152 - ジーエルサイエンス

LC Technical Note
HPLC用メタルフリーカラム使用のすすめ
15２
GL Sciences Inc.
アミノ酸、有機酸、テトラサイクリンやリン酸基含有化合物などには金属配位性の高い構造の化合物があります。
これらを分析する際に、金属の配位により錯体を形成しピーク形状や定量精度の悪化を引き起こすことがあります。
今までは、充填剤表面の残存金属がこの要因であると考えられていましたが、微量成分の高感度分析時には、充填
剤だけではなくカラム管やフリットなどの接液部分の金属が分析結果に悪影響を及ぼすことが判明してきました。
また、金属配位性化合物を分析する場合は、リン酸系移動相を使用することでピーク形状を改善する方法が取られ
てきました。しかし、LC/MS(/MS)分析においてリン酸系移動相は、その特性からほとんど使用されません。
今回、このような問題を解決するツールとして、接液部分の材質をすべてPEEK製にしたメタルフリーカラムの効果
についてLC/MS/MSのアプリケーションを中心にご紹介します。
（K.Kanno）
N
NH
NH2
OH
ヒスチジン O
O
エチレンジアミン
四酢酸
P
O
OH
OH
HPLC分析において、化合物の隣接する位置に上記のような官能基を複数有す
る化合物やリン酸基を有する化合物は金属の影響を受けやすくなります。
金属の影響
○ ピークのテーリング
○ ピークが溶出しない
○ 感度低下
など
※ 本テクニカルノートのデータは接液部の金属を不活性化した装置で取得しています。
詳細はお問い合わせください。
バックナンバーやアプリケーション検索はこちらから・・・
http://www.gls.co.jp/hplc.html
GL Sciences LC Technical Note
逆相分析例① テトラサイクリン
テトラサイクリン類は金属配位しやすい化合物で、HPLC分析カラムでは充填剤表面の残存金属やカラムの
金属材質への吸着による悪影響が発生します。
残存金属が少なく、不活性度の高いカラムを使用することでLC/MS(/MS)で一般的に使用されるギ酸系移動
相でも感度が高くなります。
さらに、接液部に金属を使用しないメタルフリーカラムにするとより感度が高くなります。
Intensity, cps
1.
2.
＜ステンレスカラム＞
＜ステンレスカラム＞
他社ODS
粒子径：1.7 mm
InertSustainSwift C18
粒子径：1.9 mm
＜メタルフリーカラム＞
InertSustainSwift C18
粒子径：1.9 mm
200
200
200
180
180
180
160
160
160
140
140
120
120
120
100
100
100
2
80
60
1
40
20
0
2.6
3.0
3.4
Time, min
60
40
40
20
20
2.6
充填剤の不活性度違い
3.0
3.4
Time, min
1
80
1
60
0
3.8
2
140
2
80
オキシテトラサイクリン
テトラサイクリン
各2 mg/L
3.8
0
2.6
3.0
3.4
Time, min
3.8
カラムホルダーの違い
ステンレス or メタルフリー
HPLC条件
カラム
: InertSustainSwift C18 (1.9 μm, 50 x 2.1 mm I.D.)
2. テトラサイクリン（Tetracycline）
他社カラム (1.7 μm, 50 x 2.1 mm I.D.)
移動相
: A) 0.1 % HCOOH in CH3CN
B) 0.1 % HCOOH in H2O
A/B = 10/90 – 1.5 min – 10/90 – 2.5 min – 90/10 , v/v
流量
: 0.4 mL/min
カラム温度
: 40 ℃
検出
: LC/MS/MS (ESI, Positive, MRM)
注入量
: 10 mL
サンプル濃度
: 2.0 mg/L
1. Oxytetracycline(OTC)
2. Tetracycline(TC)
Q1
460.9
445.0
Q3
326.2
154.0
Structures are created using Chemistry 4-D Draw which is
provided by ChemInnovation Software, Inc.
GL Sciences LC Technical Note
逆相分析例② リン酸基含有化合物
有機リン系農薬やヌクレオチドのようなリン酸基含有化合物は金属配位性の高い化合物の一つで、ステンレス材
質のHPLCカラムではピークが全く溶出しなかったり、形状が悪かったりすることがあります。このような化合物をメタ
ルフリーカラムにて分析することで、問題点が改善する場合があります。
50000 1:768.05>261.10(+) CE: -31.0
50000 1:768.05>261.10(+) CE: -31.0
45000
45000
40000
40000
35000
35000
30000
30000
25000
25000
20000
20000
15000
15000
10000
10000
5000
5000
分析条件
カラム
移動相
1
: InertSustainSwift C18 (1.9 μm, 50 × 2.1 mm I.D)
: A) 5 mM HCOONH4 in H2O
B) 5 mM HCOONH4 in CH3CN
A/B=98/2-2 min-80/20
: 0.4 mL/min
: 40 ℃
: LC/MS/MS (ESI, Positive, MRM)
: 10 μL
: Coenzyme A (Q1/Q3 = 768/261）
流量
カラム温度
検出
注入量
サンプル
NH2
OH
HS
NH
NH
O
O
O
O
O P O P O
CH3
OH OH
CH3
0
0
0.0
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0
6.0
7.0
min
0.0
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0
6.0
7.0
＜ステンレスカラム＞
＜メタルフリーカラム＞
Intensity, cps
6000
6000
2
5000
5000
4000
4000
3000
1000
1000
0
0
4
6
8
Time, min
流量
カラム温度
検出
注入量
サンプル
2000
1
2
12
3000
3
2000
10
＜ステンレスカラム＞
HO
2
4
6
8
Time, min
＜メタルフリーカラム＞
カビ毒の一種であるフモニシンは、隣接する位置にカルボキシル基など
が２つ以上あり金属配位性が強い化合物です。このような化合物は、ステ
ンレス材質のHPLCカラムでは、カラム内壁やフィルターへの吸着によって
ピーク形状の悪化が起こります。
感度UP
ピーク形状改善
2
1500
CH3
R
8000
300
0.0
4000
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Time (min)
＜ステンレスカラム＞
0.0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Time (min)
＜メタルフリーカラム＞
NH
2. FMOC-グリホシネート
: InertSustain C18 （3 μm , 100 ×2.1 mm I.D.）
: A) 0.1 % HCOOH ,10 mM HCOONH4
B) CH3CN
A/B = 60/40,v/v
: 0.2 mL/min
: 40 ℃
: LC/MS/MS ( ESI , Positive. , MRM )
: 1.Fumonisin B1 (Q1/Q3 = 722/334）
2.Fumonisin B2 (Q1/Q3 = 706/336）
1.2e4
600
OH
OH
R: FMOC
1. FMOC-グリホサート
O
P
フモニシン B1
1.6e4
900
OH
OH
流量
カラム温度
検出
サンプル
N
O
O
2
2.0e4
1200
N
1
2.4e4
1
R
P
3.2e4
2.8e4
1800
O
分析条件
カラム
移動相
N
: InertSustain C18 (3 μm, 150 × 2.1 mm I.D)
: A) 5 mM HCOONH4 in H2O
B) CH3CN
A/B=95/5 -9.3 min - 37/63
: 0.25 mL/min
: 40 ℃
: LC/MS/MS (ESI, Positive, MRM)
: 10 μL
: 1. FMOC-Glyphosate (Q1/Q3 = 390/168）
2. FMOC-Glufosinate (Q1/Q3 = 402/190)
3. FMOC-AMPA
(Q1/Q3 = 332/110) 各2 mg/L
10
逆相分析例③ ジカルボキシル含有化合物
2100
1. コエンザイムA （500 mg/L）
分析条件
カラム
移動相
3
O
N
O OH
HO P O
OH
min
Time(mm)
Time(mm)
N
フモニシン B2
GL Sciences LC Technical Note
HILIC分析例① アミノグリコシド系化合物
アミノグリコシド系化合物はストレプトマイシン等のアミノ糖を含む配糖体抗生物質で、隣接した位置にヒドロキシル
基(－OH)やアミノ基（－NH2）が複数あるため、金属配位しやすい化合物です。
ステンレス材質の影響は、カナマイシン（KM）のように溶出しない化合物、スペクチノマイシン（SPCM）のようにピー
ク形状がブロードになる化合物というように化合物の構造によって大きく異なります。
1.00e5
1.00e5
9.00e4
9.00e4
8.00e4
8.00e4
7.00e4
7.00e4
6.00e4
6.00e4
Intensity, cps
Intensity, cps
4. KM
5.00e4
4.00e4
1. SPCM
5.00e4
4.00e4
3.00e4
3.00e4
1. SPCM
2.00e4
2.00e4
1.00e4
1.00e4
2. SM
3.GEM
0.00
2. SM
3. GEM 未溶出
4. KM 未溶出
1
2
3
4
5
6
7 8 9
Time, min
0.00
10 11 12 13 14 15
＜ステンレスカラム＞
1
2
3
4
5
6
7 8 9
Time, min
10 11 12 13 14 15
＜メタルフリーカラム＞
H2N
NH
H
NH
H2N
HO
NH
O
OH
R
O
HO
HN
NH2
R
OH
H2N
NH
OH
O
1. スペクチノマイシン
O
O
2. ストレプトマイシン
HO
NH2
HO
O
OH O
HO
HO
NH
O
HO
NH2
HO
4. カナマイシン
OH
O
OH
NH2
HPLC条件
カラム
: Inertsil Amide
検出
(5 μm, 150 x 2.1 mm I.D.)
移動相
: A) 0.1 % HCOOH in CH3CN
B) 0.1 % HCOOH in H2O
A/B = 70/30 – 10 min – 50/50 , v/v
流量
: 0.2 mL/min
カラム温度
: 40 ℃
注入量
: 10 mL
NH2
NH
3. ゲンタマイシン
サンプル濃度
: LC/MS/MS (ESI, Positive, MRM)
Q1
1. Spectinomycin(SPCM)
351
2. Streptomycin(SM)
292
3. Gentamycin(GEM)
322
4. Kanamycin(KM)
243
: 500 mg/L
OH
O
OH
O
HO
O
Q3
333
176
160
162
NH2
GL Sciences LC Technical Note
HILIC分析例② アミノ酸
アミノ酸のなかでもアミノ基が２つ以上ある化合物※は金属の影響を受けやすくなります。
アミノ基が１つのロイシンやバリンなどはステンレスカラムとメタルフリーカラムで感度に変
化はありません。一方、ヒスチジンやアルギニンのようなアミノ基が複数あるアミノ酸は感度
やピーク形状にカラム材質が影響します。
感度UP
ピーク形状改善
※アミノ酸の金属配位の主はアミノ基とカルボ
キシル基によるものと考えられます。
3.2e6
3.0e6
2.8e6
2.6e6
3.0e6
2.8e6
2.6e6
2.4e6
2.0e6
Intensity, cps
2.2e6
2.0e6
1.8e6
1.6e6
1.4e6
1.2e6
1
1.0e6
5
2
4
3
6.0e5
1.6e6
1.4e6
1.2e6
4.0
5.0
6.0
Time, min
2
6
7.0
3
4.0e5
7
3.0
1
6.0e5
2.0e5
2.0
1.8e6
8.0e5
6
4.0e5
1.0
4
1.0e6
8.0e5
0.0
5
3.2e6
5. Arginine
6. Lysine
7. Cystine
2.2e6
8.0
7
2.0e5
9.0
10.0
0.0
1.0
2.0
3.0
4.0
5.0
6.0
Time, min
7.0
8.0
ピーク形状比較（ヒスチジン）
N
OH
2.8e6
O
4. Histidine (His)
2.4e6
2.0e6
NH2
1.2e6
0.0
NH
H2N
ステンレスカラム
OH
NH
メタルフリーカラム
O
5. Arginine (Arg)
HPLC条件
NH2
: Inertsil Amide
(3 μm, 150 x 2.1 mm I.D.)
移動相
OH
H2N
: A) 100 mM HCOONH4, 0.1 % HCOOH in 75 % CH3CN
6. Lysine (Lys)
B) 100 mM HCOONH4, 0.1 % HCOOH in H2O
A/B = 100/0 – 3 min – 100/0 – 5.5 min – 70/30 , v/v
流量
: 0.3 mL/min
カラム温度
: 40 ℃
検出
: LC/MS/MS (ESI, Positive, MRM)
注入量
: 5.0 mL
サンプル濃度 : 5 mM
10.0
NH2
NH
3.2e6
カラム
9.0
＜メタルフリーカラム＞
＜ステンレスカラム＞
Intensity, cps
Intensity, cps
2.4e6
1. Leucine
2. Isoleucine
3. Valine
4. Histidine
Q1
1. ロイシン
132
2. イソロイシン 132
3. バリン
118
4. ヒスチジン 155
5. アルギニン 175
6. リジン
147
7. シスチン
241
Q3
86
86
72
110
70
84
152
NH2
OH
O
3. Valine (Val)
他のアミノ酸については、アプリケーション検索サイト『イナートサーチ』のLB315を参照ください。
http://www.gls.co.jp/technique/inertsearch_lc/pdf/LB315.pdf
O
GL Sciences LC Technical Note
＜メタルフリーPEEKカラム価格表＞
UHPLC-PEEK カラム（粒子径3 μm以下に対応）
粒子径
2 μm
(1.9 μm)＊
3 μm
内径（mm）
2.1
4.6
5020-00531
5020-00527
5020-00532
5020-00528
5020-00533
5020-00529
5020-00534
5020-00530
5020-00539
5020-00535
5020-00540
5020-00536
5020-00541
5020-00537
5020-00542
5020-00538
長さ
（mm）
50
100
150
250
50
100
150
250
充填剤
PEEK
ステンレス
UHPLC-PEEK カラム
注）標準カラムジョイント形式は、UP型です。
＊InertSustainSwift C18を選択された場合は、2 μmではなく1.9 μmになります。
PEEKカラム（粒子径4 μm以上に対応）
粒子径
4 μm
5 μm
10 μm
から選択
内径（mm）
2.1
4.6
5020-00520
5020-00521
5020-00510
5020-00522
5020-00511
5020-00512
5020-00523
5020-00513
5020-00524
5020-00515
5020-00516
5020-00525
5020-00517
5020-00526
5020-00518
長さ
（mm）
30
33
50
75
100
150
200
250
300
充填剤
PEEK
PEEKカラム
注）標準カラムジョイント形式は、UP型です。
＜対応可能な充填剤＞
InertSustain®シリーズ
・InertSustain C18
・InertSustainSwift C18
・InertSustain C8
・InertSustain NH2
・InertSustain Phenylhexyl
・InertSustain Phenyl
Inertsil® シリーズ
・Inertsil C8-4
・Inertsil NH2
・Inertsil ODS-4
・Inertsil WP300 C4
・Inertsil C8-3
・Inertsil WP300 Diol
・Inertsil ODS-3
・Inertsil Peptides C18
・Inertsil Ph-3
・Inertsil SIL-100A
・Inertsil ODS-SP
・Inertsil HILIC
・Inertsil WP300 C18
・Inertsil WP300 SIL
・Inertsil ODS-P
・Inertsil Amide
・Inertsil WP300 C8
・Inertsil CN-3
・Inertsil ODS-EP
・Inertsil Diol
注）その他の充填剤も対応可能です。
各充填剤ごとに対応可能な粒子径が異なります。詳細については、別途お問い合わせください。
ジーエルサイエンスでは、分析ノウハウときめこまやかなフォローもお付けしたシステム提案を行っております。
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TEL.029(858)3700
TEL.043(248)2441
TEL.048(667)1611
TEL.052(931)1761
TEL.082(233)1101
TEL.092(738)6633
FAX.03(5323)6622
FAX.06(6357)4580
FAX.045(985)7901
FAX.024(536)1518
FAX.029(858)3780
FAX.043(248)2485
FAX.048(667)1656
FAX.052(931)1814
FAX.082(233)1110
FAX.092(738)6636
ｶｽﾀﾏｰｻﾎﾟｰﾄｾﾝﾀｰ T E L . 0 4 ( 2 9 3 4 ) 1 1 0 0
FAX.04(2934)3361
東
大
横
東
筑
千
北
名
広
九
京営業
阪
支
浜
支
北営業
波営業
葉営業
関東営業
古屋営業
島営業
州営業
部
店
店
所
所
所
所
所
所
所
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