学生実習 （生物化学実験 I 、 II、実験法：必修） 第3学年：月曜日〜金曜日の午後 【生物化学実験 I】 （Sセメスター） ◎ 分子生物学実験への入門： 遺伝子DNAの取り扱いの基礎 大腸菌の培養、大腸菌染色体やプラスミドのDNA調製、 制限酵素反応、薬剤耐性遺伝子のクローニング、など ◎ 生化学実験への入門： タンパク質化学の実験 タンパク質の定量、酵素反応速度論、単離精製、結晶化 電気泳動、一次構造の分析、など 【生物化学実験 II】 （Aセメスター） ◎ 生化学的な実験： X線結晶構造解析と分子設計、機器分析など ◎ 分子生物学的な実験： 細菌遺伝学、 線虫・マウス・ ゼブラフィッシュなどのモデル生物を用いた分子生物学 【生物化学実験法】 （Sセメスター月曜日） ◎実験の手技の解説、PC演習 えると沈殿を除きやすくなる．）＊沈殿はまとめてオートクレーブした後に廃棄する． 6 倍量（約 12 mL）のイソプロピルアルコールを加え，よく混ぜ，室温で 20 分間放置する． 3年Sセメスター 生物化学実験（学生実習） I 000 rpm で 20 分間遠心（室温）し，上清を捨てて沈殿に 20 mL の 70%エタノールを加え ． 1. 基本操作 ピペットの操作法、カラム管の作成 000 rpm で 10 分間遠心（室温）し，上清を捨てて沈殿を風乾させる． 殿を 2.2 mL の TE に懸濁したのち，2.5g の塩化セシウムを加え，よく混和する。 2. 遺伝子DNAの取り扱いの基礎 の 10 mg/mL 臭化エチジウム溶液を加え，よく混和する． µL プラスミド分離 超遠心によるDNAの精製 チューブへ移す．沈殿は医療用 制限酵素反応 棄物として捨てる． カナマイシン耐性遺伝子の単離 ベクターとの結合 要があれば、 12)と等濃度の塩化 大腸菌への形質転換 シウムが溶けた TE を加えてチ 000 rpm で遠心（室温）し、パスツールピペットを用いて泡を入れないように上清を超遠 ーブを満たし、泡の混入に注意 ながら蓋をする（図 2-4）． 遠心機で， 100,000 rpm で 4 時 図 2-4 3年Sセメスター 生物化学実験（学生実習） I 2) ３章 十分に静置してゲルと上清とを分離させる（約 20 mL ずつに分離する）．下層のゲルを 捨てないように上清をピペットで丁寧に除いた後，ゲルと同体積の緩衝液 A を加えて良 く攪拌する． この操作を 2 回繰 ② ③ ④ ⑤ 3. 蛋白質酵素の取り扱いの基礎 り返す． 3) 同時に図 3-2 の 図 3-2 未知試料の蛋白質定量 酵素反応速度の測定 イオン交換クロマトグラフィー 精製したリゾチームの活性測定と結晶化 ３章 高濃度の 溶液にする SDSゲル電気泳動 沈殿剤（塩，PEG，有機溶媒等）を加え過飽和にする ウェスタンブロッティングによるタンパク質検出 小さな粒子が形成され結晶の核になる エドマン法によるアミノ酸配列の決定 結晶が成長する 薄層クロマトグラフィー ようにカラムを組 み立てる．カラムの 洗浄を兼ねて緩衝 液 A をチューブ(a) にセットし，コック ①および②を開い て流し，きちんと流 れるかを確認する． 4) コック①を閉めてからカラムの蓋を開け，CM-Sephadex の混濁液の全量をカラム (φ25 mm) に充填する．蓋を閉め，十分静置してカラムを沈殿させる． 5) 緩衝液 A をチューブ(a)にセットし，コック①を開いて緩衝液 A をカラムに流し，カラム ベッドを落ち着かせる．このとき，流速が 1～1.5 mL/min となるようにコック②を調節 する． iii) イオン交換カラムクロマトグラフィ 1) 試料をチューブ(a)にセットして全量を流す． 2) 続けて緩衝液 A をチューブ(a)から流す．約 50 mL ごとにチューブ(b)より流れ出た液体を 少量分収し，OD280 を測定する．OD280 が 0.1 以下になるまで続ける(100～200 mL)． 3) 緩衝液 A を流しつつ， チューブ(b)をフラクションコレクターにセットして試運転を行う． 1 フラクションがおよそ 5 mL になるようにフラクション切り替え時間を設定する． ※ フラクション切り替え時間を無限大にセットしてから，フラクション用試験管に 5 mL の水を入れたものを隣に並べ，5 mL 流出するのに掛かる時間を測定する．その 後フラクション切り替え時間を測定した時間にセットする．コック①を一旦閉め， フラクションコレクターをリセットしてから次の操作へ進む． 4) カラム体積の 3 倍の緩衝液 B (120 mL)を入れたビーカーをチューブ(a)にセットし，コッ 3年Sセメスター 生物化学実験（学生実習） I 4. マイクロアレイ実習 -RNA抽出 -cDNA合成、蛍光ラベル - ハイブリダイゼーション -スキャニング、数値化、データ解析 5. プロテオミクス実習 -細胞抽出液調製、精製、ゲル電気泳動 -バンド切り出し、プロテアーゼ消化 -ペプチドの回収・処理、スポッティング -質量分析（MALDI-TOF-MS） -データ解析 Voyager Spec #1[BP = 568.3, 16561] 568.2620 100 1.7E+4 927.6790 90 960.7508 80 70 % In ten sity 60 673.5215 50 842.6807 650.1847 515.4487 40 524.2633 644.1659 1640.2349 1149.8362 1912.2759 30 20 606.2094 550.2485 572.4241 682.1410 508.3710 1226.8309 855.2230 1017.7285 861.2414 887.1780 1138.7194 1371.8213 1552.8847 10 0 503.0 980.8 2088.2200 1535.8632 1716.1100 1458.6 1936.4 Mass (m/z) 2414.2 0 2892.0 3年Sセメスター 生物化学実験（学生実習） I 6. シークエンス実習 -ゲノムDNAからショットガンライブラリーの作成 -シークエンス反応、シークエンサーの稼働 -データのコンピュータ処理 -新型シークエンサーの操作と見学 例：分子間相互作用 7. シミュレーション実習 ① 微分方程式モデルの作製・解析 ・基本的な生化学反応を微分方程式に書き下す練習 ・作製した微分方程式モデルの解析 ②システム特性の解析 ・生化学反応の周波数特性 ・生命現象の解析 （神経活動電位、 ポジティブフィードバック） kf [ A] [B] [ AB] kb 生化学反応式 Cm dV gK n 4 (Ek V ) gNa m3h(ENa V ) g l (El V ) I dt 神経細胞の発火モデル （Hodgkin-Huxleyモデル）
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