Wako 遺伝子変異検出キットシリーズ A3二つ折り 〈表・裏面〉 KRAS遺伝子の点変異検出実験 簡便・迅速・正確・安価に遺伝子変異を検出!! 実験条件に示すサンプルとその他コントロールDNAを用いて、KRAS遺伝子のコドン12および13のグリシンにおけ る点変異を検出しました。 遺伝子変異検出キットシリーズ LH Gene Mutation Detection Kit series D N A マ 野 ー 生 型 カー コ G1 ント 2D ロ ー サ コン ル DN ト ン ロ プ A ー ル ル サ 1（ D ン プ 野 NA サ ル 2 生型 ン ） プ （G サ ル 3 12 S ン ） プ （G サ ル 4 12 D ン ） プ （G サ ル 5 12 V ン ） プ （G サ ル 6 12 A ン ） プ （G ル 1 7（ 2C ） G 1 3 D ） 【結果】 ● 変異型サンプル （サンプル 2-7）のバンドシフトを高感度で検出!! ● G12D以外の変異も同じLH Probeで検出!! 抗がん剤セツキシマブは、 KRAS遺伝子 に変異のない野生型患者に効果が高いこ とが臨床試験で明らかになっており、厚生 労働省は2010年3月23日付に発出した通知で、 KRAS 遺伝子変異の有無を考慮して投与することを追記するよ 400→ 野生型 G12D 300→ G12S, G12V, G12A, G12C, G13D 250→ 対象遺伝子（BRAF、EGFR、KRAS） における点変異、挿入変異、欠損変異を簡便、迅速、正確、安価に検出できます。 Loop Hybrid Mobility Shift Assay（LH-MSA法）を基本原理とし、変異遺伝子領域にハイブリダイズする Loop Hybrid Probe（LH Probe）の二次構造変化をポリアクリルアミドゲル電気泳動で検出します。 LH-MSA法は、高価なリアルタイムPCR装置及び特異的プローブなどの特別な設備・機器を必要としません。 う指導しました。 大腸がん患者の約30%にKRAS遺伝子変異があり、 KRAS遺伝子に変異がある大腸がん患者のゲノムDNA は中メチル化状態であることから、 メチル化の蓄積と遺伝 子変異の研究が数多く報告されています。 <実験条件> ● サンプル 1-7：ヒ ト大腸がん組織凍結切片由来ゲノムDNA ● 電気泳動ゲル：SuperSepTMAce, 10%, 17well （推奨品） 〔定電流、 20mA〕 ● 泳動時間：70分 （目安） ● 染色：Gel RedTM 核酸ゲル染色液 （x10000） 水溶液 KRAS遺伝子 PCR増幅産物 : 165 bp 200→ 175→ ■特長 ● リアルタイムPCR法に比べて非常に安価!! ■キット構成（96サンプル用：16サンプル×6回用） 1. 2. 3. 4. 10×Buffer dNTPs DNA Polymerase Forward Primer ＊1 102μL×1本 102μL×1本 12μL×1本 51μL×1本 5. 6. 7. 8. Reverse Primer ＊1 LH Probe Wild Type Control DNA 各Control DNA ＊2 180μL×1本 96μL×1本 6μL×1本 6μL×1本 ■検出原理 9. Loading Buffer ＊3 10. DNA Marker 288μL×1本 9μL×1本 特殊な設備・機器が不要!! 操作が簡便、作業時間・手間が低減!! ● 1プローブで稀な変異も検出可能!! ● 非常に高感度!! ● プライマー ● LHプローブ ステップ① PCR増幅反応 容量 希望納入価格（円） SuperSepTMAce, 10%, 17well 10枚 14,000 196-14981 SuperSepTMAce, 12.5%, 17well 519-20301 517-53333 GelRedTM Nucleic Acid Gel Stain, 10,000x in Water GelGreenTM Nucleic Acid Gel Stain, 10,000x in Water 10枚 0.5mL 14,000 23,200 0.5mL 28,000 201-18601 316-90101 058-07681 10×Tris-Glycine Buffer Distilled Water, Deionized, Sterile EasySeparator 1L 100mL 1セット 7,200 4,000 295-52401 DNA Isolator PS Kit EtBr Destroyer Bag 100テスト 20個 25,000 303-89321 25,400 冷暗所 300-89331 EtBr Destroyer Sprayer 200mL×2 13,000 冷暗所 …−20℃保存 …特定毒物 …化審法 第一種特定化学物質 …毒物 Reagent …劇物 …毒薬 …劇薬 …危険物 …化学兵器禁止法 第一種指定物質 …向精神薬 LH Probe 5’ 3’ - -3’ -5’ -3’ -5’ 野生型 Genomic DNA -3’ -5’ PCR 点変異 94℃, 2 min 68℃, 5 min 5’ 3’ - -3’ -5’ PCR 増幅産物 （Target gene） PAGE, Detection ステップ③ LH-MSA by PAGE 5’ 3’ - …カルタヘナ法 覚せい剤取締法…「覚せい剤原料研究者又は取扱者」の免許を取得して、 ご購入に際しては、 譲受証及び譲渡証による受け渡しが必要となります。 国民保護法…生物・毒素兵器の製造、 使用防止のため、 「毒素等」 を試験研究用に使用することを確認する証を頂戴しております。 ダイオキシン類…特に法的な規制はございませんが、 取扱いに際し特に厳重を要するため、 「ダイオキシン類」 を試験研究用に使用することを確認する証を頂戴しております。 上記以外の法律及び最新情報は、siyaku.com（http://www.siyaku.com/）をご参照ください。 -3’ -5’ ポリアクリルアミド電気泳動 Tissue ステップ② LH反応 …特定麻薬向精神薬原料 …化学兵器禁止法 第二種指定物質 Cells 5’ 3’ - 52,000 5’ 3’ - LH反応 稀な変異 PCR Mixture …−80℃保存 表示が無い場合は室温保存です。 …化審法 第二種特定化学物質 WT : 野生型 5’ 3’ - 192-14961 …2∼10℃保存 BRAF（V600E変異あり） ②：稀な変異 ■関連製品 品名 -5’ PCR ①：点変異 DNA Polymerase コードNo. -3’ 3’ - DNAポリメラーゼ ■操作概要 ＊1 Exon21 L858R用は、Forward Primer 180μL、Reverse Primer 51μL ＊2 BRAF V600E : V600E コントロール DNA、EGFR Exon19 : 欠損型コントロール DNA、 EGFR Exon20 : 挿入型コントロール DNA EGFR Exon21: L858R コントロール DNA、KRAS Mutations : G12D コントロール DNA ＊3 内容は6X濃度です。また、青色とオレンジ色の色素が入っています。 5’ - ゲノムDNA マ ー カ ー コン トロ ー ル DN コン A（ トロ W T） ー ル DN サ A（ ン プ ① ル ） 1（ サ W ン T ） プ ル 2（ サ ① ン ） プ ル 3（ ② ） 500→ DN A （bp） Contribute to the future of science -3’ -5’ 染色結果 （イメージ図） ■ラインアップ ● 本文に記載されております試薬は、試験、研究の目的のみに使用されるもので、 「医療品」、 「食品」、 「生活用品」などとして使用できません。 ● 希望納入価格には消費税等が含まれておりません。 ● 記載希望納入価格は2015 年 05 月現在の価格です。 ● 最新情報は、siyaku.com（ http://www.siyaku.com/ ）をご参照下さい。 本キットは、研究用試薬です。試験、研究の目的のみに使用されるもので、 「 体外診断用医薬品」、 「食品」、 「生活用品」など として使用できません。 コードNo. 299-76101 291-76301 容量 希望納入価格 （円） LH遺伝子変異検出キット（BRAF V600E用） LH遺伝子変異検出キット（EGFR Exon19 Deletion用） 品名 1キット（16サンプル×6回用） 65,000 1キット（16サンプル×6回用） 65,000 293-76501 LH遺伝子変異検出キット（EGFR Exon20 Insertion用） 1キット（16サンプル×6回用） 65,000 295-76701 LH遺伝子変異検出キット（EGFR Exon21 L858R用） 1キット（16サンプル×6回用） 65,000 297-76901 LH遺伝子変異検出キット（KRAS Mutations at Codons 12 and 13用） 1キット（16サンプル×6回用） 65,000 次の科学のチカラでありたい。 15503開01Tp Wako 遺伝子変異検出キットシリーズ A3二つ折り 〈中面〉 ■実験例 ‒ 電気泳動 ヒト大腸がん組織の凍結切片またはヒト肺がん組織ホルムアミド・パラフィン包埋切片より抽出したゲノムDNAとその他 コントロールDNAを用いて、対象遺伝子（BRAF、 EGFR、 KRAS）における遺伝子変異を検出しました。 本実験データは、神奈川県立がんセンター臨床研究所 がん分子病態学部 松隈章一先生より提供していただきました。 EGFR遺伝子のExon20挿入変異検出実験 実験条件に示すサンプルとその他コントロールDNAを用いて、EGFR遺伝子Exon20における挿入変異を検出しま した。 【結果】 ● 最も品質が悪いとされるFFPE切片から抽出したゲノムDNAでも変異型サンプルのバンドシフトを高感度で検出!! D N A （bp） 抗がん剤ゼルボラフは、 BRAF遺伝 す。2011年8月、米国食品医薬品局 （FDA）により、 れています。 400→ D594G 野生型 V600E 300→ 大腸がんの約10%にBRAF遺伝子があり、 BRAF 高メチル化状態であることから、 メチル化の蓄積と遺 <実験条件> ● サンプル 1-7：ヒ ト大腸がん組織凍結切片由来ゲノムDNA ● 電気泳動ゲル：SuperSepTMAce, 10%, 17well （推奨品） 〔定電流、 20mA〕 ● 泳動時間：70分 （目安） ● 染色：Gel RedTM 核酸ゲル染色液 （x10000） 水溶液 BRAF遺伝子 PCR増幅産物 : 157 bp 200→ 175→ 150→ Factor Receptor;EGFR） のチロシンキナーゼの働きを阻害する作用を 標的治療薬として2002年7月に世界に先駆 A 野 N （bp） 持ち、非小細胞肺癌 （NSCLC）に対する分子 けて日本で承認されました。しかし本薬剤に よる間質性肺炎の発生が副作用として大きな 問題となっています。ゲフィチニブにおいては、 500→ EGFRのチロシンキナーゼ活性部位に遺伝子 400→ 変異があれば効果があることが確認されてお 遺伝子に変異がある大腸がん患者のゲノムDNAは 伝子変異の研究が数多く報告されています。 250→ 受容体（Epidermal Growth BRAF V600E遺伝子変異があり、切除不能または 転移性メラノーマである場合の治療薬として承認さ 500→ ゲフィチニブは上皮成長因子 マ 子に変異のある患者に効果が高いこ とが臨床試験で明らかになっていま D マ ー 野 カ 生 ー 型 コ ン V6 ト 00 ロ ー E ル コ サ ント D ン N ロ プ A ー ル ル サ 1（ D ン NA 野 プ 生 ル サ 2（ 型） ン 野 プ 生 ル 型 C 3 O （ ） LO 野 生 -2 型 サ 0 ） 5（ ン プ V ル 6 4（ 00 サ ン E） V6 プ ル 0 5（ 0E サ ン V6 ） プ ル 0 6（ 0E サ ） ン V プ 60 ル 7（ 0E ） D 59 4G ） 【結果】 ● BRAF V600E変異細胞株 （COLO 205） と同じ位置に変異型サンプル （サンプル 4∼6） のバンドを高感度で検出!! ● D594G （サンプル 7） という稀な変異も同じLH Probeで検出!! ー カ ー 型 コ 挿 ン ト 入 ロ 型 ー コ ル サ ン ト ン D ロ プ N ー ル A ル サ 1（ ン D プ 野 N ル A 生 サ 2（ 型 ン ） プ 挿 ル 入 サ 型 3 ン （ ） プ 挿 ル 入 サ 4（ 型 ン ） プ 挿 ル 入 サ 5（ 型 ン ） プ 挿 ル 入 サ 6（ 型 ン ） プ 挿 ル 入 7（ 型 ） 挿 入 型 ） 実験条件に示すサンプルとその他コントロールDNAを用いて、BRAF遺伝子コドン600における点変異を検出しま した。 生 BRAF遺伝子の点変異検出実験 り、 その検査が重要となっています。 NSCLCの 約5% のEGFR遺伝子Exon20 300→ に挿入変異があると報告されています。 挿入型 250→ <実験条件> サンプル 1-7：ヒト肺がん組織ホルムアミド・パラフィン包埋切片由来ゲノムDNA ● 電気泳動ゲル：SuperSepTMAce, 10%, 17well （推奨品） 〔定電流、20mA〕 ● 泳動時間：70分 （目安） ● 染色：Gel RedTM 核酸ゲル染色液 （x10000） 水溶液 EGFR遺伝子Exon20 PCR増幅産物: 189 bp ● 200→ 175→ 図: 点変異検出実験電気泳動結果 図: 挿入変異検出実験電気泳動結果 EGFR遺伝子のExon19欠損変異検出実験 EGFR遺伝子のExon21点変異検出実験 実験条件に示すサンプルとその他コントロールDNAを用いて、EGFR遺伝子Exon19のコドン746から750におけ る欠損変異を検出しました。 実験条件に示すサンプルとその他コントロールDNAを用いて、EGFR遺伝子Exon21のL858R点変異を検出しま した。 D N A （bp） ゲフィチニブは上皮成長因子受容 体（Epidermal Growth Factor （bp） N ナーゼの働きを阻害する作用を持ち、 非小細胞肺癌 （NSCLC）に対する分子標的治療薬として2002 A Receptor;EGFR）の チ ロ シ ン キ マ ー 野 カ 生 ー 型 コ ン L8 ト 58 ロ ー R ル コ ント サ D ン N ロ プ A ー ル ル 1（ D サ N ン A 野 プ 生 ル 型 2（ サ ） ン L8 プ ル 5 8 3（ サ R ン ） L8 プ ル 5 8 4（ R ） L8 5 8 R ） 【結果】 ● 最も品質が悪いとされるFFPE切片から抽出したゲノムDNAでも変異型サンプルのバンドシフトを高感度で検出!! D マ ー 野 カ 生 ー 型 コ ン 欠 ト 損 ロ 型 ー コ ル ン サ ト D ン ロ N プ A ー ル ル サ 1（ D ン N 野 プ A 生 ル サ 2（ 型） ン 欠 プ 損 ル サ 3（ 型） ン 欠 プ 損 ル サ 4（ 型） ン 欠 プ 損 ル サ 5（ 型） ン 欠 プ 損 ル サ 6（ 型） ン 欠 プ 損 ル サ 7（ 型） ン 欠 プ 損 ル 8（ 型） 挿 入 型 ） 【結果】 ● 最も品質が悪いとされるFFPE切片＊1から抽出したゲノムDNAでも変異型サンプルのバンドシフトを高感度で検出!! ● 挿入変異 （サンプル 8） という稀な変異も同じLH Probeで検出!! ＊1 FFPE : ホルマリン固定・パラフィン包埋 挿入型 年7月に世界に先駆けて日本で承認されました。 し 400→ 欠損型 て大きな問題となっています。ゲフィチニブにおい ては、 EGFRのチロシンキナーゼ活性部位に遺伝子 変異があれば効果があることが確認されており、そ の検査が重要となっています。 ン746-750を中心とする部位に欠損変異がある 250→ と報告されています。 <実験条件> ● サンプル 1-8：ヒ ト肺がん組織ホルムアミド・パラフィン包埋切片由来ゲノムDNA ● 電気泳動ゲル：SuperSepTMAce, 10%, 17well （推奨品） 〔定電流、 20mA〕 ● 泳動時間：70分 （目安） ● 染色：Gel RedTM 核酸ゲル染色液 （x10000） 水溶液 EGFR遺伝子Exon19 PCR増幅産物 : 146 bp 200→ 175→ 150→ 125→ 図: 欠損変異検出実験電気泳動結果 細胞肺癌 （NSCLC） に対する分子標的治療薬として2002年7 間質性肺炎の発生が副作用として大きな問題となっています。ゲ L858R 500→ 野生型 400→ フィチニブにおいては、 EGFRのチロシンキナーゼ活性部位に遺 伝子変異があれば効果があることが確認されており、 その検査が 重要となっています。 NSCLCの20∼25%のEGFR遺伝子Exon21コドン858に おいてロイシンからアルギニンへの点変異があると報告されて NSCLCの20∼25%のEGFR遺伝子Exon19コド 300→ Growth Factor Receptor;EGFR）の チ ロシ ンキナーゼの働きを阻害する作用を持ち、非小 月に世界に先駆けて日本で承認されました。 しかし本薬剤による かし本薬剤による間質性肺炎の発生が副作用とし 500→ ゲフィチニブは上皮成長因子受容体（Epidermal います。 300→ 250→ <実験条件> サンプル 1-4：ヒト肺がん組織ホルムアミド・パラフィン包埋切片由来ゲノムDNA ● 電気泳動ゲル：SuperSepTMAce, 10%, 17well （推奨品） 〔定電流、20mA〕 ● 泳動時間：70分 （目安） ● 染色：Gel RedTM 核酸ゲル染色液 （x10000） 水溶液 EGFR遺伝子Exon21 PCR増幅産物: 184 bp ● 200→ 175→ 図: 点変異検出実験電気泳動結果
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