Ｘ線１分子構造動態情報 からの新しい創薬戦略 東京大学大学院 新領域創成科学研究科 物質系専攻 佐々木裕次 ファルマシュプール(株), 東北大学病院臨床試験推進センター 長谷川節雄 生物物理学領域 - 1分子計測分野の進歩が凄まじい Labeling Non-Labeling Myosin V Actin filament F1-ATPase Single Unit Observation Nature 386, 299 (1997) Prestroke state 30ms/f High-speed AFM Myosin V Nature 468, 7320 (2010) 次はmoreHigh-speed & 3D High-accuracy 3次元分子内部運動とは何か？ 構造が分かっているか？安定構造があるのか？ 単体での内部運動 結合後の内部運動 結合前後の内部運動 検出部位を指定 超高速(ナノ秒)超高精度(ピコメートル) 1分子内部運動情報は何をもたらすか！？ (1)分子内部運動という物理情報を初めて高精度に取得 (提案: 量から質への転換、化学計測から物理計測へ） (2) 分子内部運動を考慮した創薬や薬剤評価の可能性 (提案: 有効な分子内部動態を阻止する薬剤の登場) (3) 疾患の状況を分子内運動から評価・予測 (提案:１分子内部動態情報を新規バイオマーカーとして) 機能発現＝特徴的な分子内部運動 Ｘ線1分子追跡法の測定対象： (Diffracted X-ray Tracking: DXT) (1) 細胞上膜タンパク質分子(群) (2) タウタンパク質分子・Ａβ（天然変性系） (3) 膜上GPCR系 (4) 自己免疫系(TCR-MHC系) (5) DNA結合タンパク質分子 (6) 他の多くの機能性分子対象可 Principle: Diffracted X-ray Tracking (DXT) DXT monitors x-ray diffraction from the individual nanocrystal, which is linked to the individual single protein molecule in bio-systems. Features: (1) High Accuracy(-pm=nm/1000) (2) Time-resolved Information(from ms to ns) (3) in vivo Measurement (4) Independent from Chemical Conditions SR Laue Spots Laue Spot Movie Indicator Structural Change We assumed that motions of a specific site in individual proteins are equal to the observed orientations of nanocrystals. Two-Dimensional(q & c) Detection Tilting θ White X-ray Rotation White X-ray High-accuracy Angle Determination in DXT θ direction=1 mrad (0.057deg) χ direction=6 mrad (0.34deg) Visible light Technique→10deg. AFM→ 1deg. Big advantage of DXT χ DXT arrangement Sample PF-AR NW14A Image Intensifier V7739P (Hamamatsu Photonics) ID gap=15 mm ３x1014 photons/s/mrad/0.1%b.w. Beam size: (150x50μm) White X-ray heater polyimide film polyimide film Aqueous Solution Gold Nanocrysatal CCD: C4880-80(Hamamatsu photonics) Sample PF-AR NW14A (35-60mA) X-rays Protein 10mm gold Experimental Samples until Now: DNA NH2 SH Light Flash 35C Au Si/Mo Nanocrystal myosin C-terminal N-terminal GroEL/ES Actin filament KcsA Light Flash （280nm） b2-microglobulin GFP bR Important Targets: Membrane Proteins !! The gating mechanism of nAChR is not unclear. AChBP Neuron cell Dendrite elongation action potential Clustering of Receptor Sample of DXT: nAChR and AChBP Hetero(Homo)-Pentamer n Nicotinic Acetylcholine Receptors (nAChR) Diffracted X-ray Tracking (DXT) Sasaki et al., Phys. Rev. E 62, 3843–3847 (2000) Au Configuration of DXT for AChBP and nAChR Torpedo Experimental conditions ACh: acetylcholine BTx: α-bungarotoxin agonist desensitization antagonist Free FAST-DXT 100μs/f X-rays shutter experimental buffer BL40XU@SPring-8 Flux: 1015 photons/sec X-rays kapton film fast-shutter slit sample Image intensifier V5445P, Hamamatsu photonics 100 mm Max. time resolution 5 μs/f CMOS camera Photoron SA1.1 Gold Nano-crystal does not disturb functional motion free condition 40nm in diameter size of Au-crystal (a.u. Norm. Intensity) Non-Label Angular velocity 10-40％ decreased DXT movie & tracking trajectories χ θ beam stopper beam stopper θ χ beam stopper beam stopper χ DXT trajectories θ AChBP: 2D (θ, χ)-motion map 2軸分子内部運動ヒストグラムの見方： q β δ c c α q q α γ 0.1Å/ms 1.0Å/ms 10.0Å/ms （θ方向での換算運動幅） Quasi-in vivo (Interface) Observations x-ray ColQ Laminin Neural Agrin x-ray x-ray N-cadherins Neurexin Laminin Nanocrystal a-Dystroglycan Nanocrystal Nanocrystal Neuroligin MuSK nAChR Lrp4 β-Dystroglycan RATL Rapsyn Rapsyn AMPAR NMDAR Arcadlin Stargazin PSD-95 mGluR PSD-95 GKAP Nanocrystal Utrophin F-actin Homer Shank Cortactin F-actin Next Advanced Technology: (1)Labeling technique genetic operation (2)Simultaneously observation of two nanocrystals DXTをタウタンパク質分子に適応した例: (1)現在のアルツハイマー病バイオマーカーは脳脊髄液中タウ 蛋白質,その変化量のみでは早期診断法として不十分！ (提案:量から質への転換、免疫化学計測から物理計測へ） (2) タウ蛋白は異常な修飾で分子運動性変化が十分予想される！ (提案:高精度分子内部動態情報を新規バイオマーカーに) (3) 物質量のみでなく新規高感度疾患バイオマーカーの提案！ (提案:コンパクト装置で１分子内部動態情報を) ターゲット分子の質的変化： リン酸化、アセチル化 ユビキチン化、糖鎖付加、etc 色々な翻訳後修飾に対応 !! タウ蛋白のDXTデータ解析結果 His-tag tau (0N4R) q 標識ナノ結晶 c DXTデータ His-tag タウ蛋白の3次元(2軸)分子内部動態ヒストグラム (ビデオレイト) His-TagTau(2B11)– His-TagTau(non) 0.01Å 0.1Å 1.0Å （θ方向での換算運動幅） X線回折スポット90点からの解析 DXTでタウタンパク質分子内動態計測の新しさ！ (1)３次元1分子内部動態情報(新規バイオマーカー)をナノ秒レベル 検出できる方法はDXT法のみ(感度/安定性でFRETを凌駕)。 (2)ナノ結晶サイズやサンプル溶液粘性で運動速度が制御可能 （早い運動もゆっくり積算(秒)して検出可能を確認済み） (3)ラボＸ線光源を用いたDXT装置開発は、極めて画期的 （低速でも計測可能, 自作ナノ結晶回折高効率化を実現） DXT ELISA PET FRET FCS 高速1分子検出 ◎ × × ◎ ◎ 1分子内部動態 ◎ × × ○ △ 分子同定定量化 ◎ ◎ ○ ○ △ DXTの今後（専用BL化とラボ化の実現）: (1) アルツハイマー病以外にαシヌクレイン(パーキンソン病) TDP43(FTD, ALS) 等にも適応。早期診断と治療薬開発にも！ (2) 創薬を目的としたハイスループット分子動態促進/阻害剤探索 装置の開発やMD等の計算科学から分子動態予測との連携 (3) 天然変性タンパク質(Intrinsically Disordered Protein)研究 へのルーチン的利用へ波及 (4) 国内外でDXT専用放射光ビームラインを建設し世界普及 (5)「分子内部動態」をＸ線を用いない超小型計測法の考案/開発 DXT計測は今後に何をもたらすか？ ・構造と分子内部運動が最重要という認識 ・分子間相互作用を分子内運動から再考 ・分子内運動が新しいバイオマーカーに ・in vivoにおける分子内部運動の伝達は？ ・分子内部運動計測と分子内部計算の融合 ・ある分子内部運動を実現する人工分子創成
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