Blunting-Convenience Kit（PDF 82KB）

Blunting-Convenience Kit Manual（第二版）
Code No. 312-06291
25 反応用
Code No. 318-06293
5 反応用
∼解説∼
目的の遺伝子をベクターDNA に連結する際に適当な制限酵素がない場合、DNA 末端が平滑であれば配列に
依存することなくライゲーションすることができます。T4 DNA Polymerase は、DNA 依存性 DNA ポリメラーゼ
で、3’→ 5’ Exonuclease 活性と 5’→ 3’ Polymerase 活性を持ち、5’突出末端及び 3’突出末端のどちら
の場合もこの酵素で平滑化することができます。また、ライゲーション反応を短時間で行うことができる
2×Ligation Mix (Ligation-Convenience Kit)と組み合わせることによって、平滑化からライゲーションまでを短
時間で行うことができます。
Ⅰ.特長
● DNA 末端の平滑化からライゲーションまでを迅速、簡便に行うことが出来ます。
● 10×Blunting Buffer には反応に必要な dNTP などが含まれているので、T4 DNA Polymerase を加える
だけで、簡単に DNA 末端の平滑化が行えます。
● 5’突出末端 DNA, 3’突出末端 DNA および 3’末端に A が付加した PCR 産物などを平滑化できます。
● 2×Ligation Mix を用いて、ライゲーション反応を短時間で行うことができます。
Ⅱ.キット内容
25 反応用*
5 反応用*
T4 DNA Polymerase
25μl×1 本
5μl×1 本
10×Blunting Buffer
50μl×1 本
10μl×1 本
250μl×1 本
50μl×1 本
試薬
2×Ligation Mix
* 平滑化，ライゲーション共に 20μl の反応系で使用した場合の反応数です。
Ⅲ.保存および融解方法
−20℃保存
・失活を避けるため、T4 DNA Polymerase は絶対にボルテックスしないでください。
・ 2×Ligation Mix は、使用時に氷上にて完全に融解させ、ピペッティングでよく混ぜてから使用して下さい。
・ 2×Ligation Mix は、50 回までの凍結融解による反応効率の低下は認められておりません。
-1-
Ⅳ.プロトコルおよび実験例
＜1. プロトコル＞
（1）平滑化反応液の調製
＜Blunting 反応＞
5’突出末端、3’突出末端及び PCR 産物など、末端を平
サンプル DNA 溶液（0.1∼10 pmol） 17μl
滑化したい DNA（DNA 末端濃度で 0.1∼10pmol)を 17μl
10×Blunting Buffer
に調製する。＊1
次に、10×Blunting Buffer を 2μl 加え混合する。
2μl
T4 DNA Polymerase を 1μl 加える
（2）酵素の添加
T4 DNA Polymerase を 1μl 加え、ピペッティングで混合す
37℃で 5 分間反応させる
る。＊2
（3）平滑化反応
氷上に置き反応を停止させる (平滑化反応液)
37℃で 5 分間反応させる。＊3
（4）反応の停止
平滑化反応液を氷中に置き反応を停止する。
*平滑化反応液は
必要量使用する
（1∼5μl）＊6
すぐに使用しない場合はフェノール/クロロホルム/イソア
ミルアルコール抽出、エタノール沈澱を行い−20℃で保存
する。
＜Ligation 反応＞
平滑化反応液
（5）ライゲーション反応液の調製
平滑化反応液、平滑末端 DNA ベクター溶液を合わせて
10μl の DNA 溶液を調製する。
10μl の 2×Ligation Mix を添加し、混和する。
（6）ライゲーション反応
16℃で 5∼30 分間反応させる。＊4
平滑末端 DNA ベクター溶液 up to 10μl
ddH2O
2×Ligation Mix
10μl
Total
20μl
16℃で 5∼30 分間反応させる
（7）形質転換
反応液をそのまま形質転換に用いる。＊5
形質転換または in vitro パッケージング
*1 DNA 末端濃度 0.1∼10pmol は pUC19（2686bp）0.1∼10μg に相当します。
*2 T4 DNA Polymerase は絶対にボルテックスしないでください。ボルテックスにより失活する恐れ
があります。
*3 反応時間は 5 分間を厳守してください。
*4 16 時間、オーバーナイト等の長時間のライゲーションを行うと、形質転換効率が著しく低下す
る場合があります。
*5 形質転換に用いる反応液の量はコンピテントセルの 1/10 量以下にして下さい。多量の反応液
を使用すると、形質転換効率が低下することがあります。
反応液の量がコンピテントセルの 1/10 量以上になってしまう場合は、ライゲーション反応後、
エタノール沈澱法によって DNA を回収し、その DNA をコンピテントセルの 1/10 量以下になる
ように ddH2O または TE（pH 8.0）に溶解してから形質転換に使用してください。
-2-
*6 ライゲーション反応に持ち込む平滑化反応液は 5μl 以下にして下さい。5μl 以上持ち込む場
合はフェノール/クロロホルム/イソアミルアルコール抽出後、エタノール沈殿を行い ddH2O
または TE（pH 8.0）に溶解してから使用して下さい。
＜2. 実験例＞
ベクター平滑化の確認
1)
pUC19 を EcoRⅠ（5’突出末端）と PstⅠ（3’突出末端）で切断し、フェノール/クロロホルム/
イソアミルアルコール抽出後、TE バッファーに溶解した。
2)
EcoRⅠと PstⅠで切断した pUC19 1μg をプロトコルに従って末端を平滑化した。
3)
平滑化した DNA の一部を 2×Ligation Mix を用いて 16℃ 30 分間ライゲーション反応を行っ
た。
4)
ライゲーション反応後、未切断の pUC19 を除きバックグラウンドをなくすため、ライゲーション
反応液を 5 倍希釈し 65℃ 5 分間熱処理することで T4 DNA Ligase を失活させた後、BamH
Ⅰで切断した。
5)
BamHⅠで切断したライゲーション反応液で ECOSTM Competent E.coli DH5αを形質転換し、
生じたコロニー数を計測した。
下に pUC19 で形質転換したときのコロニー数を 1 としたときの、平滑化後セルフライゲーシ
ョンによって生じたコロニー数の割合を示す。
ベクターの平滑化の確認
ベクターの平滑化の確認
結果
1.20
青コロニー
pUC19 を EcoRⅠと PstⅠで切断したベクター
白コロニー
1.00
を平滑化し、セルフライゲーションすると、
LacZ のフレームが合い青コロニーを生じる。
BamHⅠで切断することで、pUC19 由来の青
0.80
コロニーは排除されているので、生じた青コ
ロニーは末端平滑化後にセルフライゲーショ
0.60
ンでできたプラスミドである。
左記のグラフより、5 分間の反応で約 6 割の
0.40
ベクターが平滑末端ライゲーションされてい
ることがわかる。
0.20
0.00
pUC19
pUC19
平滑化あり
平滑化なし
平滑化なし
-3-
インサート DNA の平滑化
1)
pBluescriptⅡSK(＋)を EcoRⅤで切断し脱リン酸化後、フェノール/クロロホルム/イソアミルアル
コール抽出後に TE に溶解した。
2)
λDNA を鋳型にして増幅した 500bp の断片を EcoRⅠ及び PstⅠで切断し、2 種類の断片を調
製した。
3)
プロトコルに従って、2 種類の断片を平滑化した。
4)
pBluescriptⅡSK(＋)を EcoRⅤで切断し脱リン酸化したベクターと平滑化した断片を 2×
Ligation Mix を用いてインサート/ベクターモル比 = 5 で 16℃ 30 分間ライゲーション反応を行っ
た。また、コントロールとしてλDNA を鋳型にして増幅した断片を EcoRⅤで切断した断片のライ
ゲーション反応も行った。
ライゲーション反応液の一部で ECOSTM Competent E.coli DH5αを形質転換し、生じたコロニ
5)
ー数を計測した。
青コロニー
白コロニー
Pst Iインサート
Eco
EcoRI インサート
R I インサート
Pst I インサート
700
90.0
70.0
800
60.0
50.0
600
40.0
400
30.0
平滑化なし
平滑化なし
70.0
400
60.0
50.0
300
40.0
200
30.0
10.0
0
0.0
平滑化あり
平滑化あり
80.0
500
100
10.0
0
90.0
20.0
20.0
200
コロニー数
コロニー数（個）
80.0
白コロニー率（%）
白コロニー率
コロニー数
コロニー数（個）
1000
100.0
600
白コロニー率（%）
白コロニー率
100.0
1200
白コロニー率（%）
コントロール
Control
fragment）
EcoR V DNA
断片）
（（EcoRⅤ
0.0
平滑化あり
平滑化あり
平滑化なし
平滑化なし
Control
コントロール
fragment）
EcoR V DNA
断片）
（（EcoRⅤ
結果
5’突出末端、3’突出末端にかかわらず、平滑化したインサートは EcoRⅤ断片と同じ割合でライゲーション
できたことから、EcoRⅠ断片及び PstⅠ断片は 37℃ 5 分間の反応で十分に平滑化されていることがわか
った。
-4-
＜3. 参考データ＞
1. PCR 産物の平滑化について
PCR で増幅した 500bp の断片を、プロトコールに従って平滑化した。
① 一方は、平滑化後にそのまま EcoRⅤで切断した pBluescriptⅡSK(＋)にライゲーションした。
② もう一方は、平滑化後に T4 Polynucleotide Kinase でリン酸化し、熱処理をして
T4 Polynucleotide Kinase を失活させた後、 EcoRⅤで切断，脱リン酸化した pBluescriptⅡ
SK(＋)とライゲーションした。*
下のグラフは生じたコロニー数を 1 とした時の、青コロニーと白コロニーの割合を示した。
平滑化後のリン酸化の有無について
平滑化後のリン酸化の有無について
青コロニー
1.20
白コロニー
結果
PCR 産物を平滑化後、そのままリン酸が付加してい
るベクターとライゲーションした場合は、白コロニー
の割合が約 13%だった。一方、PCR 産物をリン酸化
1.00
し、脱リン酸化したベクターとライゲーションした場
合は、90%以上の割合で白コロニーが得られた。
0.80
0.60
PCR 産物を平滑化してライゲーションに用いる場
合、通常、PCR 産物の 5’末端にはリン酸基が付加
0.40
していないため、脱リン酸化していないベクターを用
0.20
いる必要があります。しかし、脱リン酸化していない
ベクターをライゲーションに用いると、ベクターのセ
0.00
リン酸化無し
①
リン酸化あり
②
ルフライゲーションの割合が多くなるため、PCR 産
物を平滑化してライゲーションする場合は、平滑化
後に T4 Polynucleotide Kinase を用いてリン酸化し、
かつ、ベクターは脱リン酸化することをお薦めしま
す。
* ニッポンジーンの T4 Polynucleotide Kinase (Code No. 312-01551)を利用する場合、10×
Kinase Buffer A でリン酸化を行った場合は、熱処理後そのまま 2×Ligation Mix でライゲーショ
ン反応を行っても構いません。10×Kinase Buffer B でリン酸化を行った場合は、フェノール/クロ
ロホルム/イソアミルアルコール抽出後、エタノール沈澱してから 2×Ligation Mix でライゲーション
反応を行ってください。
-5-
2. ライゲーションにおけるインサートモル比の検討
ライゲーションの際のベクター：インサートの比は、ライゲーション効率に大きく影響します。以下は、平滑末端
ライゲーションにおいて、様々な長さのインサート DNA をライゲーション、形質転換し、最も良い結果が得られ
たモル比を示した表です。
・平滑末端
インサート長 200 bp
ベクター
1
インサート
5
600 bp
1
5
1000 bp 3000 bp
1
1
2∼10
0.5∼2
ベクター：Sma I で切断した pUC19 ( 0.03 pmol )
インサート：Sma I で切断したインサート DNA
( 0.015 pmol , 0.03 pmol , 0.06 pmol , 0.15 pmol , 0.3 pmol )
ライゲーション反応：16℃, 5 分間
ライゲーション反応における注意点

16 時間、オーバーナイト等の長時間ライゲーションを行うと、形質転換効率が著しく低下する場合が
あります。

高塩濃度のバッファーに DNA を溶解させると、ライゲーション効率が著しく低下します。DNA 溶液は
ddH2O または TE buffer（pH8.0）にて調製して下さい。

形質転換に用いる反応液の量はコンピテントセルの 1/10 量以下にして下さい。多量の反応液を使用する
と、形質転換効率が低下することがあります。

反応液の量がコンピテントセルの 1/10 量以上になってしまう場合は、ライゲーション反応後、エタノール沈
澱法によって DNA を回収し、その DNA をコンピテントセルの 1/10 量以下になるように ddH2O に溶解し
てから形質転換を行って下さい。

ライゲーション反応に用いる DNA の精製度、使用する制限酵素の違いによってライゲーション効率が異な
る場合があります。

パッケージングに用いる反応液の量はパッケージング Extract の 1/10 量以下にして下さい。多量の反応
液を使用すると、パッケージング効率が低下する場合があります。

パッケージング Extract の 1/10 量以上の反応液を使用する場合は、ライゲーション反応後、エタノール沈
澱法によって DNA を回収し、その DNA をパッケージング Extract の 1/10 量以下になるように ddH2O に
溶解してから形質転換を行って下さい。

Gigapack（Stratagene 社）を使用してもパッケージングを阻害することはありません。
-6-
Ⅴ．関連製品
Code No.
製品名
包装単位
希望納入価格(円)
316-06233
ECOS™ Competent E. coli DH5α
100μl×20 本
36,000
313-06243
ECOS™ Competent E. coli JM109
100μl×20 本
36,000
318-01313
Competent E.coli HB101
100μl×10 本
18,000
316-01353
Competent E.coli JM109
100μl×10 本
18,000
316-01711
Competent E.coli MV1184
100μl×10 本
18,000
319-01701
Competent E.coli DH5
100μl×10 本
18,000
314-06251
Bac’n’Roll Beads
100 回分
4,400
316-01331
Transformation Kit HB101
10 回分
22,000
319-01321
Transformation Kit JM109
10 回分
22,000
310-01731
Transformation Kit MV1184
10 回分
22,000
313-01721
Transformation Kit DH5
10 回分
22,000
312-01551
T4 Polynucleotide Kinase
1,000 units
13,000
319-05961
Ligation-Convenience Kit
100 回分
20,000
315-05963
Ligation-Convenience Kit
10 回分
9,000
311-90151
Phenol/Chloroform/Isoamyl alcohol (25 : 24 : 1)
250 ml
15,000
316-90025
TE (pH8.0)
500 ml
9,000
314-90021
TE (pH8.0)
100 ml
4,000
310-90023
TE (pH8.0)
100 ml×6
15,600
318-90105
Distilled Water, Deionized, Sterile
500 ml
9,000
316-90101
Distilled Water, Deionized, Sterile
100 ml
4,000
312-90103
Distilled Water, Deionized, Sterile
100 ml×6
15,600
319-01343
Hi-Competence Broth
1ml×20 本
18,000
317-01741
LAMBDA INN
3 回分
14,000
-7-
株式会社ニッポンジーン
学術営業部学術営業課
TEL 076-451-6548
FAX 076-451-6547
Email : [email protected]
URL : http://www.nippongene.com
Blunting-Convenience Kit Manual 第二版（050511KS）
-8-

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