual se
muestra como el clavo semilla en hidrolato a concentraciones del 40, 30 y 20%
al no registrar crecimiento tampoco mostraron producción de conidias, sin
embargo al 10% presentó formación de conidias siendo un 92.75% más bajo
que el testigo absoluto. Con respecto al clavo botón floral presurizado es un
caso similar al anterior, sin embargo al 10% la reducción en la producción de
conidias fue del 75%; siendo estas dos CMI las más bajas en todos los
tratamientos. La CMI del clavo botón floral en fermentación aeróbica fue del
20%, la de la fermentación anaeróbica al 40% y el hidrolato elaborado de hojas
de canela presentó tanto crecimiento como formación de conidias a las cuatro
concentraciones evaluadas, siendo la del 50% considerada como su CMI.
El análisis estadístico practicado, corrobora lo anteriormente mencionado ya
que según éste existe diferencias altamente significativas entre tratamientos
(Anexo 13). La Prueba de comparación de medias de Rango múltiple de Tukey
79
(P<0,05), señala que las concentraciones de 40, 30 y 20% del hidrolato y del
presurizado de clavo, las concentraciones de 40 y 30% del hidrolato de jengibre
y el fermentado anaeróbico de clavo, así como el fermentado anaeróbico al
40%, presentaron inhibición total y mostraron diferencias estadísticas con los
demás tratamientos y todos los tratamientos mostraron diferencias con el
testigo absoluto que fue el tratamiento que registro la mayor cantidad de
conidias (Anexo 14).
Todas las concentraciones de los hidrolatos de orégano, maguey y jengibre
inhibieron la producción de conidias tal como se aprecia en la figura 13, es de
destacar que para el caso del jengibre en las concentraciones de 40 y 30% al
no permitir el crecimiento tampoco presentó formación de conidias, y en las
concentración de 20 y 10% a pesar que creció igual que el testigo absoluto
inhibió en 28,4 y 30,9% respectivamente la producción de estas estructuras.
Para el orégano es interesante como a pesar que mostró crecimiento en todas
las cuatro concentraciones inhibió la formación de conidias entre un 94,15 y
un 35,3% con respecto al testigo absoluto, situación similar sucedió con el
maguey donde los porcentajes de inhibición estuvieron entre un 92,85 – 24,5%.
45
40
C
O
N
I
D
I
A
S
(mL)
X 107
35
30
25
40
30
20
10
20
15
10
5
0
Clavo hoja Clavo sem Clavo sem Clavo sem Clavo sem Testigo abs
hidrol
Hidrol
pres
F. aer
F. anae
Testigo
quim
TRATAMIENTOS
Figura 12. Efecto de cuatro concentraciones de extractos de S. aromaticum
sobre la producción de conidias de M. roreri.
80
45
40
C
O
N
I
D
I
A
S
(mL)
X 107
35
30
40
30
20
10
25
20
15
10
5
0
Oregano hidrol
Maguey hidrol
Jengibre hidrol
Testigo abs
Testigo quim
TRATAMIENTOS
Figura 13. Efecto de cuatro concentraciones de extractos de O. vulgare, T.
spathacea y Z. officinale sobre la producción de conidias de M.
roreri.
Dados los resultados obtenidos, el hidrolato de orégano tiene efecto regulador
de M. roreri, sumándose a los reportes de actividad antibacterial y antioxidante,
así como de tener efecto como un preservativo natural de alimentos (HerschMartínez, et al., 2005; Kulisic, et al., 2004; Nostro et al., 2004). Además, según
Önder et al., (2005) posee propiedades insecticidas sobre B. tabaci y acaricidas
en T. urticae. Para el caso del hidrolato de T. spathacea, muestra un efecto
antiesporulante, resultados que se suman a
investigaciones realizadas en
diversas partes del mundo, en las que se han reportado 33 diferentes
actividades biológicas de esta planta, dentro de las que destacan actividades
antivirales, antinflamatorias, antimicrobianas (efecto controlador de infecciones
gastrointestinales causados por Salmonella enteritidis y Shigella flexneri),
bactericidas, fungicidas y últimamente anticancerígenas. Los estudios químicos
de T. spathacea desarrollados por González-Ávila (2003) y Domínguez (2002)
demostraron que esta planta posee compuestos con estructura de tipo
flavónico o flavonoides cuyas propiedades tienen efecto de inhibición en la
formación de tumores, así como que los extractos polares del grupo de las
81
cumarinas tienen efecto bactericida sobre Echerichia coli, Salmonella enteritidis
y Shigella flexneri.
Estos resultados coinciden con lo obtenido por Roblero (2003) y Ramírez
(2008), quienes determinaron el efecto inhibitorio de la pimienta sobre P.
palmivora. Por su parte, Ramos et al., (2003), menciona que el aceite esencial
de hojas de pimienta es el eugenol y Kikuzaki et al., (1999) menciona que las
semillas de pimienta contienen entre otros compuestos el eugenol. De acuerdo
con Busquet, et al., (2005) este compuesto ejerce efecto regulador de
microorganismos.
Con respecto a la respuesta presentada por el clavo se aprecia que la hoja y
semilla, en diferentes grados, ejerce efecto reductor del crecimiento y
desarrollo del patógeno, estos resultados concuerdan con Rodríguez (1996),
quien reporta como en condiciones in Vitro el extracto de clavo inhibió
completamente el crecimiento de Colletotrichum sp, aislado de Passiflora
mollissima, así como con Moreira et al., (2005) quienes determinaron que el
clavo ejerce acción bactericida y bacteriostática sobre E. coli. Ponce et al.,
(2003), encontraron en sus investigaciones que el aceite de clavo presenta
actividad antimicrobial y que puede ser usado como agente natural
desinfectante en poscosecha de vegetales.
Nychas (1995) citado por Moreira et al., (2005) reporta como el aceite esencial
de clavo ejerce efecto inhibitorio sobre bacterias y mohos y que los medios por
los cuales estos microorganismos son inhibidos parece que involucra diferentes
modos de acción. Los resultados reportados por Busquet et al., (2005),
sugieren que el aceite extraído de brotes de clavo puede inhibir la peptidolisis
de bacterias ruminales ya que encontraron gran cantidad de N peptídico en los
ensayos realizados in Vitro. Los componentes fenólicos presentes en los
aceites esenciales se conoce que poseen actividad antimicrobial y algunos son
clasificados como sustancias seguras. Dichos compuestos fenólicos de aceites
sensibilizan la bicapafosfolipídica de la membrana de las células, causando un
incremento de la permeabilidad y escape de constituyentes intracelulares
82
vitales o dañando el sistema enzimático bacterial (Singh, Bhunia, & Stroshine
(2002), citados por Moreira et al., (2005).
Estos resultados encontrados para jengibre, coinciden con los reportados por
Nguefack (2004), quien determinó el efecto inhibitorio de Zingiber officinale
sobre aislamientos de tres hongos procedentes de alimentos (Fusarium
moniliforme, Aspergillus flavus y Aspergillus fumigatus), extractos que al igual
fueron obtenidos por destilación y que mostraron inhibición en el crecimiento y
formación de conidias de los tres hongos pero a concentraciones superiores
que la de otras plantas como el Thymus vulgaris, datos similares a los
reportados por Sacchetti et al., (2005), quienes estudiaron el efecto
antimicrobial de 11 plantas sobre levaduras presentes en los alimentos
(Candida
albicans,
Rhodotorula
glutinis,
Schizosaccharomyces
pombe,
Saccharomyces cerevisiae y Yarrowia lypolitica), los resultados reportados para
el jengibre indican efecto inhibidor de su aceite pero a concentraciones altas,
además referencian que la presencia de fenilpropaniodes en el jengibre podría
ser el compuesto que le de propiedades de control sobre dichas levaduras.
4.1.2. Evaluación de extractos sobre M. roreri mediante el método de
discos de papel.
4.1.2.1. Determinación de un control químico
Para la realización de esta prueba se ensayaron dos dosis una a 20 µL y otra a
50 µL.
Los efectos de los productos de síntesis química sobre el hongo M. roreri,
mostraron efecto negativo para la gran mayoría de ellos, tan solo para el caso
del Bis- dimetil ditiocarbamato de Zn ®a las dos dosis evaluadas mostró halos
de inhibición, siendo mayor para la dosis de 50 µL con 5,5 mm, mientras que
para la de 20 µL fue de 4 mm. Estadísticamente el análisis de varianza muestra
diferencias altamente significativas (Anexo 15) y la prueba de Tukey muestra
como las dos dosis del compuesto Bis- dimetil ditiocarbamato de Zn tienen
diferencias con los demás (Anexo 16).
83
Los resultados de la prueba de los extractos de las seis plantas evaluadas
sobre el crecimiento del hongo M. roreri muestran como el orégano, maguey,
jengibre, hoja de pimienta, hoja de clavo y sus cuatro formas de extracción no
mostraron halos de inhibición, mientras que otro grupo conformado por canela
corteza en presurizado, canela hoja en presurizado y fermentado anaeróbico,
clavo botón floral en presurizado, fermentados aeróbico y anaeróbico
y el
hidrolato de la semilla de pimenta mostraron actividad moderada con halos de
inhibición que van de 7 a 14,5 mm y el grupo que mostró actividad fuerte es el
conformado por los hidrolatos de corteza y hoja de canela y los botones florales
de clavo, así como el fermentado aeróbico de hojas de canela y el testigo
químico (i.a. Bis- dimetil ditiocarbamato de Zn), con un rango de 16 a 22,5 mm.
El análisis de varianza muestra diferencias altamente significativas entre los
tratamientos tal como se aprecia en el Anexo 17; los resultados de la prueba de
Tukey se presentan en el Anexo 18, donde el grupo extractos de hidrolatos de
hoja de canela y los botones florales de clavo, así como el fermentado aeróbico
de hojas de canela y el testigo químico muestran diferencias con los demás
extractos, con halos de inhibición de 22,5; 22,5; 21,5 y 22 mm respectivamente,
seguido por el hidrolato de canela corteza con 16 mm, el cual también muestra
diferencia con los demás extractos.
4.1.3. Evaluación de los extractos sobre M. roreri mediante el método de
discos de papel Kirby-Bauer
4.1.3.1. Determinación de un control químico. Para el desarrollo de esta
prueba se probaron dos dosis (20 y 50 µL), a diferencia del método de discos
de papel, en éste se aprecia toda la gama de efectos; según la escala dada por
Monks et al. (2002); el producto Ranman® fue el único que dio negativo,
mientras que los productos Eco 720®, Barrida®, Tamis® y Ridomil® a las dos
dosis evaluadas tuvieron un efecto de actividad débil (< 11 mm), así como el
Ziram® a dosis de 20 µL, mientras que a dosis de 50 µL su actividad se
clasifica como moderada ya que presentó un halo de inhibición de 14 mm.
84
El análisis de varianza practicado reporta diferencias altamente significativas
entre los productos (Anexo 19), la prueba de Tukey corrobora lo anterior ya que
el Bis- dimetil ditiocarbamato de Zn a dosis de 50 µL muestra diferencias
estadísticas con los demás tratamientos (Anexo 20).
El efecto mostrado por los extractos sobre el hongo M. roreri mediante el
método de Disco de papel Kirby-Bauer, dejan ver como a comparación del
método anterior donde 11 extractos mostraron halos de inhibición, para el caso
de esta metodología tan solo tres lo hicieron y con dimensiones menores,
inclusive las presentadas por el testigo químico. Los extractos que dieron
positivo a esta prueba fueron los hidrolatos de semilla de pimienta, botones
florales de clavo y corteza de canela, con 8, 9 y 15,5 mm, respectivamente,
mientras que el testigo químico registró 16 mm; los promedios de los halos de
inhibición de los tratamientos se pueden apreciar en el Anexo 22.
El análisis de varianza mostró diferencias entre los tratamientos, tal como se
aprecia en el Anexo 21; la prueba de Tukey se muestra en el Anexo 22, siendo
el hidrolato de canela corteza y el testigo químico los tratamientos que
mostraron el mayor halo de inhibición y que presentan diferencias estadísticas
con los demás tratamientos, seguido por el hidrolato de los botones florales de
clavo y luego por el hidrolato elaborado a partir de semilla de pimienta, los
cuales entre si muestran diferencias y con los demás tratamientos, los cuales
no mostraron halos de inhibición.
En el Cuadro 2 se muestra una comparación de resultados de los tres métodos
evaluados (difusión en agar, discos de papel modificado y el de Kirby-Bauer),
para determinar la efectividad de los extractos sobre el hongo M. roreri, así
como de los productos químicos de síntesis evaluados con el fin de determinar
el control químico a emplear para las pruebas mediante los métodos de discos
de papel. Se puede apreciar como tan solo para tres extractos como fueron los
hidrolatos elaborados a partir de corteza de canela, botones florales de clavo y
semilla de pimienta muestran efectos en las tres pruebas, ya que algunos como
los extractos elaborados de hojas de canela mostraron efecto en el método de
85
dilución y en los discos de papel modificado mientras que para el método de
Kirby Bauer no, situación similar se ve con los extractos elaborados de botones
florales de clavo en presurizado y en fermentados aeróbico y anaeróbico.
Otro grupo de extractos como el presurizado de semilla de pimienta, hidrolato
de hoja de clavo y los hidrolato de orégano, maguey y jengibre, solo mostraron
actividad en el método de difusión en agar, pero a altas concentraciones.
Cuadro 2. Comparación de tres Métodos de evaluación de la efectividad
reguladora de extractos de plantas y productos de síntesis química
sobre el crecimiento de M. roreri.
EXTRACTO
Canela hoja hidrolato
METODO
DILUCION
50%
CMI
I
20
METODOS DE DISCOS DE PAPEL
Grados de inhibición
DISCOS DE PAPEL
Kirby-Bauer modificado
+++
Canela hoja presurizado
I
40
-
+
Canela hoja F. Aeróbico
I
50
-
+++
Canela hoja F. Anaeróbico
C
50
-
++
Canela corteza hidrolato
I
30
++
++
Canela corteza presurizado
C
-
+
Canela corteza F. Aeróbico
C
-
-
Canela corteza F. Anaeróbico
C
-
-
Pimienta hoja hidrolato
I
20
-
-
Pimienta hoja presurizado
I
50
-
-
Pimienta hoja F. Aeróbico
C
-
-
Pimienta hoja F. Anaeróbico
C
-
-
Pimienta semilla hidrolato
I
30
+
++
Pimienta semilla presurizado
I
40
-
Pimienta semilla F. Aeróbico
C
Pimienta semilla F. Anaeróbico
C
Clavo hoja hidrolato
I
Clavo hoja presurizado
-
-
-
-
-
-
C
-
-
Clavo hoja F. Aeróbico
C
-
-
Clavo hoja F. Anaeróbico
C
-
-
Clavo flor hidrolato
I
20
+
+++
Clavo flor presurizado
I
20
-
++
Clavo flor F. Aeróbico
I
30
-
+
Clavo flor F. Anaeróbico
I
40
-
++
Orégano hidrolato
I
50
-
-
Orégano presurizado
C
-
-
Orégano F. Aeróbico
C
-
-
Orégano F. Anaeróbico
C
-
-
Maguey hidrolato
I
-
-
Maguey presurizado
C
-
-
Maguey F. Aeróbico
C
-
-
50
50
86
Maguey F. Anaeróbico
C
-
-
Jengibre hidrolato
I
Jengibre presurizado
C
-
-
-
-
Jengibre F. Aeróbico
Jengibre F. Anaeróbico
C
-
-
C
-
-
30
QUIMICOS
Barrida (clorotalonil 72%) 5g/L
C
Ziram (ditiocarbamato de Zn) 5 g/L
I
+
-
++
+
Ranman 1mL/L
Tamis (carbamida 54%) 5 mL/L
C
-
-
I
+
-
Eco 720 (Clorotalonil 54%) 5 mL/L
C
+
-
Ridomil (clorotalonil +) 1.5 g/L
C
+
-
C = Crecimiento del patógeno
I= Inhibición del crecimiento
+ Inhibición leve ++ Moderada
+++ Fuerte
Teniendo en cuenta las pruebas anteriores se considera que los extractos que
tienen mayor potencial para el control de M. roreri para ser evaluado en
condiciones de campo son los hidrolatos elaborados a partir de la corteza de la
canela, los botones florales de clavo y de las semillas de pimienta.
4.1.4. Determinación del medio para la germinación de conidias de
monilia.
El efecto de los medios con sucrosa al 2%, extractos de cacao y agua sobre la
cantidad de conidias de M. roreri muestran como desde las 12 horas hasta las
72 el medio que contenía el extracto de cacao mostró la mayor cantidad de
conidias, seguido del medio con sucrosa al 2%. Es evidente la alta
especificidad de M. roreri por los nutrientes presentes en el cacao para su
multiplicación ya que desde las 12 horas de evaluación la cantidad de conidias
fue un 79% mayor que el tratamiento con agua destilada, mientras que con el
medio con sucrosa fue del 31%, porcentajes que aumentaron al pasar las horas
con 377,2%, 291,18% y 86,6%, para las 24, 48 y 72 horas respectivamente.
El análisis de varianza realizado registra diferencias altamente significativas
entre los tratamientos a las diferentes horas evaluadas (Anexo 23). En el
Cuadro 3, se corrobora lo anteriormente expuesto, donde el medio con extracto
de cacao registró diferencias estadísticas con referencia a los otros dos
medios; el medio con sucrosa al 2% también mostró diferencias con el medio
con agua destilada en todas las horas evaluadas.
87
Cuadro 3. Comparación de medias por la prueba de Rango múltiple de Tukey
del efecto de medios con sucrosa al 2% y con extracto de cacao sobre
la cantidad de conidias totales de M. roreri.
Tratamiento
Testigo
agua
Sucrosa
Cacao
12 horas
Conidias/mL
6
x10
Tukey*
24 horas
Conidias/mL
6
x10
3,17
C
4,18
5,69
Tukey*
72
horas
Conidias/mL
6
x10
Tukey*
5,22
C
9,05
C
B
11,2
B
13,52
B
A
15,2
A
16,89
A
Tukey*
48 horas
Conidias/mL
6
x10
2,07
C
B
3,89
A
9,88
*Medias con la misma letra no son estadísticamente diferentes
La cantidad de conidias germinadas de M. roreri en presencia de los tres
medios evaluados muestra un comportamiento similar al efecto en la cantidad
de conidias, es decir que el mayor número se registró en el medio con extracto
de cacao, seguido por el que contenía sucrosa al 2%; los porcentajes de
conidias germinadas del medio con extracto de cacao fueron del 87,1%,
158,62%, 14,88% y 24,1% a las 12, 24, 48 y 72 horas respectivamente.
El análisis de varianza indica diferencias altamente significativas entre los
tratamientos (Anexo 24), y la prueba de Rango múltiple de Tukey se muestra
en el Cuadro 4, indicando la existencia de diferencias del tratamiento de
extracto de cacao con los otros dos medios y el que contenía sucrosa al 2%
también registró diferencias con el Testigo con agua para todas las horas
evaluadas.
Cuadro 4. Comparación de medias por la prueba de Rango múltiple de Tukey
del efecto de medios con sucrosa al 2% y con extracto de cacao sobre
la cantidad de conidias germinadas de M. roreri.
Tratamiento
Testigo
agua
Sucrosa
Cacao
12 horas
Conidias/mL
6
x10
Tukey*
0,481
C
0,556
0,900
24 horas
Conidias/mL
6
x10
Tukey*
48 horas
Conidias/mL
6
x10
Tukey*
0,290
C
0,853
C
B
0,406
B
0,102
A
0,750
A
0,127
72
horas
Conidias/mL
6
x10
Tukey*
1,684
C
B
2,043
B
A
2,090
A
*Medias con la misma letra no son estadísticamente diferentes
88
4.1.5 Evaluación de tratamientos sobre la formación y germinación de
conidias de M. roreri.
El efecto de los tratamientos sobre la formación de conidias se puede ver en la
Figura 14. Se aprecia como el testigo absoluto presentó las mayores
cantidades de conidias en el transcurso de las horas de evaluación, con valores
entre 115,69 y 98,88 X 106 conidias/mL., mientras que desde las 12 horas de
evaluación los hidrolatos de canela y pimienta y el polisulfuro de calcio
presentaron los valores más bajos de conidias de M. roreri, disminuyendo los
valores en el transcurso de las horas de evaluación; el hidrolato de la corteza
de canela fue el tratamiento que presentó el valor más bajo con 11,89 X 106
conidias/mL (valor registrado a las 96 horas de evaluación), es decir inhibió un
88% la formación de conidias en relación al testigo absoluto; siendo estos tres
tratamientos más efectivos que el testigo químico (Bis- dimetil ditiocarbamato
de Zn) empleado, el cual logró un 23,45% de inhibición en relación al testigo
absoluto a las 96 horas.
Este testigo químico mostró un comportamiento intermedio entre el registrado
por el testigo (extracto de cacao) y el hidrolato de clavo con el grupo de los
otros tres tratamientos (hidrolatos de canela y pimienta y polisulfuro de calcio)
que inhibieron en mayor grado la formación de conidias, datos que corroboran
las pruebas efectuadas en los tres métodos desarrollados en medio sólido
(difusión en agar, disco de papel y disco de papel Kirby-Bauer), al inhibir la
formación de estas estructuras reproductivas.
89
140
Clavo semilla
Hidrolato
120
c
o
n
i
d
i
a
s
X106
Pimienta semilla
Hidrolato
100
80
Canela corteza
Hidrolato
60
Ziram
40
Polisulfuro de
calcio
20
0
12
24
48
72
96
Testigo absoluto
HORAS
Figura 14. Efecto de los tratamientos sobre la formación de conidias de M.
roreri.
El análisis de varianza efectuado registró diferencias altamente significativas
entre los tratamientos (Anexo 25) y la prueba de Rango múltiple de Tukey
realizada para los tratamientos sobre la cantidad de conidias muestra
diferencias entre todos los tratamientos en las diferentes horas evaluadas,
siendo el hidrolato elaborado a partir de la corteza de la canela el que registró
los menores valores y que presentó diferencia con los demás tratamientos,
mostrándose su efecto sobre la reducción en la formación de conidias de M.
roreri (Anexo 26).
90
C
o
n
i
d
i
a
s
G
e
r
m
i
n
a
d
a
s
X106
80
Clavo semilla
Hidrolato
70
Pimienta semilla
Hidrolato
60
50
40
Canela corteza
Hidrolato
30
Testigo químico
20
Polisulfuro de
calcio
10
0
Testigo absoluto
12
24
48
72
96
HORAS
Figura 15. Efecto de los tratamientos sobre la germinación de
conidias de M. roreri.
El efecto de los tratamientos sobre la germinación de conidias se puede ver en
la Figura 15. Se aprecia como el testigo absoluto presentó las mayores
cantidades de conidias germinadas en el transcurso de las horas de
evaluación, con valores entre 46,52 y 26,52 X 106 conidias/mL., mientras que
desde las 12 horas de evaluación los hidrolatos de canela y pimienta y el
polisulfuro de calcio presentaron los valores más bajos de conidias germinadas
de M. roreri, disminuyendo los valores en el transcurso de las horas de
evaluación; el polisulfuro de calcio fue el tratamiento que registró en el
trascurso de las horas de evaluación los valores más bajos de conidias
germinadas (0,41 a 3,19 X 106 conidias/mL), seguido por el testigo químico
(Bis- dimetil ditiocarbamato de Zn) y el hidrolato de la corteza de canela; a las
96 horas de evaluación el tratamiento que inhibió el mayor porcentaje de
conidias germinadas fue el químico con el 96,87%, seguido por el polisulfuro de
calcio con el 93,21%, la corteza de canela con el 92,53%,el clavo con el
89,02% y el que inhibió en menor grado la germinación fue el hidrolato de
pimienta con 59,84%.
91
El análisis de varianza efectuado registró diferencias altamente significativas
entre los tratamientos (Anexo 27) y la prueba de Rango múltiple de Tukey
realizada para los tratamientos sobre la cantidad de conidias germinadas
muestra diferencias entre todos los tratamientos en las diferentes horas
evaluadas, siendo el polisulfuro de calcio y los hidrolatos elaborados a partir de
clavo y de pimienta los tratamientos que a las 12 horas de evaluación
mostraron los menores valores y que presentaron diferencias estadísticas con
el testigo absoluto y con los demás tratamientos; sin embargo a las 96 horas de
evaluación los tratamientos de corteza de canela, clavo, el polisulfuro de calcio
y el testigo químico (Bis- dimetil ditiocarbamato de Zn) registraron los valores
más bajos de germinación de conidias los cuales entre si no presentaron
diferencias estadísticas, pero si con los demás tratamientos incluido el testigo
absoluto que fue el que registró el valor más alto de conidias germinadas de M.
roreri (Anexo 28).
Estos resultados muestran que los hidrolatos de canela, clavo y pimienta
presentan compuestos que ejercen una acción directa sobre la germinación de
conidias de M. roreri, lo cual evidencia un alto potencial de estos extractos en el
manejo de éste patógeno a nivel de campo, ya que este efecto sobre la
germinación de las conidias es de vital importancia en la reducción de la
infección del hongo en los frutos, ya que como señalan Phillips Mora y
Wilkinson (2007), las esporas son los únicos propágulos infecciosos de M.
roreri, y el hongo requiere germinar sobre la superficie del fruto para poder
realizar la infección e iniciar con ello su proceso invasivo, de manera que, al
inhibir la germinación de las conidias, los eventos de infección serán reducidos
y las probabilidades de infección y desarrollo de la enfermedad serán menores.
4.2. Fase 2. Trabajo en condiciones de campo
4.2.1. Determinación del ciclo de la enfermedad
4.2.1.1. Síntomas y signos de la moniliasis en frutos inoculados con M.
roreri.
92
En el Cuadro 5 se muestra el promedio de días en que fueron visibles los
síntomas y signos ocasionados por la inoculación con M. roreri sobre frutos de
cacao de uno a cinco meses de edad. Se aprecia que los primeros estados de
desarrollo del fruto son más susceptibles a la infección y al desarrollo de
síntomas y signos del patógeno, mientras que a edades de cuatro y cinco
meses es menor.
Las gibas (que son deformaciones o protuberancias) fue el primer síntoma
visible en frutos entre uno y dos meses de edad, deformaciones que fueron
visibles de los 40±18 a los 46±12 días después de la inoculación. En frutos de
edad mayor, no se presentó este síntoma.
La decoloración del fruto fue el siguiente síntoma visible, el cual se manifestó
en frutos de dos meses de edad hasta los cinco meses. El período de aparición
de este síntoma es en promedio de 62±6 días en frutos de dos meses, que se
reduce conforme aumenta la edad, terminando en 30 días en frutos de cinco
meses de edad.
Cuadro 5. Tiempo de aparición de síntomas y signos en frutos de cacao
inoculados con M. roreri
Días a aparición de síntomas y signos
Edad de
Mancha
Inicio de
Esporas
aceitosa
esporulación
maduras
-
63±8
80±20
91±27
-
62±6
73±13
82±17
86±16
-
-
60±3
75±10
83±9
87±6
4
-
-
42±11
-
-
-
5
-
-
30
-
-
-
frutos
Gibas
Mosaico
Decoloración
1
40±18
-
2
46±12
3
(Mes)
La aparición de mancha aceitosa, se observó únicamente en frutos que son
infectados de uno a tres meses de edad; esta mancha aparece en promedio a
los 63±8 días después de la inoculación en frutos de un mes de edad, y el
período se alarga a 73±13 para frutos de dos meses y a 75±10 para los de tres
meses. En frutos a edad mayor a tres meses este síntoma no se presentó.
93
En esta investigación el síntoma de mosaico no se manifestó a ninguna edad
de los frutos. Es probable que este síntoma haya sido enmascarado por el color
natural que presentan los frutos del clon utilizado, los cuales son de un rojo
intenso.
Los frutos que se inocularon a la edad de tres meses, no presentaron la
formación de deformaciones o gibas, en éstos el primer síntoma visible fue la
decoloración de los frutos que ocurrió 60±3 días, posterior a este síntoma se
observó a los 75±10 días en promedio la aparición de manchas aceitosas.
La formación de estroma esporulante solo fue observado en frutos infectados a
la edad de uno a tres meses, en los cuales el inicio de la esporulación del
hongo fue cuantificado de los 80±20 a los 83±9 días después de la infección,
concluyendo con la maduración de las esporas a los 91±27, 86±16 y 87±6 días.
Se observa que frutos con edad mayor a los tres meses infectados por el
hongo, no alcanzan a desarrollar tejido esporulante.
El ciclo completo de la enfermedad se pudo observar en frutos inoculados de
uno a tres meses de edad; aunque en frutos de tres meses no se presentaron
deformaciones; pero al término del ensayo todos desarrollaron tejido
esporulante.
En frutos de cuatro a cinco meses edad, el único síntoma visible fue la
decoloración del tejido, manifestándose a los 42±11 días en frutos de cuatro
meses y 30 días en frutos de cinco meses. Estos frutos no alcanzaron a formar
tejido esporulante. En la Figura 16 se presentan los síntomas y signos
presentes en frutos de cacao infectados con M. roreri.
4.2.1.2. Porcentaje de la ocurrencia de síntomas y signos desarrollados
por la inoculación de M. roreri sobre frutos de cacao.
Como se puede apreciar en el Cuadro 6, el porcentaje de presencia de cada
síntoma varía según la edad del fruto. La aparición de deformaciones o gibas,
94
alcanza el 77,8% de frutos de un mes de edad mientras que para los frutos de
dos meses el porcentaje se reduce al 40%.
Cuadro 6. Porcentaje de ocurrencia de síntomas y signos desarrollados por la
inoculación de M. roreri sobre frutos de cacao.
Porcentaje de síntomas y signos
Edad de los
frutos (Mes)
% de daño
interno
Gibas
1
Decoloración
2
Mancha
3
Inicio de
esporulación
4
Esporas
maduras
5
1
77.8
0
100
100
100
100
2
40
80
100
80
80
100
3
0
83.3
100
100
83.3
100
4
0
70
0
0
0
50
5
0
20
0
0
0
0
La decoloración de los frutos alcanza valores de 80 y 83% en frutos de dos y
tres meses de edad, y se reduce conforme la edad del fruto se incrementa,
hasta llegar al 20% en frutos de cinco meses. Mientras que la aparición de
manchas, se presenta en el 100% de frutos infectados de uno a tres meses de
edad; y en la formación de tejido esporulante, el valor fluctúa entre el 80 y el
100 % de los frutos de uno a tres meses de edad.
Figura 16. Síntomas y signos presentes en frutos de cacao infectados con
Moniliophthora roreri.
95
4.2.1.3. Severidad interna en frutos de cacao inoculados con M. roreri.
El daño interno ocasionado por las inoculaciones de M. roreri es expresado en
Índice de Severidad Interna (ISI), en el Cuadro 7, se puede apreciar que los
frutos de uno, dos y tres meses de edad al ser infectados con el hongo M.
roreri, presentan la mayor afectación con un ISI 5, el cual indica una necrosis
del 80 al 100% del fruto, por lo que las semillas no pueden ser aprovechadas.
El nivel de daño interno en el fruto se reduce a medida que éste se acerca a su
madurez ya que se observó que en frutos de cuatro meses de edad, el 10% de
los frutos presentaron ISI de 3 y el 40% con ISI de 5; en frutos de cinco meses
de edad, a pesar de que se observa un 20% de frutos con decoloración, hacia
el interior del fruto no causa ningún daño, permitiendo aprovechar el 100% de
los granos.
Cuadro 7. Índice de severidad interna en frutos inoculados con M. roreri.
Edad de los
frutos (Meses)
Índice de severidad interna (%)
0
(Fruto sano)
1
(1-20%)
2
(21-40%)
3
(41-60%)
4
(61-80%)
5
(81-100%)
1
0
0
0
0
0
100
2
0
0
0
0
0
100
3
0
0
0
0
0
100
4
50
0
0
10
0
40
5
100
0
0
0
0
0
Los resultados obtenidos en esta investigación muestran que M. roreri presentó
la habilidad de desarrollar infección en todas los estados de desarrollo de los
frutos infectados, alcanzando una alta incidencia de la enfermedad, lo que
denota una alta capacidad de infección de este patógeno, esto explica la
gravedad del daño que M. roreri ocasiona en las regiones donde está presente
y el efecto devastador que puede tener en las cosechas de cacao (Aranzazu;
Enríquez et al., 1982; Krauss y Soberanis, 2001). Es probable que este
comportamiento corresponda a la alta especialización que M. roreri ha
alcanzado como producto de su largo proceso de coevolución con sus
hospederos.
96
La forma y secuencia como se presentan los síntomas de la moniliasis,
observados en esta investigación, son concordantes con la descripción
realizada por diversos investigadores (FHIA, 2003; Krauss et al., 2006;
Aranzazu, Martínez y Martínez, 2009) en los que se reporta que los frutos
jóvenes hasta de tres meses de edad, son los más susceptibles; y en estos el
patógeno logra desarrollar completamente su ciclo hasta la formación de
estroma esporulante.
En cuanto al período que dura cada síntoma en manifestarse, se observa que
en condiciones de Tapachula y en el clon estudiado, el número de días en que
estos síntomas son visibles en frutos infectados con M. roreri es mayor a los
reportados por los citados autores; ellos reportan que la formación de
protuberancias y algunos puntos aislados, observables ocurre entre 30±10
días, la presencia de la mancha ocurre a los 60±10 días y la formación del
micelio o estroma con formación de esporas ocurre entre los 60±70 días
después de la infección. En frutos mayores de tres meses, los citados autores
describen que el síntoma inicial corresponde a puntos acuosos, inicialmente
aislados y luego concéntricos que se observan entre los 30±10 días; la mancha
aparece a los 60±10 días y la esporulación entre los 60 a 70 días. Esta
variación en el tiempo de expresión de los síntomas y signos podría estar
evidenciando la influencia del componente genético del clon estudiado así
como el efecto ambiental.
En Honduras, según reporta la FHIA (2003) el hongo M. roreri manifiesta un
largo período de incubación, es decir desde que infecta al fruto hasta que se
observa algún síntoma externo. Este tiempo puede ser de tres a ocho
semanas, el cual varía según la edad del fruto, la severidad del ataque, la
susceptibilidad del árbol y las condiciones ambientales. En frutos tiernos, en
días lluviosos y calurosos, el período de incubación se acorta a tres semanas.
En los frutos adultos (mayores de tres meses) el síntoma más común de la
moniliasis es una mancha de color café, que puede extenderse hasta cubrir
todo el fruto.
97
El conocimiento de la forma y período en que ocurren los síntomas y signos
que provoca la moniliasis en frutos infectados, obtenidos en esta investigación
permiten comprender la importancia que tiene la edad del fruto al momento de
la infección y que indican que el período más importante para la
implementación de estrategias de protección de los frutos, ya sea por la
aplicación del control químico convencional, el biocontrol o aspersiones de
biofungicidas. Estos tratamientos deben de intensificarse durante los primeros
cuatro meses de edad de los frutos de cacao. Es en esta etapa en la que hay
que poner mayor énfasis en el manejo de las plantaciones y en la protección de
los frutos, ya que esto permitirá alcanzar una mayor cantidad de frutos sanos.
En la Figura 17 se presenta el ciclo de la enfermedad en condiciones de
Tapachula, Chiapas- México.
Figura 17. Ciclo de M. roreri sobre clon UNACH 130, en condiciones de
Tapachula, Chiapas - México.
98
4.2.2. Efecto de extractos sobre inhibición de la germinación.
4.2.2.1. Incidencia de M. roreri.
En la Figura 18 se muestran los resultados de los tratamientos en relación al
porcentaje de incidencia de la enfermedad sobre los frutos de cacao, en la cual
se aprecia como con la aplicación de los extractos antes de la inoculación con
M. roreri el mejor efecto se presentó con el hidrolato de pimienta ya que tan
solo mostró el 25% de incidencia de la enfermedad en los frutos, seguido del
hidrolato de canela con el 28% y el valor más alto lo registró el hidrolato de
clavo con el 44,4%, valor que coincide con su aplicación después de la
inoculación, mientras que los valores tanto para el hidrolato de canela como el
de pimienta aplicados después de la inoculación con M. roreri aumentaron
registrando valores del 50 y 75% respectivamente, mostrando un efecto más
antiesporulante que fungicida; el polisulfuro de calcio mostró el mejor efecto ya
que tanto con su aplicación antes y después de la inoculación no permitió la
infección del patógeno mostrando un efecto fungistático y fungicida.
Según el análisis de varianza practicado existen diferencia entre los
tratamientos (Anexos 29 y 30) y la prueba de Tukey indica que el testigo
inoculado muestra diferencias con los demás tratamientos, los extractos de
clavo aplicado antes y después, así como los extractos de canela y pimienta
aplicados antes de la inoculación registraron diferencias con los demás
tratamientos, mientras que el polisulfuro de calcio aplicado tanto antes como
después fue el único producto que no registro diferencias con el testigo sin
inocular ya que no permitieron la infección ni avance de la enfermedad.
99
120
100
%
I
N
C
I
D
E
N
C
I
A
80
60
40
20
0
A Clav A Can A Pim
A
D Clav D Can D Pim
D
Test sin Test In
SH20% AH30% SH30% Polisul SH20% AH30% SH30% Polisul
In
Ca
Ca
TRATAMIENTOS
Figura 18. Efecto de extractos vegetales sobre la Incidencia de M. roreri en
cacao por inoculación artificial.
4.2.2.2. Severidad externa ocasionada por la inoculación de M. roreri.
El efecto de la aplicación de los extractos vegetales y el polisulfuro de calcio
sobre la severidad externa se aprecia en la Figura 20, en la cual se muestra
como mientras en el testigo inoculado el 100% de los frutos presentó gibas y un
12,5% presentó además mancha aceitosa, los tratamientos con la aplicación de
los extractos antes de la inoculación registraron entre un 86 y 72% de frutos sin
síntomas externos, y entre un 44,5 y un 100% de frutos sin síntomas en la
cuando se aplicaron éstos después de la inoculación, siendo el hidrolato de
pimienta el único que no registró sintomatología externa. La presencia de
manchas se apreció en los extractos de clavo y canela aplicados antes de la
inoculación y de gibas con el extracto de pimienta, mientras que con el
hidrolato de canela aplicado después de la inoculación se presentaron gibas,
mosaico y mancha aceitosa y con el extracto de clavo gibas y se registró el
único caso con fruto esporulado. El único tratamiento que no mostró síntomas
tanto con su aplicación antes como después fue el polisulfuro de calcio.
100
120
100
INDICE
80
%
F
R
U
T
O
S
Esporul
Inicio espor
60
Mancha
Mosaico
40
Jibas
Sano
20
0
A Clav A Can A Pim
A
D Clav D Can D Pim
D Test sin Test In
SH20% AH30% SH30% Polisul SH20% AH30% SH30% Polisul In
Ca
Ca
TRATAMIENTOS
Figura 20. Efecto de la aplicación de extractos vegetales y compuesto mineral
sobre la severidad externa producida por M. roreri en frutos de cacao
por inoculación artificial.
Estos tratamientos mostraron diferencias estadísticas entre ellos según el
análisis de varianza practicado (Anexo 31) y la prueba de Rango múltiple de
Tukey (Cuadro 8) indica que el testigo inoculado tiene diferencias con los
demás tratamientos al presentar éste el mayor valor (0,7), los tratamientos de
clavo y canela aplicados antes y después de la inoculación y el de pimienta
aplicado antes formaron otro grupo, los cuales registraron valores de ISE de
0,6 a 0,2; teniendo diferencias estadísticas con los demás tratamientos los
cuales no mostraron síntomas de la enfermedad por lo que presentaron ISE
con valor de 0.
101
Cuadro 8. Comparación de medias por la prueba de Rango múltiple de Tukey
del Índice de Severidad Externa del efecto de los hidrolatos de clavo,
canela y pimienta en frutos de cacao inoculados con M. roreri.
Tratamiento
Testigo inoculado
N
10
ISE
0,7
Tukey*
A
Clavo hidrolato Antes
10
0,6
AB
Canela hidrolato Después
10
0,3
AB
Clavo hidrolato Después
10
0,3
AB
Canela hidrolato Antes
10
0,3
AB
Pimienta hidrolato Antes
10
0,2
AB
Pimienta hidrolato Después
10
0
B
Polisulfuro de calcio Antes
10
0
B
Polisulfuro de calcio Antes
10
0
B
Testigo sin inocular
10
0
B
4.2.2.3. Severidad interna ocasionada por la inoculación de M. roreri.
La severidad interna mostrada por los tratamientos evaluados se aprecia en la
Figura 21 y Cuadro 10, siendo los extractos aplicados antes de la inoculación
los que registraron los valores más bajos de daños internos, con el 57, 71 y
75% de frutos sin daño interno para los hidrolatos de clavo, canela y pimienta
respectivamente, mientras que para la aplicación después de la inoculación los
valores bajan a 55, 50 y 25%, sin embargo es de aclarar que para el caso del
Índice 1, éste se registró por apreciarse daño, pero permaneció solo en la
cáscara sin afectar los granos. El único tratamiento que no registró daños ni
antes ni después de inoculado el hongo fue el polisulfuro de calcio, mientras
que en el testigo inoculado se pudieron apreciar los niveles de daño del 1 al 4,
y tan solo en el clavo y pimienta aplicados después de la inoculación se
presentó el nivel más alto de daño.
Estos datos indican que los extractos presentan dos tipos de acciones: la
principal es de tipo preventivo ya que al aplicarse antes de la inoculación de las
esporas de M. roreri en el fruto, las probabilidades de desarrollar infección
fueron de un 42% con el hidrolato de clavo, 28,6% para el hidrolato de canela,
15% para el hidrolato de pimienta y de 0% para el polisulfuro de calcio, frente al
100% del testigo inoculado. Sin embargo también tienen cierta acción curativa
es decir, aún con la inoculación del patógeno en los frutos de cacao los
102
extractos permitieron el desarrollo de frutos sin infección, con valores de frutos
sanos de 25% para el hidrolato de pimienta, 55,55% para el hidrolato de clavo,
66,7% en el hidrolato de canela, y del 100% para el polisulfuro de calcio, frente
a cero frutos sanos en el testigo inoculado.
120
% 100
F
R
U
T
O
S
INDICE
80
5
4
60
3
2
1
40
0
20
0
A Clav A Can A Pim A Polisul D Clav D Can D Pim D Polisul Test sin Test In
SH20% AH30% SH30%
Ca
SH20% AH30% SH30%
Ca
In
TRATAMIENTOS
Figura 21. Efecto de la aplicación de extractos vegetales y compuesto mineral
sobre la severidad interna producida por M. roreri en frutos de cacao
por inoculación artificial.
El ANOVA realizado para el Índice de Severidad Interno (Anexo 32), indica la
existencia de diferencias estadísticas entre los tratamientos, y la prueba de
Rango múltiple de Tukey (Cuadro 9) indica que el Testigo inoculado tiene
diferencias con los demás tratamientos, con un ISI de 1,8 que según la escala
reportada
por
Phillips-Mora,
2005
es
un
material
catalogado
como
Moderadamente resistente, mientras los valores de ISI más bajos los
registraron los hidrolatos aplicados antes de la inoculación de M. roreri siendo
el hidrolato de pimienta el valor más bajo con 0,1, registrando diferencias con el
103
de canela con ISI de 0,45 y el de clavo con 0,5, y éstos registraron diferencias
con los aplicados después de la inoculación del patógeno, por lo que se
evidencia que el momento de la aplicación de los hidrolatos es determinante en
la maximización del buen efecto que puede ejercer en el control de M. roreri.
Sin embargo se aprecia que con la aplicación de los hidrolatos sea antes o
después de la inoculación y considerando los ISI registrados por éstos, este
material se comportaría como resistente ya que Phillips-Mora, 2005, cataloga a
los materiales como resistentes si su ISI está entre 0 y 1,25; de 1,26 a 2,5
como moderadamente resistentes.
Es de resaltar que el Polisulfuro de calcio fue el único tratamiento que aplicado
tanto antes como después de la inoculación con M. roreri, registró un ISI de 0,
por lo que éste no registró diferencias estadísticas el testigo sin inocular, pero
sí con los demás tratamientos, estos resultados son concordantes con las
pruebas realizadas en condiciones in vitro en las cuales éste tratamiento
registro los valores más bajos de inhibición en la germinación de conidias, así
como en su formación, seguido por los tratamientos de los hidrolatos de canela
y clavo.
Cuadro 9. Comparación de medias por la prueba de Rango múltiple de Tukey
del Índice de Severidad Interna del efecto de los hidrolatos de clavo,
canela y pimienta en frutos de cacao inoculados con M. roreri.
N
ISI
Testigo inoculado
10
1,8
A
Pimienta hidrolato Después
10
1,15
AB
Canela hidrolato Después
10
0,95
ABC
Clavo hidrolato Después
10
0,8
ABCD
Clavo hidrolato Antes
10
0,5
BCD
Canela hidrolato Antes
10
0,45
BCD
Pimienta hidrolato Antes
10
0,1
CD
Polisulfuro de calcio Antes
10
0
D
Polisulfuro de calcio Después
10
0
D
Testigo sin inocular
10
0
D
Tratamiento
Tukey*
104
4.2.3. Efecto de extractos sobre el desarrollo de la enfermedad en árboles
de cacao
4.2.3.1. Incidencia de la enfermedad.
En la Figura 22 se aprecia el comportamiento de incidencia de M. roreri sobre
frutos de cacao en estado chilillos en una plantación comercial en el trascurso
de 58 semanas, en la cual se aprecia como en el testigo absoluto es decir
aquel que muestra la afección natural del patógeno en la plantación se
registraron los valores más altos, registrando hacia la semana 40 un máximo
de 70% de chilillos enfermos, mientras que todos los tratamientos donde se
aplicaron los extractos vegetales y el polisulfuro de calcio mostraron valores
mucho más bajos, mostrando afectación en las primeras ocho semanas, con
valores que no superaron el 7% de chilillos enfermos.
Las semanas posteriores mostraron la eficiencia de los tratamientos ya que la
incidencia fue de cero, con excepción de la semana 9, en la que el hidrolato de
la semilla de clavo registró el 6,6% de chilillos afectados por M. roreri y durante
las semanas 23, 27 y 29 donde el hidrolato de la semilla de pimienta registró
valores inferiores al 1% de incidencia de la enfermedad en frutos en estado de
chilillo, situación positiva y de gran repercusión en el manejo de la enfermedad
ya que los chilillos que es el estado en donde mayores pérdidas puede
ocasionar el patógeno, ya que daña completamente los frutos y con ello la
producción se ha visto protegida por los tratamientos empleados, pudiendo
asegurar un buen control de la enfermedad y con ello una mayor producción.
El comportamiento de los tratamientos sobre la incidencia de la moniliasis del
cacao sobre mazorcas se puede apreciar en la Figura 23, siendo el testigo
absoluto el que registró los valores más altos en el transcurso de las
evaluaciones, con un máximo del 87% de incidencia sobre mazorcas hacia el
final de las evaluaciones.
105
% CHILILLOS ENFERMOS
80
70
60
%
Clavo sem H 20%
50
Canela Ast H 30%
40
Pimien Sem H 30%
Sulfocalcico
30
Testigo relativo
Testigo Absoluto
20
10
0
0
4
8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52 56
SEMANAS
Figura 22. Efecto de la aplicación de hidrolatos de canela, clavo y pimienta y de
polisulfuro de calcio sobre el porcentaje de incidencia de M. roreri en
chilillos de cacao.
% INCIDENCIA EN MAZORCAS
100
90
80
70
Clavo sem H 20%
60
Canela Ast H 30%
50
Pimien Sem H 30%
Sulfocalcico
40
Testigo relativo
30
Testigo Absoluto
20
10
0
0
4
8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52 56
SEMANAS
Figura 23. Efecto de la aplicación de extractos vegetales y compuesto mineral
sobre el porcentaje de incidencia de M. roreri sobre mazorcas de
cacao.
El efecto positivo de los tratamientos fue evidente ya que los valores de
incidencia de M. roreri sobre las mazorcas de cacao fue casi nulo, en el
106
transcurso de las 29 semanas de evaluación, registrándose para el hidrolato de
canela corteza en las semanas 19, 26 y 29, el 6,6; 2,2 y 9,9% de incidencia
respectivamente, mientras que para el hidrolato de clavo en las semanas 14 y
58 se registraron valores del 2 y 11% respectivamente; con respecto al
hidrolato de pimienta en las semanas 12 y 58 la incidencia sobre las mazorcas
fue del 6,6% y 4,4%, respectivamente y el polisulfuro de calcio en las semanas
con 22 con 2,5% y en el 52 con 6,6% de incidencia, siendo estos valores muy
bajos con respecto al testigo.
% INCIDENCIA EN FRUTOS
90
80
70
60
Clavo sem H 20%
50
Canela Ast H 30%
Pimien Sem H 30%
40
Sulfocalcico
30
Testigo relativo
Testigo Absoluto
20
10
0
0
4
8
12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52 56
SEMANAS
Figura 24. Efecto de la aplicación de extractos vegetales y compuesto mineral
sobre el porcentaje de incidencia de M. roreri sobre frutos de cacao.
En la Figura 24, se muestra la incidencia total de M. roreri (suma de chilillos
con mazorcas), apreciándose una menor incidencia de la enfermedad en los
hidrolatos de canela, clavo y pimienta y el polisulfuro de calcio con respecto al
testigo, ya que mientras los extractos registraron valores máximos del 7% de
incidencia, en la semana 38, el testigo absoluto registró valores hasta del 81%
de frutos afectados por el hongo, apreciándose una significativa reducción de la
incidencia de monilia en frutos de cacao con la aplicación de los extractos
vegetales y con el polisulfuro de calcio, siendo éste último el que registró los
107
valores más bajos en el transcurso de las evaluaciones realizadas, seguido por
los hidrolatos de pimienta, canela y clavo.
En la Figura 25, se aprecia el efecto de los tratamientos sobre el promedio de
la incidencia en frutos en estado chilillo y mazorca y el total de la incidencia,
con respecto al hidrolato de canela se presentó 0% de incidencia en chilillos y
1,08% en mazorcas, para el caso del hidrolato de clavo los valores fueron de
0,08% y de 1,1%, mientras que para el hidrolato de pimienta fueron de 0,26% y
de 0,89% para la incidencia en chillos y mazorcas, respectivamente; en tanto
que el polisulfuro presentó 0,07% para chilillos y 0,46% para mazorcas.
Con respecto al promedio de la incidencia total (suma de incidencia en chilillos
y mazorcas), al practicar el Análisis de varianza se evidencia la presencia de
diferencias estadísticas entre los tratamientos (Anexo 34) y la Prueba de Tukey
(Cuadro 10) muestra que el tratamiento que presentó el mayor porcentaje de
incidencia total de la enfermedad fue el testigo absoluto con un 69,64% el cual
registró diferencias con los demás tratamientos, seguido del tratamiento con
manejo cultural (21,02%), el cual también registró diferencias con los demás, y
los tratamientos con la aplicación de los extractos de clavo, pimienta y canela
con porcentajes de 1,18; 1,15 y 1,08% respectivamente, no registraron
diferencias estadísticas entre ellos, pero si con los demás tratamientos, incluido
con el polisulfuro de calcio, que fue el que tuvo el menor valor de incidencia de
la enfermedad con 0,53% resultados que corroboran los obtenidos en el
ensayo anterior con la inoculación de frutos de cacao con M. roreri,
evidenciando así, el alto grado de efectividad de estos productos al reducir la
infección del hongo en los frutos de cacao.
108
70
60
%
I
N
C
I
D
E
N
C
I
A
50
%INCIDENCIA
CHILILLOS
40
%INCIDENCIA
MAZORCAS
30
%INCIDENCIA
TOTAL
20
10
0
Canela
Hidrolato
Clavo
Hidrolato
Pimienta
Hidrolato
Polisulfuro
de calcio
Testigo
cultural
Testigo
Absoluto
Figura 25. Efecto de la aplicación de hidrolatos de canela, clavo y pimienta y de
polisulfuro de calcio sobre el porcentaje de incidencia de M. roreri en
una plantación de cacao.
Cuadro 10. Comparación de medias por la prueba de Rango múltiple de Tukey
del efecto de tratamientos de los hidrolatos de clavo, canela y pimienta
en la incidencia de M. roreri, en una plantación de cacao.
Tratamiento
% Incidencia
total
Tukey*
% Incidencia
en Chilillos
Tukey*
% Incidencia
en Mazorcas
Tukey*
Polisulfuro de calcio
0,5375
A
0,0763
A
0,4612
A
Canela Hidrolato
1,0841
B
0
A
1,0841
B
Pimienta Hidrolato
1,1593
B
0,2637
B
0,8956
B
Clavo Hidrolato
1,1852
B
0,0806
A
1,1046
B
Testigo cultural
21,023
C
5,2295
C
15,7939
C
Testigo Absoluto
69,641
D
19,1607
D
50,4805
D
*Medias con la misma letra no son estadísticamente diferentes
Los valores de reducción en la afectación de M. roreri fue del 98% para los
hidrolatos y del 99% para el polisulfuro de calcio, datos que muestran mayor
efectividad que los reportados por otros autores. En Venezuela Sánchez, et al.,
109
2003 reporta que con prácticas culturales la incidencia de M. roreri fue menor al
6% y mostró la mayor producción, aunque fue igual a tratamientos con
aspersiones de oxicloruro de cobre y Mancozeb cada 15 días en concentración
de 860 y 347 g i.a/ha, respectivamente solos o combinados con prácticas
culturales quincenalmente; sin embargo menciona que la incidencia de la
enfermedad fue baja para este período evaluado. Bateman, et al., 2005, indican
que el hidróxido de cobre 1500 g i.a ha (-1), ha mostrado ser consistentemente
el más eficaz en el control de M. roreri de una serie de ensayos realizados en
Costa Rica, con un promedio de incremento del 72-100% (es decir, a veces el
doble) en número de frutos sanos y que el fungicida sistémico flutolanil en una
dosis de 300 g de i.a ha-1, parece proteger los frutos sustancialmente al
principio de su etapa de desarrollo, pero con un control proporcionalmente
menor de M. roreri que el cobre en las etapas de desarrollo tardío de los frutos.
Reportes que indican que si bien el cobre actúa sobre M. roreri, no reportan
datos de incidencia tan bajos como los obtenidos en esta investigación con los
hidrolatos de canela, clavo y pimienta y con el polisulfuro de calcio, respuestas
que se dan aún con incidencias naturales de la enfermedad elevadas (69,6%),
es decir que aún en alta presencia del inóculo natural se pueden reducir la
incidencia de la enfermedad con la aplicación de los hidrolatos y del polisulfuro
de calcio, es importante remarcar que en los reportes citados no se menciona
el tipo de material (clones, híbridos) utilizado en la realización de esos ensayos,
ya que como reporta Phillips-Mora, et al., 2005 existe un componente genético
de tolerancia del cacao al patógeno y según los datos para el clon en el que se
realizó el presente estudio es moderadamente resistente, factor que sumado al
buen manejo agronómico de la plantación y a la aspersión de los hidrolato y del
polisulfuro de calcio, permitió bajar substancialmente la incidencia de la
enfermedad.
4.2.3.2. Producción de cacao.
Con respecto a la producción se aprecia en la Figura 26, en la cual el
tratamiento con las aspersiones de polisulfuro de calcio registró el mejor
110
comportamiento con 1485,36 kg de cacao seco por hectárea, seguido del
hidrolato de canela con 1468,64 kg, el de clavo con 1249,44 kg y 1216,56 kg
para el hidrolato pimienta, valores significativamente mayores a los mostrados
por los testigos ya que el testigo cultural registró 449,46 kg mientras que en el
testigo absoluto fue de 142,48 kg de cacao seco/ha.
Estadísticamente el análisis de varianza registró diferencias altamente
significativas entre los tratamientos (Anexo 35). La Prueba Rango múltiple de
Tukey (Cuadro 11) sobre del efecto en la producción de cacao seco de la
aplicación de hidrolatos de canela, clavo y pimienta para el manejo de
M.
roreri, en una plantación comercial muestra que entre los tratamientos de los
hidrolatos de canela, clavo y pimienta y el polisulfuro de calcio no existió
diferencias estadísticas, pero si de éstos con respecto a los testigos de manejo
cultural y el absoluto.
1600
1400
1200
1000
800
g/planta
600
400
200
0
Canela
Hidrolato
Clavo
Hidrolato
Pimienta Polisulfuro
Hidrolato
de calcio
Testigo
cultural
Testigo
absoluto
Figura 26. Efecto de la aplicación de extractos vegetales y compuesto mineral
sobre la producción de cacao.
Si bien el polisulfuro de calcio esta reportado como insecticida (Giménez,
2009), en el caso del cacao pareció que no afectó negativamente a sus
mosquitas polinizadoras Forcipomyia (Díptera: Ceratopogonidae) dados estos
111
datos de producción, situación que puede ser similar a los hidrolatos de clavo,
canela y pimienta, ya que existen reportes de que el hidrolato de la hoja canela
al 50% tiene efecto insecticida sobre Selenothrips rubrocinctus (Aguilar, 2008),
y Zebadua, 2008 reporta efecto de repelencia del hidrolato de la semilla de
pimienta sobre Toxoptera aurantii. Es importante señalar que tampoco se
presentó marchitez o pérdida de los frutos por quemazón debida a una posible
fitotoxicidad de los productos.
Según los reportes dados por el SIAP, 2012 de la SAGARPA, los rendimientos
los rendimientos promedio de los años 2005 al 2011 han estado entre los 540 a
340 kg/ha, valor similar al registrado en el manejo de tipo cultural, pero
inferiores a los obtenidos con el uso de los hidrolatos, ya que para el caso de la
pimienta fue de 760 kg/ha, clavo con 780,9 kg/ha, canela 917,19 kg/ha y del
polisulfuro de calcio con 928,35 kg/ha.
Cuadro 11. Comparación de medias por la prueba de Rango múltiple de Tukey
del efecto en la producción de cacao seco de la aplicación de hidrolatos
de canela, clavo y pimienta para el manejo de M. roreri, en una
plantación comercial.
Tratamiento
Testigo absoluto
kg/ha
89,05
Tukey*
A
Testigo cultural
280,91
A
Pimienta Hidrolato
760,35
B
Clavo Hidrolato
780,90
B
Canela Hidrolato
917,90
B
Polisulfuro de calcio
928,35
B
*Medias con la misma letra no son estadísticamente diferentes
4.3. Análisis económico
Una parte importante de las tecnologías que se generan es su viabilidad desde
el punto de vista económico, es por ello que se analizaron los costos de
producción, dentro del cual están los costos fijos representados por el costo
por la realización de labores culturales en la plantación de cacao del clon
UNACH 130, tales como: el deshierbe, riego y podas, dando un total de 300
112
dólares por hectárea. Además se contemplaron los costos variables para el
caso del testigo cultural, se cuantificó el valor por concepto de mano de obra
para la eliminación semanal de frutos enfermos con un valor de 325 dólares/ha,
que sumado al costo por labores culturales da un valor total para el tratamiento
del testigo cultural de USD 625 por hectárea (Cuadro 12).
Cuadro 12. Costo de labores culturales desarrolladas en una hectárea de
cacao del Clon UNACH 130.
Jornales/año
Precio jornal
USD
Precio total
USD
Deshierbe
24
6,25
150
Riego
12
6,25
75
Poda
12
6,25
75
ACTIVIDAD
TOTAL
Eliminación frutos
enfermos (testigo cultural)
300
52
6,25
325
TOTAL Testigo
cultural
625
En el Cuadro 13 se aprecia el valor calculado por concepto del costo por
aplicación de los tratamientos en una hectárea de cacao del clon UNACH 130,
en el cual se desglosa el valor por el costo del producto requerido a la
concentración evaluada (hidrolatos de canela, clavo y pimienta y del polisulfuro
de calcio), para una hectárea de cacao durante 16 aplicaciones realizadas
durante la época de producción, con aspersiones quincenales equivalente a
ocho meses de aplicación de los productos.
Se incluyó el costo por mano de obra local requerida para la aspersión de los
productos, así como de la recolección y poscosecha de la producción obtenida
en cada uno de los tratamientos evaluados, de esta manera se sumaron a los
costos de mano de obra obtenidos anteriormente dando el total del costo para
cada tratamientos, siendo el más económico el testigo absoluto con USD
573,45, seguido por el testigo cultural con USD 868,65, el polisulfuro de calcio
con USD 1337,5, el hidrolato de clavo con USD 1537,5 y los de mayor costo
113
fueron los tratamientos con aplicación de los hidrolatos de canela y pimienta
con un valor de USD 1887,5.
Por concepto de ingresos por venta de las semillas de cacao secas obtenidas
en una hectárea (Cuadro 14), se tomó el valor promedio de venta en la zona el
cual fue de USD 4,6875, siendo el testigo absoluto el de menor ingreso con
USD 417,42, seguido por el testigo con manejo cultural USD 1316,48; los
tratamientos con los hidrolatos y el polisulfuro a pesar que fueron los de
mayores costos de producción son los generaron mayores ingresos, con
valores de USD de 3564,14, 3660,47 y de 4302,66, para los hidrolatos de
pimienta, clavo y canela respectivamente y el de mayor ingreso fue el
polisulfuro de calcio con USD 4351,64.
114
Cuadro 13. Costo de aplicación por hectárea de los tratamientos sobre el clon de cacao UNACH 130
TRATAMIENTO
Hidrolato canela
Hidrolato clavo
Hidrolato
pimienta
Testigo
polisulfuro de
calcio
Testigo cultural
Testigo absoluto
Mano de
Costo total del
obra
producto/año
Aplicaciones
USD
USD
Costo total
aplicación
USD
Costo
Costos
Labores
cosecha y
culturales poscosecha
USD
USD
Concentración
%
Precio
litro
USD
Número
aplicaciones/año
Costo
total
USD
30
20
1,09
1,09
16
16
1050
700
50
50
1100
750
300
300
487,5
487,5
1887,5
1537,5
30
1,09
16
1050
50
1100
300
487,5
1887,5
10
1,56
16
500
50
550
300
487,5
1337,5
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
625
300
243,75
243,75
868,75
543,75
Cuadro 14. Ingresos por hectárea por venta de semillas de cacao seco producido en cada uno de los tratamientos aplicados sobre
el Clon UNACH 130
Producción
cacao seco
kg/ha/año
Precio venta
cacao
USD/kg
Ingresos por
venta
USD
Hidrolato canela
917,90
4,6875
4302,66
Hidrolato clavo
780,90
4,6875
3660,47
Hidrolato pimienta
760,35
4,6875
3564,14
Testigo polisulfuro de calcio
928,35
4,6875
4351,64
Testigo cultural
280,85
4,6875
1316,48
Testigo absoluto
89,05
4,6875
417,42
TRATAMIENTO
115
El análisis económico practicado para los tratamientos evaluados (Cuadro 15)
indica que la menor relación Beneficio: Costo (B/C) fue en el testigo absoluto con
0,8; es decir que por cada peso que se invierta no se recupera, ya que su valor es
menor de 1, por el contrario existen pérdidas de USD 126,33; con una rentabilidad
negativa de un 23,2%, situación que presentan en la actualidad los productores
quienes al tener baja producción no logran obtener ingresos ni siquiera para
reinvertir en sus plantaciones.
El Tratamiento del manejo cultural sigue siendo una alternativa para los
productores ya que su B/C fue de 1,5; es decir que por cada peso invertido
recuperan el peso más 0,5 y su rentabilidad fue de 51,5%; sin embargo esta
rentabilidad es inferior a la obtenida por los demás tratamientos, ya que con el
hidrolato de pimienta su B/C fue de 1,9, mientras su rentabilidad fue de 88,8%;
seguido por el hidrolato de canela con B/C de 2,3 y 127,95% de rentabilidad, las
mejores relaciones de B/C fueron de 2,4 y 3,3 y rentabilidades de 138,1% y
225,4% para el hidrolato de clavo y el polisulfuro de calcio respectivamente. Es
decir que la aplicación de cualquiera de los hidrolatos de pimienta, canela o clavo
o del polisulfuro de calcio permite reducir la incidencia de M. roreri y mejorar los
ingresos de los productores de cacao, siendo técnica y económicamente viable
este tipo de alternativas para el manejo de la moniliasis del cacao.
Este tipo de alternativas con productos de origen natural permiten a los
productores ingresar a mercados de producción orgánica, los cuales pagan un
sobre precio de entre un 10 a un 30%, lo cual mejoraría aún mas los ingresos de
los productores.
En el Anexo 35 se presenta un análisis de sensibilidad de los tratamientos a
diferentes niveles de producción de cacao, el cual permite calcular con base en
rendimientos potenciales de los clones o de las plantaciones (en forma
generalizada en México existe diversidad de material en una misma plantación) las
posibles relaciones B/C y sus rentabilidades al aplicar la tecnología generada.
116
Según reportes de la SAGARPA el rendimiento promedio en México es de 350
kg/ha, sin embargo la Agencia para la Gestión de la Innovación (AGI, 2010), con
acciones en la Zona del soconusco, (región donde se realizó el presente ensayo)
reporta que los rendimientos actuales son de 167 kg/ha y que antes de la llegada
de la moniliasis eran de 350 kg/ha, datos que permiten apreciar que el problema
de la moniliasis solo agudizó la crisis presentada en el sector ya que los
rendimientos por hectárea son bajos al comparar los obtenidos por países como
Granada, Malasia, Indonesia (cercanos a 1 ton/ha) y Latino Americanos como El
Salvador, Bolivia, Guatemala, Perú y Colombia, con 1; 0,49; 0,48; 0,64 y 0,48
Ton/ha, respectivamente (ICCO, 2012).
Cuadro 15. Análisis económico de cada uno de los tratamientos aplicados sobre el
Clon UNACH 130.
Total costos
USD
Total Ingresos
USD
B/C
Beneficio
Neto
RENTABILIDAD
%
Hidrolato canela
1887,5
4302,66
2,3
2415,16
127,95
Hidrolato clavo
1537,5
3660,47
2,4
2122,97
138,1
Hidrolato pimienta
1887,5
3564,14
1,9
1676,64
88,8
Testigo polisulfuro
de calcio
1337,5
4351,64
3,3
3014,14
225,4
Tratamiento
Testigo cultural
868,75
1316,48
1,5
447,73
51,5
Testigo absoluto
543,75
417,42
0,8
-126,32
-23,2
B/C = Relación Beneficio: costo.
4.4. Análisis de los compuestos de los extractos
En cuanto al contenido de los compuestos de los dos extractos analizados,
detectados por cromatografía de gases acoplado a espectrometría de masas (GCMS), se observa en el Cuadro 16 los tiempos de retención y el porcentaje de
abundancia para los hidrolatos de canela y clavo, que fueron los que presentaron
el mejor comportamiento en las pruebas realizadas en condiciones de campo.
117
Cuadro 16. Comparación de los Tiempos de Retención (TR) y porcentaje de
abundancia obtenidos en GC-MS de los extractos de canela y clavo
Extracto de clavo CL
PICOS
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
TR
(min)
14.241
15.148
20.376
22.758
27.262
96.911
%
TOTAL
0.6158463
0.3947116
2.27352
9.1671069
0.572439
86.976376
Extracto de canela
éter
TR
%
(min)
TOTAL
6.071 0.73256843
7.125 0.18992602
7.666 0.13332543
8.149 0.15316138
8.527 0.26914739
10.877 74.0895138
12.156 1.1524062
14.292 6.80477317
15.643 0.47974818
17.056 2.0162307
17.427 5.19400854
18.274 0.40196693
20.081 3.41242019
20.421 0.37842409
22.565 0.35878054
23.237 0.97234053
28.686 3.26125845
Cuadro 17. Tiempos de retención, porcentajes y la propuesta del compuesto dada
por el equipo de GC-MS del hidrolato de canela
PICOS
TR
(min)
% TOTAL
1
6.071
0.73256843
Compuesto propuesto
por MS
1,6-Octadien-3-ol, 3,7dimethyl
Cas#
Formula
78-70-6
C10H18O
104-53-0
C9H10O
4265-25-2
C9H8O
Estructura
Linalol
Benzenepropanal
2
7.125
0.18992602
Dihydrocinnamaldehyde
Benzofuran, 2-methyl
3
7.666
0.13332543
Methylbenzofuran
118
3-Cyclohexen-1-ol, 4methyl-1(1-methylethyl)
4
8.149
0.15316138
Carvomenthenol
562-74-3
C10H18O
10482-56-1
C10H18O
104-55-2
C9H8O
104-54-1
C9H10O
97-53-0
C10H12O2
Terpinenol
5
8.527
0.26914739
3-Cyclohexene-1methanol, α,α, 4-trimethyl-,
(S)
α-terpieol
2-Propanal, 3-phenyl
6
10.877
74.0895138
Cinnamaldehyde
Aldehído cinámico
2-propen-1-ol, 3-phenyl
7
12.156
1.1524062
Cinnamyl alcohol
Alcohol cinámico
Eugenol
8
14.292
6.80477317
Ácido carofilico
9
15.643
0.47974818
Copaene
3856-25-5
C15H24
10
17.056
2.0162307
Caryophyllene
87-44-5
C15H24
11
17.427
5.19400854
103-54-8
C11H12O2
6753-98-6
C15H24
1504-74-1
C10H10O2
128-37-0
C15H24O
2-propen-1-ol, 3-phenyl,acetate
Cinnamyl acetate
α –caryophyllene
12
18.274
0.40196693
humulene
2-propenal, 3-(2methoxyphenyl)
13
20.081
3.41242019
Cinnamaldehyde, omethoxy
Butylated hydroxytoluene
14
20.421
0.37842409
Ionol
119
15
22.565
0.35878054
16
23.237
0.97234053
Caryophyllene oxide
Phenol, 2,6-dimethoxy-4(2-propenyl)
1139-30-6
C15H24O
6627-88-9
C11H14O3
120-51-4
C14H12O2
Methoxyeugenol
Benzyl Benzoate
17
28.686
3.26125845
Ascabiol
Cuadro 18. Tiempos de retención, porcentajes y la propuesta del compuesto dada
por el equipo de GC-MS del Hidrolato de clavo
PICOS
TR
(min)
% TOTAL
Compuesto
propuesto por el
MS
Cas#
Formula
1
14.241
0.615
Eugenol
97-53-0
C10H12O2
2
15.148
0.39
Vanillin
vanilla
121-33-5
C8H8O3
93-28-7
C12H14O3
84-66-2
C12H14O4
458-36-6
C10H10O3
4376-20-9
C16H22O4
Estructura
Phenol, 2-methoxy-4(2-propenyl)-, acetate
3
20.376
2.271
Eugenol acetato
Diethyl phthalate
4
22.758
9.16
Anozol
5
6
27.262
96.911
0.57
86.97
2- propenal, 3-(4hydroxy-3methoxyphenyl)
1,2benzenedicarboxylic
acid, mono (2ethylhexyl) ester
Mehp
120
Los cromatogramas de cada extracto se presentan en la Figuras 27 y 28.
Considerando la abundancia de picos en el caso del extracto de canela se realizó
el análisis con éter de petróleo y para clavo con cloroformo. Destacando las
siguientes observaciones: todos los picos no corresponden a compuestos
naturales, ya que para el caso del hidrolato de clavo el Diethyl phthalate es un
compuesto que esta presente en los plásticos y el 1,2- benzenedicarboxylic acido,
mono (2-ethylhxyl) ester, se encuentra en el PVC, por lo que se consideran
impurezas,
éste último compuesto, se excluyó del porcentaje del total de los
compuestos del extracto, y mostrado así por el análisis del equipo en el cual se
analizó, el cual arrojo una suma de correlación del área de 999197900, y una
correlación del porcentaje del 100%. Mientras que para los otros cinco picos
incluido el Diethyl phthalate la suma de las áreas fue de 126110678, dando los
porcentajes mostrados en el Cuadro 18.
121
Figura 27. Cromatograma del hidrolato de canela con diferentes solventes
122
Figura 28. Cromatograma del hidrolato de clavo con diferentes solventes
En cuanto a la naturaleza química de los compuestos y su concentración en cada
extracto es necesario mencionar que esta última fue evaluada por cromatografía
de gases, por lo que estos valores se tomaran como reales. Sin embargo, la
identificación de cada componente se ha realizado con el apoyo de la biblioteca
que contiene el equipo GC-MS, por lo que dicha identificación para este trabajo
será considerada por estas sugerencias, siendo que el grado de confiabilidad es
grande pero no es definitiva.
123
En cuanto al extracto de canela se lograron identificar 17 compuestos los cuales
se presentan en el Cuadro 17; los compuestos mayoritarios son el aldehído
cinámico con el 74,08%, eugenol con 6,8% y acetato de cinamilo con el 5,18% (en
la Figura 29, se presenta el espectro de masas y en el Cuadro 17 sus estructuras),
porcentajes que coinciden con lo reportado por diversos autores quienes
menciona que el aceite esencial de canela esta constituido fundamentalmente por
aldehído cinámico (65-75%) y de eugenol (5-10%) (Albo, 2001; Padrón, 2010;
Kumar, 2012; Matan y Matan, 2007).
El aldehído cinámico, es un aldehído aromático que tiene reportes de su actividad
antifúngica en varios organismos tanto para bacterias patógenas (Suresh et al.,
1992) como para hongos (Barrera y García, 2008; Giordani, 2006, Velluti, 2003).
Se tienen reportes que la actividad de la canela es debido a la presencia de
cinamaldehído, el cual inhibe la actividad la descarboxilasa aminoácida
(Wendakoon y Sakaguchi,1995) este aldehído es altamente electro-negativo, el
cual interfiere en los procesos biológicos que implican electrones, el cual transfiere
y reacciona con componentes que contienen nitrógeno, por ejemplo proteínas y
ácidos nucleicos, y por lo tanto inhibe el crecimiento de los microrganismos, tal
como lo reporta Barrera y García, (2008) donde el aldehído cinámico inhibió
totalmente el crecimiento micelial de Fusarium sp.
El segundo compuesto mayoritario es el Eugenol (6,8%), el cual también es
reportado como constituyente de aceite de la canela (Ranasinghe et al., 2002,
reportó contenidos del 4,7%), este compuesto también es reconocido por su fuerte
actividad contra bacterias y hongos con efecto fungicida y fungistático,
dependiendo de la concentración utilizada (Pelczar et al., 1988).
Di Pascua, et al., (2006), reporta que Escherichia coli presentó cambio
substanciales en la composición de ácidos grasos de la membrana celular en
presencia de aldehído cinámico mientras que para Salmonella typhimurium se
presentó el mismo efecto en presencia de eugenol.
124
El hidrolato de canela también contiene acetato de cinamilo (5,19%), que según lo
reportado por Gupta, et al., 2008, potencializa la actividad de los demás
compuestos, además menciona que los mecanismos involucrados de estos tres
compuestos en la actividad fungistática o fungicida son a nivel del citoplasma, la
ruptura de la membrana citoplasmática y la inactivación y/o inhibición de enzimas
intra y extracelular. Estos eventos biológicos podrían tener lugar por separado o
simultáneamente, que culmina con la inhibición de germinación y el desarrollo del
micelio, también, pueden actuar sobre la pared celular fúngica, causando la
ruptura de b-1, 3 glucano, b-1, 6 glucano y polímeros de quitina (Cowan, 1999;
Brull y Coote, 1999 citados por Gupta, 2008).
Figura 29. Espectro de masas del compuesto mayoritario del hidrolato de canela:
Aldehído cinámico.
En cuanto al hidrolato de clavo el análisis registro 6 picos de los cuales el pico 4 y
6 no son productos naturales, considerandosen impurezas.
Por lo que el
125
compuesto mayoritario es el Acetato de Eugenol, su estructura química se
presenta en el Cuadro 18, y su Espectro de masas se muestra en la Figura 30, el
porcentaje de este compuesto incluyendo las impurezas seria del 2,27%, y
quitándolas sería del 58,95%, el siguiente compuesto bajo estas mismas
circunstancias correspondería al Eugenol con el 15,96% (en la Figura 31 se
presenta su espectro de masas), el 2- propenal, 3-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl),
con el 14,84% y finalmente el pico 2 correspondiente a la vainilla con el 10,23%,
las estructuras químicas de estos compuestos se presentan en el Cuadro 18.
Estos compuestos han sido reportados por varios autores como componentes del
aceite esencial del clavo, aunque en porcentajes diferentes ya que reportan al
eugenol como compuesto mayoritario con el 70 al 85%, y otros compuestos como
α y β cariofilenos, isoeugeno, acetato de eugenol y pequeñas cantidades de
ésteres, cetonas y alcoholes y se tienen reportes que el aceite esencial de clavo
de olor contiene 85 - 95% de eugenol y acetileugenol (Mazzafera, P. 2003,
Omidbeygi, 2007; Padrón, 2010; Matan y Matan, 2007; Kumar, et al., 2012).
Figura 30. Espectro de masas del compuesto mayoritario del hidrolato de clavo:
Acetato de eugenol.
126
El efecto del hidrolato de clavo sobre M. roreri puede ser debido al Eugenol, que
es un compuesto fenólico de acción antiséptica con reconocido efecto inhibitorio
sobre diversos organismos, Lining Cai y Christine D. Wu (1996) comprobaron el
potencial como antimicrobiano de los extractos no polares del clavo contra
patógenos orales Gram negativos, bacterias como E. coli y Cepas de Salmonella
(Di Pascua et al., 2006) Dorman y Deans (2000) demostraron su efecto sobre 25
bacterias patógenas gram positivas y gam negativas a cultivos y al hombre,
también se tiene reporte de su efecto sobre microorganismos como nematodos,
insectos así como efecto antiviral (Mazzafera, 2003), Padrón, (2010) encontró que
los hongos fueron los microorganismos más susceptibles frente a la fracción con
actividad antimicrobiana del extracto hexánico del clavo, cuyo constituyente
principal fue el Eugenol. También se observó que los hongos más susceptibles
fueron los filamentosos, principalmente Trichophyton tonsurans y Sporotrix
schenckii; estas cualidades antifúngicas del clavo sobre cepas filamentosas
también han sido descritas por autores como Amiri A. et al., (2008) quienes
mencionan al eugenol como posible agente activo en formulaciones para evitar el
desarrollo de enfermedades posteriores a la cosecha de frutos como la manzana;
así mismo Costa (2011) reporta el efecto del clavo sobre F. oxysporum, y R.
solani, además
cita a Amaral y Bara (2005) los que reportan efecto en la
reducción del crecimiento micelial del aceite esencial de clavo sobre Rhizopus
stolonifer. Ranasinghe et al., (2002), demuestra la acción inhibitoria del clavo
sobre
Lasiodiplodia
theobromae,
C.
musae
y
proliferatum,
Fusarium
y
Colletotrichum en banano.
La actividad antifúngica del aceite esencial de clavo, está relacionada con su
hidrofobicidad, lo que les permite interactuar con la pared lipídica, la membrana
celular y la permeabilidad de las mitocondrias, alterándolos y causando
perturbaciones en estas estructuras. Los componentes de aceite pueden unirse a
iones y moléculas (hormonas) de otras células. También se ha informado por
Dorman y Deans (2000) que los antifúngicos naturales causan daño a la
membrana celular de las células expuestas a ellos, dejándolos extremadamente
127
soluble y fracturas que en última instancia exponer el contenido celular, incluyendo
el núcleo. Sin embargo Padrón (2010) reporta que en general, los aceites
esenciales poseen fuertes propiedades antibacterianas debido a que contienen un
alto porcentaje de compuestos fenólicos como el eugenol. Lo anterior sugiere que
su mecanismo de acción, sea similar al de otros compuestos fenólicos, por
alteración de la membrana citoplasmática, interrumpiendo la fuerza motriz de
protones (PMF), el flujo de electrones, el transporte activo y la coagulación del
contenido celular. Se ha encontrado que a concentraciones subletales de eugenol
se inhibe la producción de amilasa y proteasas de B. cereus, deteriorando la pared
celular, lo que origina la lisis celular. Se cree que el grupo hidroxilo del eugenol al
que se unen ciertas proteínas, previene la acción enzimática en E. aerogenes
(Denyer y Hugo, 1991b; Sikkema et al., 1995.; Davidson, 1997; Wendakoon y
Sakaguchi, 1995 citados por Padrón).
Figura 31. Espectro de masas del Eugenol compuesto del hidrolato de clavo.
128
CONCLUSIONES
Los hidrolatos de clavo al 20% y de canela al 30% son eficientes en el manejo de
la moniliasis del cacao Moniliophthora roreri, los cuales son técnica y
económicamente viables de incorporarlos en un sistema de producción orgánica
de cacao (Theobroma cacao L) en México.
La mejor forma de obtención de los extractos es el hidrolato ya que en las seis
plantas evaluadas éste resultó ser el método que presentó el mejor efecto
regulador sobre M. roreri, seguido por el presurizado y la fermentación aeróbica.
De los tres métodos evaluados (difusión en agar, discos de papel modificado y el
de Kirby-Bauer), para determinar la efectividad de los extractos in vitro sobre M.
roreri, el Kirby-Bauer puede ser utilizado como una prueba rápida de screening y
el de difusión en agar es útil para la determinación de la Concentración Mínima
Inhibitoria.
La menor concentración mínima inhibitoria de los extractos sobre M. roreri, se
determinó al 20% (V/V), con los hidrolatos de flor de clavo, hoja de canela y hoja
de pimienta, así como para el presurizado de flor de clavo; seguidos por la del
30% (V/V) de los hidrolatos de pimienta semilla, canela corteza y jengibre y para el
fermentado aeróbico de flor de clavo.
El medio líquido preparado con extracto de cacao resultó ser el más eficiente para
promover la mayor al multiplicación y germinación de las conidias de M. roreri en
condiciones de laboratorio.
La efectividad de los hidrolatos de clavo, canela y pimienta se debe posiblemente
al efecto preventivo al inhibir la germinación y multiplicación de las conidias, así
como al efecto funguicida al destruir las conidias de M. roreri que en conjunto
129
provocan la reducción de la incidencia y severidad externa e interna de la
enfermedad.
Aún con alta incidencia natural de M. roreri (69,6%) en una plantación monoclonal
de cacao los valores de reducción en la afectación de la enfermedad al aplicar en
campo los hidrolatos de clavo, canela y pimienta fueron del 98% y del 99% para el
polisulfuro de calcio, y el aumento en la producción de cacao entre un 800 y
1000% con respecto al testigo absoluto, lo que indica una alta viabilidad técnica de
estas alternativas dentro de un plan de manejo de la moniliasis del cacao.
En plantaciones comerciales de cacao manejadas con los hidrolatos de canela y
clavo, se obtuvo una mejora en los rendimientos y reducción de la enfermedad con
una relación Beneficio/Costo mayor a 2 y una rentabilidad del 127,95% y 138%
respectivamente, por lo que es factible económicamente el uso de estos extractos
dentro de un sistema de producción de cacao ya sea tradicional o con manejo
orgánico.
Para el hidrolato de canela se identificaron 17 compuestos siendo los mayoritarios
el aldehído cinámico con el 74,08%, eugenol con 6,8% y acetato de cinamilo con
el 5,18%; mientras que para el hidrolato de clavo los compuestos mayoritarios son
el acetato de eugenol (58,95%), y el eugenol (15,96%), los cuales tienen reportes
de actividad sobre diversos organismos pudiendo ser éstos compuestos los que
ejerzan acción inhibitoria sobre M. roreri.
130
RECOMENDACIONES
Realizar pruebas con los hidrolatos de canela, clavo y pimienta en otras
plantaciones de cacao bajo otros ambientes y con otros materiales de cacao ya
que el componente genético es un aspecto importante a considerar en este tipo de
trabajos en condiciones de campo.
Efectuar evaluaciones in vitro de estos hidrolatos para las otras cepas de M. roreri,
las cuales aún no están presentes en México, pero que pueden igualmente
ingresar.
Determinar mediante ensayos de laboratorio y de campo la efectividad de la
mezcla en diferentes proporciones de los extractos de pimienta, clavo y canela
que se encontraron como los ejercen la mayor acción inhibitoria sobre M. roreri y
establecer si su mezcla permite la potencialización de su efecto o bien la
reducción de la concentración mínima inhibitoria.
Realizar el escalamiento a nivel de planta piloto y posteriormente a nivel industrial
de este tipo de alternativas que permitan poner a disposición de los productores
de cacao este tipo de alternativa para el manejo de la moniliasis del cacao y que
se integre a un plan de manejo de la plantación, que incluya la renovación de las
plantaciones viejas e improductivas, bajar el porte de los árboles de cacao a
máximo cuatro metros de tal manera que permita la observación y remoción de
frutos enfermos, optimizar la aplicación de los extractos y de fertilizantes líquidos,
y con ello maximizar los recursos para que sea económicamente atractivo para los
productores de cacao.
131
BIBLIOGRAFÍA
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ANEXOS
142
Anexo 1.Produccion Mundial de cacao
2008/2009
África
Camerún
Costa de Marfil
Ghana
Nigeria
Otros
América
Brasil
Ecuador
Otros
Asia y Oceanía
Indonesia
Papua Nueva
Guinea
Otros
Total mundial
2516
224
1223
662
250
157
478
157
135
186
598
490
59
Producción mundial de cacao en miles de toneladas
% de
2009/2010
% de
participación
participación
70
2483
68.4
205
1242
632
235
168
13.3
517
14.2
161
150
206
16.6
632
17.4
550
39
48
3593
44
3631
100
Estimado
2010/2011
3180
230
1511
1025
240
175
540
200
145
195
530
440
45
% de
participación
74.8
45
4250
100
12.7
12.5
100
Fuente: ICCO, 2011
Anexo 2. Producción de cacao en México
Sup. Sembrada
Sup. Cosechada
Producción
Rendimiento
PMR
Valor
Producción
(ha)
(ha)
(t)
(t/ha)
($/t)
(Miles de Pesos)
2000
81,400.90
81,022.90
28,046.49
0.35
8,792.62
246,602.23
2001
83,135.90
83,036.90
46,737.65
0.56
8,339.39
389,763.37
2002
83,174.45
83,130.45
46,194.39
0.56
14,146.98
653,511.18
2003
81,987.11
80,903.05
49,964.76
0.62
16,920.18
845,412.97
2004
81,964.11
80,878.96
43,974.52
0.54
17,972.24
790,320.76
2005
62,687.66
61,476.51
36,366.16
0.59
17,871.26
649,909.18
2006
61,220.77
60,866.27
38,150.87
0.63
15,406.36
587,766.02
2007
61,024.27
60,933.77
29,909.74
0.49
16,992.77
508,249.25
2008
61,092.35
61,035.85
27,548.93
0.45
25,700.69
708,026.43
2009
61,403.35
61,317.35
22,660.79
0.37
31,689.04
718,098.73
2010
61,344.25
61,187.25
27,173.61
0.44
37,473.85
1,018,299.71
AÑO
2011
21,568.00
Fuente: Servicio de información Agroalimentaria y pesquera (SIAP) de la SAGARPA, 2012
Anexo 3. Análisis de varianza para extractos a concentración del 50% (v/v) sobre
el crecimiento de M. roreri.
FV
Tratamiento
Error
Total
GL
37
152
189
SC
CM
69548,86842 1879,69915
12,40000
0,08158
69561,26842
F
23041,5
P>F
0,0001
Coeficiente de Variación 1,521386
143
Anexo 4. Comparación de medias por la Prueba de Rango múltiple de Tukey
(P<0.05) para extractos de evaluados a concentración del 50% (v/v) sobre
el crecimiento de M. roreri.
TRATAMIENTOS
Canela hoja hidrolato
Canela hoja presurizado
Canela hoja aeróbico
Canela corteza hidrolato
Pimienta hoja hidrolato
Pimienta hoja presurizado
Pimienta semilla hidrolato
Pimienta semilla presurizado
Clavo hoja hidrolato
Clavo flor hidrolato
Clavo flor presurizado
Clavo flor aeróbico
Clavo flor anaeróbico
Orégano hidrolato
Maguey hidrolato
Jengibre hidrolato
Testigo Químico
Canela hoja anaeróbica
Canela corteza presurizado
Clavo hoja presurizado
Pimienta hoja anaeróbica
Orégano aeróbica
Canela corteza anaeróbica
Pimienta hoja aeróbica
Pimienta semilla anaeróbica
Jengibre presurizado
Pimienta semilla aeróbica
Orégano presurizado
Jengibre aeróbica
Clavo hoja anaeróbica
Maguey presurizado
Jengibre anaeróbica
Clavo hoja aeróbica
Orégano anaeróbica
Canela corteza aeróbica
Maguey aeróbica
Maguey anaeróbica
Testigo absoluto
Crecimiento
mm
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
11,40
11,80
21,00
22,20
22,80
23,20
26,20
29,80
29,80
32,20
33,00
35,20
39,80
43,60
44,60
45,00
45,00
46,80
50,00
50,00
50,00
Tukey*
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
O
N
N
M
L
KL
K
J
I
I
H
G
F
E
D
C
C
C
B
A
A
A
*Medias con la misma letra no son estadísticamente diferentes
144
Anexo 5. Análisis de varianza para extractos a concentración del 50% (v/v) sobre
la formación de conidias de M. roreri.
FV
Tratamiento
Error
Total
GL
37
152
189
SC
3,5876493
3,199389
3,5879692
Coeficiente de Variación 1,833237
CM
9,6963495
2,1048612
F
P>F
46066,5 0,0001
Anexo 6. Comparación de medias por la Prueba de Rango múltiple de Tukey
(P<0.05) para extractos de evaluados a concentración del 50% (v/v) sobre
la formación de conidias de M. roreri.
7
TRATAMIENTO
Conidias/Ml X 10
Tukey*
Canela hoja hidrolato
0
R
Canela hoja presurizado
0
R
Canela hoja F. aeróbico
0
R
Canela corteza hidrolato
0
R
Pimienta hoja hidrolato
0
R
Pimienta hoja presurizado
0
R
Pimienta semilla hidrolato
0
R
Pimienta semilla presurizado
0
R
Clavo hoja hidrolato
0
R
0
R
Clavo flor hidrolato
0
R
Clavo flor presurizado
0
R
Clavo flor F. aeróbico
0
R
Clavo flor F. anaeróbico
Orégano hidrolato
0
R
Maguey hidrolato
0
R
Jengibre hidrolato
0
R
Testigo Químico
0
R
Canela hoja F. anaeróbica
0,455
Q
Canela corteza presurizado
0,742
PQ
Canela corteza F. anaeróbico
0,760
PQ
Pimienta semilla F. aeróbico
0,948
OP
Clavo hoja presurizado
1,243
NO
Pimienta semilla F. anaeróbico
1,319
N
Orégano presurizado
1,819
M
Pimienta hoja F. anaeróbico
3,271
L
Jengibre presurizado
4,910
K
Maguey presurizado
5,595
J
Pimienta hoja F. aeróbica
6,189
I
Jengibre aeróbica
8,984
H
Orégano F. anaeróbica
9,181
H
Orégano F. aeróbica
9,983
G
Canela corteza F. aeróbica
13,635
F
Testigo absoluto
34,463
E
Clavo hoja F. anaeróbica
36,920
D
Jengibre F. anaeróbica
37,567
D
Maguey F. anaeróbica
39,864
C
Clavo hoja F. aeróbica
40,454
B
Maguey F. aeróbica
42,817
A
*Medias con la misma letra no son estadísticamente diferentes.
145
Anexo 7. Análisis de varianza para extractos a cuatro concentraciones sobre el
crecimiento de M. roreri.
FV
GL
SC
Tratamiento
33
76595.200
Error
136
6.40000
Total
169
76601.60000
Coeficiente de Variación 0.881831
CM
2321.067
0.04706
F
554.187
P>F
0,0001
Anexo 8. Comparación de medias por la Prueba de Rango múltiple deTukey
(P<0.05) para extractos de evaluados a cuatro concentración sobre el
crecimiento de M. roreri.
TRATAMIENTOS
Canela hoja hidrolato 40%
Canela hoja hidrolato 30%
Canela hoja hidrolato 20%
Canela hoja presurizado 40%
Canela corteza hidrolato 40%
Canela corteza hidrolato 30%
Pimienta hoja hidrolato 40%
Pimienta hoja hidrolato 30%
Pimienta hoja hidrolato 20%
Pimienta semilla hidrolato 40%
Pimienta semilla hidrolato 30%
Pimienta semilla presurizado 40%
Testigo Químico
Canela corteza hidrolato 20%
Canela hoja presurizado 40%
Pimienta hoja presurizado 40%
Canela hoja hidrolato 10%
Pimienta semilla hidrolato 20%
Canela corteza hidrolato 10%
Canela hoja F. aeróbico 40%
Pimienta semilla presurizado 30%
Pimienta hoja hidrolato 10%
Pimienta hoja presurizado 30%
Canela hoja F. aeróbico 30%
Canela hoja presurizado 20%
Canela hoja presurizado 10%
Canela hoja F. aeróbico 20%
Canela hoja F. aeróbico 10%
Pimienta hoja presurizado 20%
Pimienta hoja presurizado 10%
Pimienta semilla hidrolato 10%
Pimienta semilla presurizado 20%
Pimienta semilla presurizado 10%
Testigo absoluto
Crecimiento mm
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
13,80
24,20
26,20
27,00
27,80
30,80
31,40
34,20
39,80
42,20
44,00
45,00
50,00
50,00
50,00
50,00
50,00
50,00
50,00
50,00
50,00
Tukey*
N
N
N
N
N
N
N
N
N
N
N
N
N
M
L
K
J
I
H
G
F
E
D
C
B
A
A
A
A
A
A
A
A
A
*Medias con la misma letra no son estadísticamente diferentes.
146
Anexo 9. Análisis de varianza para extractos de clavo, jengibre, orégano y
maguey, a cuatro concentraciones sobre el crecimiento de M. roreri.
FV
GL
SC
CM
F
P>F
Tratamiento
33
76023.112
2303.731
242.573
0,0001
Error
136
1291.600
9.497
Total
169
77314.712
Coeficiente de variación 1,026308
Anexo 10. Comparación de medias por la Prueba de Rango múltiple de Tukey
(P<0.05) para extractos de clavo, jengibre, orégano y maguey, evaluados
a cuatro concentraciones sobre el crecimiento de M. roreri.
TRATAMIENTOS
Clavo botón floral hidrolato 40%
Clavo botón floral hidrolato 30%
Clavo botón floral hidrolato 20%
Clavo botón floral presurizado 40%
Clavo botón floral presurizado 30%
Clavo botón floral presurizado 20%
Clavo botón floral F. aeróbico 40%
Clavo botón floral F. aeróbico 30%
Clavo botón floral F. anaeróbico 40%
Jengibre hidrolato 40%
Jengibre hidrolato 30%
Testigo Químico
Maguey hidrolato 40%
Orégano hidrolato 30%
Orégano hidrolato 40%
Clavo hoja hidrolato 40%
Clavo hoja hidrolato 30%
Clavo botón floral F. anaeróbica 30%
Clavo botón floral hidrolato 10%
Oregano hidrolato 20%
Clavo botón floral F. Aeróbico 20%
Clavo botón floral F. Anaeróbico 20%
Maguey hidrolato 30%
Clavo hoja hidrolato 20%
Clavo botón floral presurizado 10%
Jengibre hidrolato 20%
Clavo hoja hidrolato 10%
Clavo botón floral F. aeróbico 10%
Clavo botón floral F. anaeróbico 10%
Orégano hidrolato 10%
Maguey hidrolato 20%
Maguey hidrolato 10%
Jengibre hidrolato 10%
Testigo absoluto
Crecimiento m
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
9,00
12,20
12,40
17,00
24,40
25,60
25,80
26,80
39,40
42,40
44,60
45,00
45,00
45,00
50,00
50,00
50,00
50,00
50,00
50,00
50,00
50,00
Tukey*
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
AB
AB
AB
CD
DE
E
E
E
F
F
FG
FG
FG
FG
G
G
G
G
G
G
G
G
*Medias con la misma letra no son estadísticamente diferentes.
147
Anexo 11. Análisis de varianza para extractos de canela y pimienta evaluados a
cuatro concentraciones sobre la formación de conidias de M. roreri.
FV
GL
SC
CM
F
P>F
Tratamiento
33
2168724451892406000
65718922784618300
113.091
0,0001
Error
136
79031604559875000
581114739410845
Total
169
2247756056452281000
Coeficiente de variación 3,247439
Anexo 12. Comparación de medias por la Prueba de Rango múltiple de Tukey
(P<0.05) para extractos de canela y pimienta evaluados a cuatro
concentraciones sobre la producción de conidias de M. roreri.
Conidias/mL
7
TRATAMIENTO
X 10
Tukey*
Canela hoja hidrolato 40%
0
V
Canela hoja hidrolato 30%
0
V
Canela hoja hidrolato 20%
0
V
Canela hoja presurizado 40%
0
V
Canela corteza hidrolato 40%
0
V
Canela corteza hidrolato 30%
0
V
Pimienta hoja hidrolato 40%
0
V
Pimienta hoja hidrolato 30%
0
V
Pimienta hoja hidrolato 20%
0
V
Pimienta semilla hidrolato 40%
0
V
Pimienta semilla hidrolato 30%
0
V
Pimienta semilla presurizado 40%
0
V
Testigo Químico
0
V
Pimienta semilla hidrolato 20%
2,99
U
Pimienta hoja presurizado 40%
4,09
T
Canela hoja presurizado 30%
5,09
S
Canela hoja hidrolato 10%
5,73
R
Pimienta hoja presurizado 30%
6,45
Q
Pimienta hoja hidrolato 10%
7,33
P
Canela corteza hidrolato 20%
8,98
O
Canela hoja F. aeróbica 40%
9,66
N
Pimienta semilla presurizado 30%
9,71
M
Canela hoja F. aeróbica 20%
13,70
L
Canela hoja F. aeróbica 30%
14,82
K
Canela hoja presurizado 20%
15,18
J
Canela corteza hidrolato 10%
15,75
I
Pimienta semilla hidrolato 10%
19,57
H
Pimienta semilla presurizado 20%
20,50
G
Pimienta hoja presurizado 20%
24,98
F
Pimienta hoja presurizado 10%
25,95
E
Pimienta semilla presurizado 10%
29,49
D
Canela hoja presurizado 10%
29,60
C
Canela hoja F. aeróbica 10%
30,68
B
Testigo absoluto
40,32
A
*Medias con la misma letra no son estadísticamente diferentes
148
Anexo 13. Análisis de varianza para extractos a cuatro concentraciones sobre la
formación de conidias de M. roreri.
FV
Tratamiento
Error
Total
GL
SC
CM
F
P>F
33
2352164728993844000
71277719060419500
87.079
0,0001
136
111321778279483300
818542487349142
169
2463486507273327000
Coeficiente de variación 5,643576
.
149
Anexo 14. Comparación de medias por la Prueba de Rango múltiple de Tukey
(P<0.05) para extractos de evaluados a cuatro concentraciones sobre la
producción de conidias de M. roreri.
TRATAMIENTO
Clavo flor hidrolato 40%
Clavo flor hidrolato 30%
Clavo flor hidrolato 20%
Clavo flor presurizado 40%
Clavo flor presurizado 30%
Clavo flor presurizado 20%
Clavo flor F. aeróbico 40%
Clavo flor F. anaeróbico 30%
Clavo flor F. anaeróbico 40%
Jengibre hidrolato 40%
Jengibre hidrolato 30%
Testigo Químico
Orégano hidrolato 30%
Orégano hidrolato 40%
Maguey hidrolato 40%
Clavo flor hidrolato 10%
Orégano hidrolato 20%
Clavo flor F. anaeróbico 30%
Clavo flor F. aeróbico 20%
Clavo hoja hidrolato 40%
Maguey hidrolato 30%
Jengibre hidrolato 20%
Clavo hoja hidrolato 30%
Clavo flor F. anaeróbico 20%
Clavo flor presurizado 10%
Clavo hoja hidrolato 20%
Clavo flor F. Aeróbico 10%
Maguey hidrolato 20%
Orégano hidrolato 10%
Jengibre hidrolato 10%
Maguey hidrolato 10%
Clavo flor F. Anaeróbico 10%
Clavo hoja hidrolato 10%
Testigo absoluto
Conidias/mL
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
2,34
2,81
2,86
3,31
3,56
3,92
4,76
7,23
8,20
8,63
8,68
9,28
10,93
14,63
19,96
23,31
25,87
27,61
30,20
31,00
33,57
40,32
Tukey*
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
AB
AB
AB
AB
AB
ABC
ABC
ABC
BCD
BCD
BCD
BCD
CD
DE
EF
FG
FGH
GHI
GHI
HI
IJ
J
*Medias con la misma letra no son estadísticamente diferentes.
150
Anexo 15. Análisis de varianza de productos de síntesis química sobre el
crecimiento de M. roreri mediante el Método de disco de papel.
FV
GL
SC
CM
F
P>F
Tratamiento
11
145,729
13,248
635,909
0,0001
Error
36
0,750
0,021
Total
47
146,479
Coeficiente de variación 4,672694
Anexo 16. Comparación de medias por la Prueba de Rango múltiple de Tukey
(P<0,05) para productos de síntesis química evaluados sobre la
producción de conidias de M. roreri mediante el Método de discos de
papel.
Diámetro de
inhibición
(mm)
Tukey*
Barrida 20 µL
0,00
A
Barrida 50 µL
0,00
A
Ranman 20 µL
0,00
A
Ranman 50 µL
0,00
A
Eco 720 20 µL
0,00
A
Eco 720 50 µL
0,00
A
Tamis 20 µL
0,00
A
Tamis 50 µL
0,00
A
Ridomil 20 µL
0,00
A
Ridomil 50 µL
0,00
A
Ziram 20 µL
4,00
B
Ziram 50 µL
5,25
C
PRODUCTOS DE SINTESIS
QUIMICA
*Medias con la misma letra no son estadísticamente diferentes
Anexo 17. Análisis de varianza del efecto de extractos vegetales sobre el
crecimiento de M. roreri mediante el método de Disco de papel.
FV
GL
SC
CM
F
P>F
Tratamiento
36
9099,892
252,775
876,813
0,0001
Error
111
32,000
0,288
Total
147
9131,892
151
Anexo 18. Comparación de medias por la Prueba de Rango múltiple de Tukey
(P<0,05) de extractos vegetales sobre el crecimiento de M. roreri mediante
el Método de discos de papel.
DIAMETRO DE
INHIBICION (mm)
EXTRACTOS
TUKEY*
Orégano hidrolato
0,00
A
Orégano presurizado
0,00
A
0,00
Orégano F. Aeróbico
A
0,00
Orégano F. Anaeróbico
A
0,00
Maguey hidrolato
A
0,00
Maguey presurizado
A
0,00
Maguey F. Aeróbico
A
0,00
Maguey F. Anaeróbico
A
0,00
Jengibre hidrolato
A
0,00
Jengibre presurizado
A
0,00
Jengibre F. Aeróbico
A
0,00
Jengibre F. Anaeróbico
A
0,00
Clavo hoja hidrolato
A
0,00
Clavo hoja presurizado
A
0,00
Clavo hoja F. Aeróbico
A
0,00
Clavo hoja F. Anaeróbico
A
0,00
Canela corteza F. aeróbico
A
0,00
Canela corteza F. anaeróbico
A
0,00
Pimienta hoja hidrolato
A
0,00
Pimienta hoja presurizado
A
0,00
Pimienta hoja F. aeróbico
A
0,00
Pimienta hoja F. anaeróbico
A
0,00
Pimienta semilla presurizado
A
0,00
Pimienta semilla F. aeróbico
A
0,00
Pimienta semilla F. anaeróbico
A
Canela corteza presurizado
7,00
B
Canela hoja presurizado
9,50
C
Clavo flor F. aeróbico
11,00
CD
Canela hoja F. anaeróbico
11,50
D
Clavo flor presurizado
13,50
E
Clavo flor F. anaeróbico
14,50
EF
Pimienta semilla hidrolato
14,50
EF
Canela corteza hidrolato
16,00
F
Canela hoja F. aeróbico
21,50
G
Testigo quimico Ziram
22,00
G
Clavo flor hidrolato
22,50
G
Canela hoja hidrolato
22,50
G
*Medias con la misma letra no son estadísticamente diferentes
Anexo 19. Análisis de varianza de productos de síntesis química sobre el
crecimiento de M. roreri mediante el Método de Disco de papel KirbyBauer.
FV
GL
SC
CM
F
P>F
Tratamiento
11
667,063
60,642
55,621
0,0001
Error
36
39,250
1,090
47
706,313
Total
Coeficiente de variación 0,056194
152
Anexo 20. Comparación de medias por la Prueba de Rango múltiple de Tukey
(P<0.05) para productos de síntesis química evaluados sobre la
producción de conidias de M. roreri mediante el Método de discos de
papel Kirby-Bauer.
Diámetro de
inhibición
(mm)
Tukey*
Ranman 20 µL
0,00
A
Ranman 50 µL
0,00
A
Eco 720 20 µL
3,00
B
Eco 720 50 µL
4,50
BC
Barrida 20 µL
5,00
BCD
Tamis 20 µL
5,25
BCD
Tamis 50 µL
6,00
CD
Ridomil 20 µL
6,00
CD
Barrida 50 µL
7,25
D
Ridomil 50 µL
7,25
D
Ziram 20 µL
10,00
E
Ziram 50 µL
14,00
F
PRODUCTOS DE SINTESIS QUIMICA
*Medias con la misma letra no son estadísticamente diferentes
Anexo 21. Análisis de varianza del efecto de extractos vegetales sobre el
crecimiento de M. roreri mediante el método de Disco de papel KirbyBauer.
FV
GL
SC
CM
F
P>F
Tratamiento
36
2310,703
64,186
1017,810
0,0001
Error
111
7,000
0,063
Total
147
2317,703
Coeficiente de variación 0,003412
153
Anexo 22. Comparación de medias por la Prueba de Rango múltiple de Tukey
(P<0.05) de extractos vegetales sobre el crecimiento de M. roreri mediante
el Método de discos de papel Kirby-Bauer modificado.
EXTRACTO
Orégano hidrolato
Orégano presurizado
Orégano F. Aeróbico
Orégano F. Anaeróbico
Maguey hidrolato
Maguey presurizado
Maguey F. Aeróbico
Maguey F. Anaeróbico
Jengibre hidrolato
Jengibre presurizado
Jengibre F. Aeróbico
Jengibre F. Anaeróbico
Clavo hoja hidrolato
Clavo hoja presurizado
Clavo hoja F. Aeróbico
Clavo hoja F. Anaeróbico
Canela corteza presurizado
Canela corteza F. aeróbico
Canela corteza F. anaeróbico
Pimienta hoja hidrolato
Pimienta hoja presurizado
Pimienta hoja F. aeróbico
Pimienta hoja F. anaeróbico
Pimienta semilla presurizado
Pimienta semilla F. aeróbico
Pimienta semilla F. anaeróbico
Canela hoja hidrolato
Canela hoja presurizado
Canela hoja F. aeróbico
Canela hoja F. anaeróbico
Clavo botón floral presurizado
Clavo botón floral F. anaeróbico
Clavo botón floral F. aeróbico
Pimienta semilla hidrolato
Clavo semilla hidrolato
Canela corteza hidrolato
Testigo químico ziram
DIAMETRO DE
INHIBICION (mm)
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
0,00
8,00
9,00
15,50
16,00
TUKEY*
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
B
C
D
D
*Medias con la misma letra no son estadísticamente diferentes
154
Anexo 23. Análisis de varianza (Anova), del efecto de medios con sucrosa al 2% y
con extracto de cacao en el número de conidias totales de M. roreri, de
las 12 a las 72 horas.
Conidias
Totales
Horas
FV
GL
SC
CM
F
P>F
12 horas
Tratamientos
2
1,2888721911316,660
6,444360955658330
Infin
0,344
Error
9
0
0
Total
11
1.2888722
Tratamientos
2
1,33380546875000000
6,6690273437500000
Error
9
0
0
Total
11
1.3338055
Tratamientos
2
2,04927526041666600
1,02463763020833300
Error
9
0
0
Total
11
2.0492753
Tratamientos
2
1,23650338541666600
6,1825169270833300
Error
9
0
0
Total
11
1.2365064
0,063
Coeficiente de variación 0
24 horas
Infin
0,0001
Infin
0,0001
Infin
0,0001
Coeficiente de variación 0
48 horas
Coeficiente de variación 0
72 horas
Coeficiente de variación 0
155
Anexo 24. Análisis de varianza (Anova), del efecto medios con sucrosa al 2% y
con extracto de cacao en el número de conidias germinadas de M. roreri,
de las 12 a las 72 horas.
Conidias
Germinadas
Horas
FV
GL
SC
CM
F
P>F
12 horas
Tratamientos
2
398988635417
199494317708
1,065
0,0001
Error
9
16862,500061
1873,6111179
Total
11
398988652279
1,073
0,001
1,065
0,001
6,974
0,0001
Coeficiente de variación 0,006703
24 horas
Tratamientos
2
456744791667
Error
9
19149,999954
Total
11
456744810817
228372395833
2127,7777727
Coeficiente de variación 0,009564
48 horas
Tratamientos
2
355104166667
177552083333
Error
9
1500,0000975
166,6666775
Total
11
355104168167
Coeficiente de variación 0,001231
72 horas
Tratamientos
2
395182291667
197591145833
Error
9
2550,0002502
283,33336114
Total
11
395182294217
Coeficiente de variación 0,000868
156
Anexo 25. Análisis de varianza (Anova), del efecto de los hidrolatos de canela,
clavo y pimienta en el número de conidias totales de M. roreri, de las 12 a
las 96 horas.
Conidias
Totales
Horas
FV
GL
SC
CM
F
P>F
12 horas
Tratamientos
5
1,4372767
287455347222
11826,7
0,001
Error
12
291666666,67
24305555,556
Total
17
1,4375684
1151,42
0,001
24406,6
0,001
18191,6
0,001
5916,8
0,001
C. V.
0.601126
24 horas
Tratamientos
5
1,5812042
316240833333
Error
12
3295833333,3
274652777,78
Total
17
1,5845
C. V.
2.232007
48 horas
Tratamientos
5
1,8823825610
376653124994
Error
12
185189259,33
15432438,278
Total
17
1,8834508
C. V.
0.614838
72 horas
Tratamientos
5
1,8317903
366358055556
Error
12
241666666,67
20138888,889
Total
17
1,8320319
C. V.
0.771145
96 horas
Tratamientos
5
1,6112995639
322259912792
Error
12
653587962962962
54465663580246,9
Total
17
1,676658360
C. V.
0.976612
157
Anexo 26. Comparación de medias por la prueba de Rango múltiple de Tukey del
efecto de tratamientos de los hidrolatos de clavo, canela y pimienta sobre
la cantidad de conidias de M. roreri.
Tratamiento
Clavo
semilla
Hidrolato
Pimienta
semilla
Hidrolato
Canela
corteza
Hidrolato
Testigo
químico
Polisulfuro
de calcio
Testigo
absoluto
12 horas
Conidias/m
L x106
Tukey*
24 horas
Conidias/mL x106
Tukey*
48 horas
Conidias/mL
x106
Tukey*
72
horas
Conidias/mL
x106
Tukey*
96
horas
Conidias/m
L x106
Tuk
ey*
112,08
B
106,66
B
110,27
A
79,16
B
78,19
B
52,90
E
56,27
D
41,89
D
36,59
D
34,84
E
50,16
F
40,94
E
24,27
F
25,32
F
11,89
F
114,44
A
84,58
C
70,13
C
64,16
C
75,69
C
59,44
D
42,50
E
36,94
E
29,16
E
39,86
D
104,16
C
115,69
A
100,0
B
115,13
A
98,88
A
*Medias con la misma letra no son estadísticamente diferentes
Anexo 27. Análisis de varianza (Anova), del efecto de los hidrolatos de canela,
clavo y pimienta en el número de conidias germinadas de M. roreri, de las
12 a las 96 horas.
Conidias
germinadas
Horas
12 horas
C. V.
24 horas
C. V.
48 horas
C. V.
72 horas
C. V.
96 horas
C. V.
FV
GL
SC
CM
F
P>F
Tratamientos
Error
Total
1,537189
Tratamientos
Error
Total
1,337491
Tratamientos
Error
Total
1,912436
Tratamientos
Error
Total
4,537204
Tratamientos
Error
Total
4,34516
5
12
17
390483333333
104166666,67
390587500000
78096666667
8680555,5556
8996,74
0,001
5
12
17
940062500000
100000000
940162500000
188012500000
8333333,3333
22561,5
0,001
5
12
17
505406448303
104625926
505511074229
101081289661
8718827,1667
11593,5
0,001
5
12
17
102737500000
175000000
102912500000
20547500000
14583333,333
1408,97
0,001
5
12
17
1500730735769676
356481481
153637888391
30014614715
29706790,1234
1010,36
0,001
158
Anexo 28. Comparación de medias por la prueba de Rango múltiple de Tukey del
efecto de tratamientos de los hidrolatos de clavo, canela y pimienta sobre
la cantidad de conidias germinadas de M. roreri.
Tratamiento
Clavo semilla
Hidrolato
Pimienta
semilla
Hidrolato
Canela corteza
Hidrolato
Testigo
químico
Polisulfuro de
calcio
Testigo
absoluto
12
horas
Conidia
s/mL
6
x10
Tukey*
24 horas
Conidias/
mL x106
Tukey*
48 horas
Conidias/mL
x106
Tukey*
72
horas
Conidias/
6
mL x10
Tukey*
96
horas
Conidias/
6
mL x10
Tukey*
9,02
D
7,36
D
8,05
D
5,97
C
2,91
C
9,13
D
15,25
C
12,23
C
10,25
B
10,65
B
28,96
B
31,28
B
17,45
B
5,91
C
1,98
C
19,44
C
5,83
E
3,33
E
1,66
E
0,83
C
3,19
E
0,41
F
1,38
F
1,94
D
1,80
C
46,52
A
68,19
A
50,83
A
24,30
A
26,52
A
*Medias con la misma letra no son estadísticamente diferentes
Anexo 29. Análisis de varianza (Anova), del Porcentaje de incidencia de M. roreri
del efecto de la aspersión de hidrolatos de canela, clavo y pimienta en
frutos de cacao inoculados.
FV
Tratamiento
Error
Total
GL
SC
CM
F
P>F
9
23,810
2,646
7,366
0,0001
90
32,323
0,359
99
56,133
Anexo 30. Comparación de medias por la prueba de Rango múltiple de Tukey del
Porcentaje de Incidencia de M. roreri en frutos de cacao asperjados con
hidrolatos de clavo, canela y pimienta.
Tratamiento
Testigo inoculado
N
10
% Incidencia
100
Tukey*
Pimienta semilla Hidrolato Después
10
75
AB
Canela Hidrolato Después
10
50
ABC
Clavo flor Hidrolato Después
10
44,44
BC
Clavo flor Hidrolato Antes
10
42,86
BC
Canela Hidrolato Antes
10
28,57
BC
Pimienta semilla Hidrolato Antes
10
25
BC
Polisulfuro de calcio Antes
10
0
C
Polisulfuro de calcio Después
10
0
C
Testigo sin inocular
10
0
C
A
159
Anexo 31. Análisis de varianza (Anova), del Índice de Severidad Externa (ISE) del
efecto de los hidrolatos de canela, clavo y pimienta en frutos de cacao
inoculados con M. roreri.
FV
GL
SC
CM
F
P>F
Tratamiento
9
1.902
0.211
3.204
0,0001
Error
90
5.937
0.066
Total
99
7.840
C.V. 31.22715
Anexo 32. Análisis de varianza (Anova), del Índice de Severidad Interna (ISI) del
efecto de los hidrolatos de canela, clavo y pimienta en frutos de cacao
inoculados con M. roreri.
FV
GL
SC
CM
F
P>F
Tratamiento
9
5.549
0.617
7.822
0,0001
Error
90
7.094
0.079
Total
99
12.643
C.V. 31.48399
Anexo 33. Porcentaje de mazorcas afectadas con M. roreri por tratamiento y sus
índices de severidad interna (ISI) y externa (ISE) después de 60 días de
la inoculación artificial con 9 x 104 conidias*mL-1. Tapachula, Chiapas –
México.
TRATAMIENTO
Clavo hidrolato Aplicado Antes de
inoculación
Canela hidrolato Aplicado Antes de
inoculación
Pimienta hidrolato Aplicado Antes de
inoculación
Polisulfuro de calcio Aplicado Antes de
inoculación
Clavo hidrolato Aplicado Después
inoculación
Canela hidrolato Aplicado Después
inoculación
Pimienta hidrolato Aplicado Después
inoculación
Polisulfuro de calcio Aplicado Después
inoculación
Testigo sin inocular
Testigo inoculado
INDICE
la
la
la
la
la
la
la
la
ISI
ISE
ISI
ISE
ISI
ISE
ISI
ISE
ISI
ISE
ISI
ISE
ISI
ISE
ISI
ISE
ISI
ISE
ISI
ISE
0
57,14
71,73
71,42
85,72
75
75
100
100
55,55
77,77
66,7
83,4
25
100
100
100
100
100
0
0
PORCENTAJE DE MAZORCAS
Grados de la escala
1
2
3
4
28,57
0
0 14,28
0
0 28,57
0
0 28,57
0
0
0
0 14,28
0
25
0
0
0
25
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
22,22
0 11,11
0
11,11
0
0
0
0
0 16,66 16,66
0
0 16,66
0
50
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
37,5
12,5
25
25
87,5
12,5
0
0
5
0
0
0
0
0
0
0
0
11,11
11,11
0
0
25
0
0
0
0
0
0
0
160
Anexo 34. Análisis de varianza (Anova), del efecto de los hidrolatos de canela,
clavo y pimienta en la incidencia de M. roreri, en una plantación de cacao.
VARIABLE
Incidencia Total
C. V.
Incidencia Chilillos
C. V.
Incidencia Mazorcas
C.V.
FV
Tratamiento
Error
Total
0.561083
Tratamiento
Error
Total
1.135432
Tratamiento
Error
Total
0.476864
GL
5
24
29
SC
3.33237200
0.00120193
3.33357392
CM
0.66647440
0.00005008
F
13308.1
P>F
0,0001
5
24
29
0.82589020
0.00645271
0.83234291
0.16517804
0.00026886
614.36
0,0001
5
24
29
2.07973912
0.00093531
2.08067443
0.41594782
0.00003897
10673.2
0,0001
Anexo 35. Análisis de varianza (Anova), del efecto en la producción de cacao seco
de la aplicación de hidrolatos de canela, clavo y pimienta para el manejo
de M. roreri, en una plantación comercial.
FV
Tratamiento
Error
Total
GL
5
24
29
SC
8013637,039
4754,588
8018391,627
CM
1602727,408
198,108
F
8090,18
P>F
0,0001
C. V. 1,404712
161
Anexo 36. Análisis de sensibilidad de los tratamientos para diferentes niveles de
rendimiento de cacao.
Producción
Tratamiento
Hidrolato
canela
Hidrolato
clavo
Hidrolato
pimienta
Testigo
polisulfuro de
calcio
Testigo
cultural
Testigo
absoluto
Muy baja
Baja
Media
Media alta
Alta
Muy Alta
Muy baja
Baja
Media
Media alta
Alta
Muy Alta
Muy baja
Baja
Media
Media alta
Alta
Muy Alta
Muy baja
Baja
Media
Media alta
Alta
Muy Alta
Muy baja
Baja
Media
Media alta
Alta
Muy Alta
Muy baja
Baja
Media
Media alta
Alta
Muy Alta
Nivel
kg/ha/año
400
500
700
1000
1500
3750
400
500
700
1000
1500
3750
400
500
700
1000
1500
3750
400
500
700
1000
1500
3750
400
500
700
1000
1500
3750
400
500
700
1000
1500
3750
Total
costos
USD
1643,75
1643,75
1887,50
1887,50
1887,50
2862,50
1293,75
1293,75
1537,50
1537,50
1537,50
2512,50
1643,75
1643,75
1887,50
1887,50
1887,50
2862,50
1093,75
1093,75
1337,50
1337,50
1337,50
2312,50
868,75
868,75
1112,50
1112,50
1112,50
2087,50
543,75
543,75
787,50
787,50
787,50
1762,50
Total
Ingresos
USD
1875,00
2343,75
3281,25
4687,50
7031,25
17578,13
1875,00
2343,75
3281,25
4687,50
7031,25
17578,13
1875,00
2343,75
3281,25
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17578,13
B/C
VPN
RENTABILIDAD
%
1,14
1,43
1,74
2,48
3,73
6,14
1,45
1,81
2,13
3,05
4,57
7,00
1,14
1,43
1,74
2,48
3,73
6,14
1,71
2,14
2,45
3,50
5,26
7,60
2,16
2,70
2,95
4,21
6,32
8,42
3,45
4,31
4,17
5,95
8,93
9,97
231,25
700,00
1393,75
2800,00
5143,75
14715,63
581,25
1050,00
1743,75
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5493,75
15065,63
231,25
700,00
1393,75
2800,00
5143,75
14715,63
781,25
1250,00
1943,75
3350,00
5693,75
15265,63
1006,25
1475,00
2168,75
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15490,63
1331,25
1800,00
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14,07
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148,34
272,52
514,08
44,93
81,16
113,41
204,88
357,32
599,63
14,07
42,59
73,84
148,34
272,52
514,08
71,43
114,29
145,33
250,47
425,70
660,14
115,83
169,78
194,94
321,35
532,02
742,07
244,83
331,03
316,67
495,24
792,86
897,34
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