10 号（10 月）2014〕トピックス 535 VTC2 の転写制御はアスコルビン酸生合成の明/ 暗調節に必須である ∼複雑なアスコルビン酸生合成制御機構のマスタースイッチ∼ Transcriptional regulation of VTC2 is essential to the modulation of ascorbate biosynthesis ∼ A master switch for the complex regulatory mechanisms of ascorbate biosynthesis ∼ 周知のようにビタミン C（アスコルビン酸：AsA）は，植物における AsA 生合成制御機構の理解の遅延の大動物，植物，藻類を含めた光合成生物において，水溶きな要因は，D-Man/L-Gal 経路のいくつかの酵素遺伝性の酸化還元物質として抗酸化に機能するだけでな子の恒常的な過剰発現により，いずれも細胞内 AsA レく，補酵素や電子伝達など様々な生理作用を発揮してベルが増加すると報告されていることである 8）-10）．こいる．植物の AsA 生合成経路に関する研究は，モデルれは，植物の AsA 生合成経路には特定の律速段階が存植物シロイヌナズナの AsA 欠乏変異体（vtc；vitamin 在しないことを意味しており，一般的な代謝経路の制 C-de¿cient mutants）の単離同定以降 1），加速度的に進御の観点からは不可解である．すなわち，上記の様な展し，今日では光合成の産物である D-フルクトースを AsA 生合成制御の複雑性を考慮すると，各酵素遺伝子もとに，D-マンノース（D-Man）および L-ガラクトースの恒常的な高発現による細胞内 AsA レベルの変化は，（L-Gal）を代謝中間体として AsA を合成する D-Man/ 実際には発芽後から実験に供するまでに，生体内で L-Gal 経路が，少なくとも葉において最も主要である様々な影響を二次的に受けた結果であり，生理的な環ことに疑いはない．境を反映したものではないと予想される．植物は AsA を豊富に含んでおり，そのレベルは細胞そこで筆者らは，植物の AsA 生合成の真の律速段階壁やデンプンを除いた可溶性糖質の中で最大約 10％にを特定するために，D-Man/L-Gal 経路構成酵素の中で，も達する．したがって，AsA 自身の必要レベルを満た転写レベルで光応答性を示す PMI1，VTC1，VTC2，すだけでなく，炭素代謝や炭素分配を正常に維持するおよび VTC4 に加え，AsA と細胞壁や糖修飾などへのためにも，AsA 生合成は厳密に制御する必要がある．炭素分配の鍵段階を触媒する GME の一過的な誘導発事実，細胞内 AsA レベルは光合成と密接に関わること現が細胞内 AsA レベルに及ぼす影響を検討した 11）．が知られている．すなわち，葉中 AsA レベルは明条件本研究では，植物の代謝には何ら影響しないエストロ 2）下で増加し，暗所下で減少する．光合成との関連は，ゲン（ES）を用いた一過的誘導発現系を使用した 12）．光合成電子伝達阻害剤 DCMU 処理により，光による ES 誘導性プロモーター下流に上記遺伝子を連結した AsA レベルの増加が抑制される事実からも支持されてコンストラクトを形質転換したシロイヌナズナを播種いる 3）．現在までに，この様な光応答を含め，種々の後 2 週間栽培し，100μM ES をスプレーにより噴霧し条件に応答した AsA 生合成の制御機構に関して，膨大た．その結果，PMI1，VTC1，GME および VTC4 の一な報告がなされている．例えば，D-Man/L-Gal 経路の過的発現系を導入した植物の葉では，ES 処理による構成酵素であるマンノース-6-リン酸イソメラーゼそれら遺伝子の転写誘導が確認されたものの，AsA レ（PMI1），GDP-Man ピロホスホリラーゼ（VTC1）， GDP-L-Gal ホスホリラーゼ（VTC2），および L-Gal-1- ベルに有意な変化は認められなかった．一方，VTC2 導入植物の葉において，ES 処理後の VTC2 の転写レベリン酸ホスファターゼ（VTC4）の転写は光照射下で誘ルの一過的な上昇に伴って AsA レベルが 7 日後まで継 3）4）．さらに，VTC1 タン続して増加していた．同条件下において，他の AsA 生パク質は，暗条件下において 26S プロテオソームによ合成酵素遺伝子群の転写レベルに有意な変化は認めらり分解される 5）．また，PMI1，GDP-Man-3,5-エピメラーれなかった．これらのことから，VTC2 の転写レベル導され，暗所下で抑制されるゼ（GME）および L-Gal デヒドロゲナーゼ活性は，AsA がシロイヌナズナの AsA レベルに直接影響することがによりフィードバック阻害を受ける 6）7）．これらの事示された．実は，植物の AsA 生合成が多段階で複雑に制御されてそこで，AsA レベルの光応答への重要性を検討するいることを示しているが，個々の段階の重要性は不明ために，播種 2 週間後のコントロールおよび VTC2 導である．入植物を ES 処理後に恒明もしくは恒暗条件下に移行トピックス 536 した．その結果，VTC2 導入植物では恒明条件下にお〔ビタミン 88 巻 Key Words：vitamin C, plant, light regulation, D-Mannose/ ける AsA レベルの増加がコントロール植物よりも顕著 L-Galactose pathway, VTC2 に亢進し，5 日目までほぼ直線的に増加していた．このことから，VTC2 の転写制御が明条件下における 1 Department of Food and Nutritional Science, College of AsA 生合成の律速であることが示された．植物細胞内における AsA の最大蓄積レベルの理解は，AsA 生合成制御だけでなく，有用成分の蓄積レベ Bioscience and Biotechnology, Chubu University, 1200 Matsumoto-cho, Kasugai, Aichi 487-8501, Japan 2 Department of Life Sciences and Biotechnology, Faculty of ルを増加させた作物の分子育種の観点からも重要であ Life and Environmental Science, Shimane University, 1060 る．VTC2 導入植物の葉におけるホスホリラーゼ活性 Nishikawatsu, Matsue, Shimane 690-8504, Japan は ES 処理により最大約 11 倍に上昇していたが，測定 Kazuya Yoshimura1, Takahiro Ishikawa2 された AsA レベルの最大増加率は約 2.5 倍であった． 1 中部大学応用生物学部食品栄養科学科この結果は，明条件下でも必要十分量以上の炭素源の 2 島根大学生物資源科学部生命工学科 AsA 生合成への利用を避けるための，VTC2 を含む多吉村和也 1，石川孝博 2 重の制限因子の存在だけでなく，植物細胞の AsA 蓄積レベルの最大値を規定する因子の存在の可能性を示すのかもしれない．あるいは，VTC2 タンパク質は AsA 文献生合成の場となる細胞質以外にも核に局在することや，リン化修飾を受ける可能性が指摘されていることから，活性調節との関連も考えられる 13）14）．一方，恒暗条件下における AsA レベルの減少が， VTC2 導入植物では 3 日目まで有意に抑制されていたが，5 日目にはコントロール植物と同様にほぼ 0 に達した．したがって，暗所下での AsA 生合成の抑制には， VTC2 の転写制御に加え，上記のその他の酵素遺伝子 1）Conklin PL, Saracco SA, Norris SR, Last RL (2000) Identi¿cation of ascorbic acid-de¿cient Arabidopsis thaliana mutants. Genetics 154, 847-856 2）Dowdle J, Ishikawa T, Gatzek S, Rolinski S, Smirnoff N (2007) Two genes in Arabidopsis thaliana encoding GDP-L-galactose phosphorylase are required for ascorbate biosynthesis and seedling viability. Plant J 52, 673-689 3）Yabuta Y, Mieda T, Rapolu M, Nakamura A, Motoki T, Maruta T, の転写抑制や，VTC1 のタンパク質分解などによる制 Yoshimura K, Ishikawa T, and Shigeoka S (2007) Light regulation 御も同時に機能していると考えられた．すなわち，光 of ascorbate biosynthesis is dependent on the photosynthetic elec- 合成により豊富な炭素源の供給が可能な明条件下とは tron transport chain but independent of sugars in Arabidopsis. J 異なり，炭素源が大幅に制限される暗所下では，AsA Exp Bot 58, 2661-2671 生合成を含めた種々の生体有機分子への炭素分配は，幾重もの段階で厳密に制御されていると思われる．明条件下における VTC2 の転写レベルの重要性は，葉だけでなく，茎においても確認されたが，葉緑体が未発達の花や根では認められなかった（吉村ら未発表）．この結果からも，AsA 生合成と炭素源の供給能との関連性が支持される．本研究から，植物の複雑な AsA 生合成制御機構の一端が明らかになってきた．すなわち，VTC2 の転写制御が植物の AsA 生合成の最も重要なマスタースイッチであるが，その他にも予防的に多系統からなる制御システムが存在し，AsA の過剰生産を厳密に防いでいると考えられる．今後その全容を明らかにするためには， 4）Maruta T, Yonemitsu M, Yabuta Y, Tamoi M, Ishikawa T, and Shigeoka S (2008) Arabidopsis phosphomannose isomerase 1, but not phosphomannose isomerase 2, is essential for ascorbic acid biosynthesis. J Biol Chem 283, 28842-28851 5）Wang J, Yu Y, Zhang Z, Quan R, Zhang H, Ma L, Deng XW, Huang R (2013) Arabidopsis CSN5B interacts with VTC1 and modulates ascorbic acid synthesis. Plant Cell 25, 625-636 6）Wolucka BA, Van Montagu M (2003) GDP-mannose 3',5'-epimerase forms GDP-L-gulose, a putative intermediate for the de novo biosynthesis of vitamin C in plants. J Biol Chem 278, 4748347490 7）Mieda T, Yabuta Y, Rapolu M, Motoki T, Takeda T, Yoshimura K, Ishikawa T, Shigeoka S (2004) Feedback inhibition of spinach Lgalactose dehydrogenase by L-ascorbate. Plant Cell Physiol 45, 1271-1279 VTC2 の光応答に関わる転写制御やその他の制御系の 8）Badejo AA, Eltelib HA, Fukunaga K, Fujikawa Y, Esaka M (2009) 分子機構に加え，AsA のオルガネラおよび器官間の輸 Increase in ascorbate content of transgenic tobacco plants overex- 送系，細胞内 AsA 蓄積レベルの規定因子を明らかにし， pressing the acerola (Malpighia glabra) phosphomannomutase それらを総合的に理解することが必須である． gene. Plant Cell Physiol 50, 423-428 9）Bulley SM, Rassam M, Hoser D, Otto W, Schünemann N, Wright 10 号（10 月）2014〕トピックス 537 M, MacRae E, Gleave A, Laing W (2009) Gene expression stud- ascorbate biosynthesis in Arabidopsis. Biosci Biotechnol Biochem ies in kiwifruit and gene over-expression in Arabidopsis indicates 78, 60-66 that GDP-L-galactose guanyltransferase is a major control point of vitamin C biosynthesis. J Exp Bot 60, 765-778 10）Bulley S, Wright M, Rommens C, Yan H, Rassam M, Lin-Wang K, Andre C, Brewster D, Karunairetnam S, Allan AC, Laing WA (2012) Enhancing ascorbate in fruits and tubers through over-expression of the L-galactose pathway gene GDP-L-galactose phosphorylase. Plant Biotechnol J 10, 390-397 11）Yoshimura K, Nakane T, Kume S, Shiomi Y, Maruta T, Ishikawa T, Shigeoka S (2014) Transient expression analysis revealed the importance of VTC2 expression level in light/dark regulation of 12）Zuo J, Niu QW, Chua NH (2000) Technical advance. An estrogen receptor-based transactivator XVE mediates highly inducible gene expression in transgenic plants. Plant J 24, 265-273 13）Müller-Moulé P (2008) An expression analysis of the ascorbate biosynthesis enzyme VTC2. Plant Mol Biol 68, 31-41 14）Vlad F, Rubio S, Rodrigues A, Sirichandra C, Belin C, Robert N, Leung J, Rodriguez PL, Laurière C, Merlot S. (2009) Protein phosphatases 2C regulate the activation of the Snf1-related kinase OST1 by abscisic acid in Arabidopsis. Plant Cell 21, 3170-3184