様式 C-19 科学研究費補助金研究成果報告書平成２３年５月１３日現在機関番号：１２５０１研究種目：基盤研究（A）研究期間：2008～2010 課題番号：２０２４１０１６研究課題名（和文）乳幼児における臭素系化学物質曝露の実態解明と評価法の開発研究課題名（英文） Exposure assessment of polybrominated diphenyl ethers (PBDEs) to human newborns and development of evaluation method 研究代表者森千里（MORI CHISATO）千葉大学・大学院医学研究院・教授研究者番号：90174375 研究成果の概要（和文）：本研究は、有機臭素化合物の(1)環境からの曝露状況と(2)ヒトおよび動物への影響評価を究明するものである。本研究によって、(a) PBDEs発生源と考えられる電子機器からの室内環境への影響、(b) ヒト生体試料へのPBDE曝露による影響評価、(c) 新生児期齧歯類のdeca-BDEへの曝露による成熟後の精巣上体、精巣への影響に関する知見を得た。これらの成果は、来世代のための化学物質曝露を減らす環境改善型予防医学的対応への汎用性が期待される。研究成果の概要（英文）： The purposes of this research were the exposure assessment of polybrominated diphenyl ethers (PBDEs) from the environment and the risk assessment of PBDEs on humans and animals. The results of this study clarified: (a) the concentration level of PBDEs from electrical facilities indoor air, (b) exposure assessment of human blood samples of PBDEs, (c) risk using mice. These new findings will help to develop the environmental preventive medicine to decrease the risk by artificial chemicals on future generations. 交付決定額２００８年度２００９年度２０１０年度年度年度総計直接経費 17,000,000 11,600,000 9,500,000 間接経費 5,100,000 3,480,000 2,850,000 （金額単位：円）合計 22,100,000 15,080,000 12,350,000 38,100,000 11,430,000 49,530,000 研究分野：複合新領域科研費の分科・細目：環境学、放射線・化学物質影響科学キーワード：臭素系難燃剤、PBDE、PCB、乳幼児、住環境１．研究開始当初の背景ポリ塩化ビフェニル (PCB) やダイオキシンなど有機塩素化合物については生体への影響について研究がすすめられ世界的にも規制が進んでいるが、依然として、成人のみならず、胎児や乳幼児が胎盤経由や母乳経由で曝露している。これらの有機塩素化合物に加え、最近は有機臭素系化合物の汚染も危惧されている。曝露状況もまだ十分な研究がなされていないが、塩素化ダイオキシン 2,3,7,8-TCDD と臭素化ダイオキシン 2,3,7,8-TBDD は CYP 系遺伝子などへの影響は極めて類似しているなど、臭素系化合物は塩素系化合物と性質が似ており生体影響が懸念される。臭素系化合についてもどのような影響を及ぼすのか明確にする必要がある。現在、日本で難燃剤として使用されているポリ臭素化ジフェニルエーテル (PBDE) は deca 体だけであるが、体内からは様々な臭素数の PBDE が検出されており、deca 体の安全性だけが確保されてもヒトへの影響がないとはいえず、詳細な研究をしておく必要もある。そこで、本研究では(1) 有機臭素化合物のヒトへの影響評価の基礎となる曝露状況と (2) 有機臭素化合物のヒトへの曝露評価法を確立するため、実験動物による影響評価の研究を行うものである。本研究の遂行により、未来世代の化学物質曝露を減らすための環境改善型予防医学的対応を進める上で重要な知見を提供するものとなる。２．研究の目的ポリ塩化ビフェニル (PCB) やダイオキシンなどの生体への影響に加え、最近では有機臭素系化合物の汚染によるヒトへの影響も懸念されている。本研究では、環境化学物質によるヒトの健康影響に関するリスク低減のため、有機臭素化合物であるポリブロモジフェニルエーテル（PBDE）のヒトおよび動物への影響評価を究明することを目的に以下(1)～ (3)の研究を行った。 (1) PBDEs発生源の1つと考えられる難燃化製品である電子機器の稼働による室内環境への影響評価 (2) ヒト生体試料へのPBDE曝露による影響評価と、PBDEとの化学構造が類似した食品由来の蓄積性化学物質の指標となりうるPCBの曝露状況との関係 (3) 新生児期齧歯類のdeca-BDEへの曝露による成熟後の精巣上体、精巣への影響評価３．研究の方法 (1) 電子機器稼働による室内環境への影響化学物質を低減した建物内の室内で、難燃化製品であるパーソナルコンピューター（PC）1 台を使用した際の室内大気と、使用しない状況下での室内大気を採取した。採取した各室内大気の PBDEs 濃度分析については測定分析会社に外注し、ガスクロマトグラフ高分解能質量分析装置 HRGC-HRMS を用い測定を行い、内部標準法により定量した。 (2) PBDE 曝露によるヒトへの影響 ① 有機臭素化合物の遺伝子発現への影響 PBDE (DE-71、DE-79、DE-83) を臍帯静脈内皮細胞 (HUVEC)に、40 μM の濃度で曝露し、 6, 12, 24, 48 時間後の遺伝子発現を調べた。 ② 母体および新生児における PBDE 曝露状況有機臭素化合物の曝露状況: 出産前後に採取した 8 組の臍帯・臍帯血・母体血・母乳中の臭素化難燃剤 PBDE と塩素系化学物質 PCB の濃度を測定した。PBDE および PCB の測定は、測定分析会社に外注した。 ③ 成人末梢血中の PBDE 濃度の検証成人男性 3 名と成人女性 2 名の計 5 名から採取した末梢静脈血を採取した。測定した化学物質は、臭素系難燃剤物質である PBDEs と、化学構造の類似した PCBs で、これらの化学物質の測定は、測定分析会社に外注した。 (3) deca-BDEの曝露による齧歯類への影響 ① 精巣上体への影響新生児の ICR 雄マウス(生後 1-5 日)に対して、溶媒に溶かした deca-BDE を 0.25mg/kg body weight で皮下注射した投与群と、溶媒のみを同様に投与した対照群マウスを 12 週齢まで飼育した後、精巣を摘出し、RNeasy Mini Kit を用いて RNA を抽出し、GeneChip Mouse Genome 430 2.0 Array を用いて遺伝子発現を解析した。 ② 精巣への影響上記(3)①の研究に提供した雄マウスの投与群および対照群の精巣を摘出し、その片側を樹脂包埋し、組織切片薄切を行い、ヘマトキシリン・エオジン染色により評価した。残りの精巣についてはウエスタンブロットによる評価に用いた。４．研究成果 (1) 電子機器稼働による室内環境への影響化学物質を低減した建物内の室内を用いた教室でのモニタリング結果では、難燃化製品である PC 一台の使用により 0.0013ng/m3、 PC を使用しない状況下では検出下限未満（N.D.）であった。一方で、我々の先行研究（部内資料）では、化学物質を低減した別の室内でテレビ 4 台、PC3 台を 8 時間通電させた際には、通電しない際の濃度（ 0.0024 ng/m3）と比べ通電することでその濃度が 1.2 ng/m3 まで高まる知見を得ている。すなわち、本研究結果から PC 一台の使用だけでも PBDE の揮発が認められ、電子機器から揮発する PBDE 濃度は極微量の結果ではあるが、他の難燃化製品である電子機器類やカーテンとの共用による揮発量の高まりも予想される。多くの電子機器を使用した室内環境下での長時間滞在によるヒトへの影響も大いに懸念されるところである。本研究成果とこれまでの成果から、電子機器などの様々な工業製品に耐可燃性を目的で使用される PBDE の影響について、乳幼児を含めたヒトおよび齧歯動物、さらには生活環境を含め発生段階から包括的に検証することは、次世代影響を究明する上で肝要と考える。 (2) PBDE 曝露によるヒトへの影響〔雑誌論文 ②,③,④,⑤,⑥,⑦, 図書 ①, ②, 学会発表 ①,③,④,⑤,⑥,⑦,⑧,⑨〕 ① 有機臭素化合物の遺伝子発現への影響: TXNIP (thioredoxin interacting protein) をはじめとする Thioredoxin family の遺伝子、 DHCR24 (3β-hydroxysterol-Δ24 reductase や p53 (tumor suppressor protein) の発現変動が確認され、PBDE は酸化ストレスに関与する遺伝子の発現を変化させることが明らかになった。 ②母体および新生児における PBDE 曝露状況 PBDE 曝露と PCB 曝露には明瞭な関連性はなかった。PCB では組織間の移行性はどの組織間でも変わらなかった。PBDE の濃度(pg/g 湿重量)は、臍帯 4.2±3.2 (平均±標準偏差)、臍帯血 4.1±2.5、母体血 21±6.6、母乳 65 ±34 であった。PBDE では主に低臭素化物が移行しやすく、母体血では主に 4～10 臭素化物が検出されたが、10 臭素化物は母乳へほとんど移行しなかった。 ③ 成人末梢血中の PBDE 濃度の検証 5 名(Sub.1～Sub.5)の血液試料から得られた血中総 PBDEs 濃度は湿重量当たり最低値（Sub.5）：16 pg/g から最大値（Sub.1）：52pg/g の範囲であった。本研究結果で得られた 5 名の総 PBDEs は、我々の先行研究（川城ら、医学の歩み 228、2009）で報告した経産婦 16 名の結果である母体血による湿重量 25±23 pg/g と同程度の濃度であった。詳細な結果は示さないまでも、検出された異性体をみると、提供試料により異なるが、 BDE-209 の割合は個々の総 PBDEs 濃度の約 4 割から 6 割を占めるが、現段階では傾向を記すにとどめる。一方、血中総 PCBs 濃度は最低値：Sub.2； 320 pg/g；から最大値：Sub.1、2；590pg/g の範囲にあった。総 PCBs 濃度とダイオキシン濃度との間に相関があることを我々は報告（Mori C, et al., Chemosphere, 73,2008)しているが、PBDEs と化学構造の似ている PCBs との相関について確認したが、総 PBDE と総 PCB 濃度の結果には組み合わせの違いがみられ、明らかなる相関傾向は確認できなかった。この点については、PBDEs は、有機塩素化合物である PCBs と比べ水酸化体へ代謝されやすく、蓄積性が低いとされることが起因することも考えられよう。 (3) deca-BDEの曝露による齧歯類への影響〔雑誌論文 ①, 学会発表 ②〕 ①精巣上体への影響マイクロアレイ解析により、新生児期に deca-BDE 0.25mg/kg BW を皮下注射した投与群において 12 週齢の精巣上体で発現が 2 倍以上に亢進している遺伝子（EST を含む）が 20 個、0.5 倍以下に低下している遺伝子（EST を含む）が 29 個検出された。まず発現が上昇した遺伝子についてであるが、もともとの発現レベルがごく低い場合は、それが数倍になったとしても生物学的に意義があるかどうかは疑問である。一方、もともとの発現が極端に低くても曝露によってそれが強く発現するようなら、何らかの機能に影響を及ぼす可能性がある。また、もともとある程度の発現がある場合は、それが 2 倍になったとしたら生物学的に意義があると思われる。発現が亢進している遺伝子には Adi1、 Rbbp9、Rrm1 などが含まれ、曝露により精巣上体においてアポトーシス、細胞増殖（あるいはがん化）、DNA 修復の必要性などが亢進している可能性が示唆された。一方、発現が低下している遺伝子には Aass、Erdr1、Pink1、 Fabp4、Pla2g7、Car3、Cfd、Adipoq、Iapp、 Ubc などが含まれ、アポトーシスの増加、脂質代謝の異常、酸化ストレスに対する感受性の亢進ならびに各種ストレスに対する抵抗力の低下などが疑われた。加えて、リシン分解能力の低下、異常精子の増加などがあるかもしれない。 ② 精巣への影響個体重量については対照群（45.4 ± 6.51g）と deca-BDE 0.25mg/kg BW を皮下注射した投与群（45.8 ± 2.55g）との間に差は見られなかった。精巣重量は対照群（左：0.165 ± 0.02g、右：0.157 ± 0.02g）と比べ投与群（左：0.130 ± 0.01g、右：0.120 ± 0.01g）で有意に減少したが、精子形成は、両群で確認された。また、精巣組織切片による評価では、投与群において、伸長精子細胞数およびセルトリ細胞数の有意な減少が見られる一方で、精原細胞、精母細胞、円形精子細胞の減少は有意でなかったことから、円形精子細胞から伸長精子細胞への変態および伸長精子細胞の成熟のために重要な精巣内特殊接合装置である Apical Ectoplasmic Specialization (Apical ES) の機能障害を誘発する可能性が示唆された。これらの結果から、胎児期および新生児期の deca-BDE 曝露による雄性生殖への影響が懸念される。５．主な発表論文等（研究代表者、研究分担者及び連携研究者には下線）〔雑誌論文〕（計 7 件） ① C. Mori, H. Miyaso, N. Nakamura, Y. Matsuno Y, E. Todaka. New point for e valuation of environmental pollutants including endocrine disrupting chemi cals and polybrominated diphenyl ethe rs (PBDEs) on male reproductive syste m. Proceeding book of the 11th Intern ational symposium on Spermatology, （i n press）査読あり ② 森千里、化学物資の次世代への影響―長期晩発影響とエピジェネティック変異による影響― 、保健の科学、査読なし、52、 2010、15-19 ③ 川城由紀子、松野義晴、深田秀樹、森千里、臭素系難燃剤による胎児への影響に関する最近の知見、医学の歩み、査読なし、 228、2009、785-786 ④ 深田秀樹、森千里、“ケミレス”環境医学―化学物質を削減した社会づくりポリ塩化ビフェニル(PCB)を指標とした化学物質の健康診断と削減方法の開発、医学の歩み、査読なし、228、2009、785-786 ⑤ Mori C and Todaka E. Establishment of sustainable health science for future generations: from a hundred years ago to a hundred years in the future. Environ. Health Prev. Med., 査読あり, 14,2009, 1-6 ⑥ Kawashiro Y, Fukata H, Omori-Inoue M, Kubonoya K, Jotaki T, Takigami H, Sakai S and Mori C. Perinatal Exposure to Brominated Flame Retardants and Polychlorinated Biphenyls in Japan. Endocrine Journal, 査読あり ,55, 2008,1071-1084 ⑦ Mori C, Fukata H, Sakurai K, Jotaki T, Todaka E and Saito Y. Strong correlation between the concentration of dioxins and total PCBs in current Japanese people. Chemosphere, 査読あり, 73 , 2008, S235-S238 〔学会発表〕（計 9 件） ① Y. Igoshi, S. Ochiai1, E. Todaka, Y. Matsuno, N. Shimojo, Y. Kohno, C. Mo ri. Correlation between Polybrominate d Diphenyl Ethers (PBDEs) and Persist ent Organic Pollutants (POPs) or Heav y Metals Detected in Umbilical Cords. 50th Anniversary Annual Meeting & To xExpo, 2011.3.9, Washington, D. C. US A ② H. Miyaso, Y. Matsuno, M. Komiyama, ③ ④ ⑤ ⑥ ⑦ ⑧ ⑨ S. Ochiai, Y. Igoshi, C. Mori. The Ef fect of Neonatal Exposure to Deca-Bro minated Diphenyl Ether on Apical Ecto plasmic Specialization Mouse Testis. 50th Anniversary Annual Meeting & Tox Expo, 2011.3.7, Washington, D. C. USA C. Mori, E. Todaka, Y. Matsuno, T. F ujisaki, M. Shimoda, H. Nakaoka, M., Hanazato. Analysis Transfer Rate of C ongeners of PCBs and OH-PCBS From Mot her to Fetus Through Placenta in Huma n. 50th Anniversary Annual Meeting & ToxExpo, 2011.3.7. Washington, D. C. USA C. Mori, Y. Matsuno, H. Nakaoka, M. Hanazato, E. Todaka. Current fetal ex posure level of endocrine disruptors, heavy metals and brominated flame re tardants in Japan (Invited). ISES-ISE E 2010, 2010.8.30, Seoul, Korea C. Mori, E. Todaka, Y. Matsuno, H. N akaoka, M. Hanazato, S. Suzuki, N. Sh imojo, Y. Kono. Cohort study on infan t atopic dermatitis and fetal exposur e to persistent organic pollutants (P OPs), heavy metals and brominated fla me retardants (BFRs). The Power of Pr ogramming, 2010.5.7, Munchen, Germany Y. Matsuno, H. Fukata, Y Kawashiro, H. Takigami, H. Nakaoka, E Todaka, C. Mori. Concentrations of the total P BDEs in Japanese human blood. 5th Int ernational Symposium on Brominated Fl ame Retardants (BFR2010), 2010.4.8, Kyoto, Japan C. Mori. Association between exposure to organochlorines and the occurrence of atopic dermatitis in Japanese infant. ISES 2009 annual conference: transforming exposure science in the 21st century, 2009,11.2, Minneapolis, Minnesota, USA C. Mori, H. Fukata . Application of health examination system of total PCBs to prevental prenatal and lactational exposure of persistent organic polutants (POPs).3rd WHO international conference on children's health and the environment, 2009.6.8, Busan, Korea Mori C and Todaka E. Occurrence and control strategy of POPs - Japan experience. 2008 Conference on persistent organic pollutants and dioxin ,2008.9.5, Taipei, Taiwan 〔図書〕（計 2 件） ① C. Mori, E. Todaka. MARUZEN PLANET C o.,Ltd., Environmental contaminants and children's health Sustainable health s cience for future generations, 2011, 13 3 ② 森千里、戸髙恵美子、技術評論社、へその緒が語る体内汚染―未来世代を守るために―、 2008、207 ６．研究組織 (1)研究代表者森千里（MORI CHISATO）千葉大学・大学院医学研究院・教授研究者番号：90174375 (2)研究分担者小宮山政敏（KOMIYAMA MASATOSHI）千葉大学・大学院医学研究院・准教授研究者番号：70175339 戸髙恵美子（TODAKA EMIKO）千葉大学・予防医学センター・准教授研究者番号：30334212 松野義晴（MATSUNO YOSHIHARU）千葉大学・予防医学センター・准教授研究者番号：00376378