selection-de-so s-ressources

Journées Internationales sur la Désertification et le Développement Durable
SEL ECTI ON DE SOUCHES DE RHI ZOBI A POUR
PRESERVATI ON DES RESSOURCES VEGETAL ES
Dekkiche S.; Riah N.; M okr ani D., Benguedouar A.; Dj ekoune A.
Département de sciences de la nature, labo de biotechnologies. Université Mentouri,
Constantine. Algérie. [email protected]
RESUM E
L'amélioration de la fixation biologique de l'azote par association
symbiotique adaptée à des contraintes données est devenue l'une des
principales voies d'augmentation de la production agricole, ainsi que la
régénération de l'environnement dégradé. Dans ce but nous avons essayé de
sélectionner les meilleures souches de rhizobia capable d'une fixation
symbiotique d'azote dans des conditions bien données.
Ce travail réalisé consiste à l'isolement de bactérie nodulant la plante
Cicer-arietinum, à partir des nodules de cette plante légumineuse. Ceci est
suivi par une authentification et une caractérisation physiologique et
biochimique des isolats en présence de souches de référence ayant
différentes origines. Les résultats des tests de résistance, aux antibiotiques,
aux phages, ainsi qu'à certains facteurs extrinsèques ont permis de
sélectionner, par mis les isolats, trois souches faisant un bon choix pour la
production d'un inoculum de bonne qualité.
M ots clés : Nodules, Cicer - arietinum L., sélection, symbiose,
Environnement.
Du fait de leur grande importance dans la fixation biologique de
l'azote, les bactéries dites Rhizobia font l'objet de recherches
particulières qui débordent largement celui de l'agronomie ainsi que
la régénération de l'environnement dégradé. A cause de leur grande
valeur nutritionnelle, leur facilité de culture, leur grande résistance
aux stress hydrique et leur grande capacité symbiotique, nous avons
choisi la légumineuse Cicer-arietinum comme plante hôte. Grâce à
des approches génomiques et phénotypiques Nour et ses collègues
(1994 1995), et Jarvis et al (1997) ont pu classer les bactéries
isolées à partir de la plante Cicer - arietinum dans le genre
Mesorhizobium. Nous envisageons à faire davantage de recherches
avec beaucoup d'isolats pour sélectionner les souches les plus
performantes à infecter et à fixer l'azote atmosphérique. Ces
dernières feront l'objet d'un matériel de base pour produire un
inoculum local de bonne qualité.
Dans ce but nous nous limitons à suivre la performance
symbiotique avec la plante et à analyser les caractères
morphologiques et culturaux de plusieurs isolats, essayer d'avoir des
approches phénotypiques et biochimiques et ainsi pouvoir valoriser
les souches testées et sélectionner les meilleurs.
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M atér iel et méthodes
Tableau 1 : Différ entes souches bactér iennes testées
Bactéries
R. hedysari (A6)
Origine
géographique
Constantine
Source
DS 51
Constantine
Biotechnologie
ISN Cne
Objet de notre travail
DS 52
Constantine
Objet de notre travail
DS 61
Constantine
Objet de notre travail
R ciceri (CP 39)
Alep-Syrie
ICARDA- Alep (Syrie)
Australie
B. J. Rofle Canbera
(Australie)
Irlande
H. F. O GARA Cork
(Irlande)
J.Brockwell-Canbera
(Australie)
F. J. Ollero Seville
(Espagne)
R. leguminsarum bv trifolii
(843)
R. meliloti (CM 2)
R.hedysari CC1335
Australie
R.hedysari (I S 123)
Cadix
Espagne
Labo
Conditions de cultur e :
La culture bactérienne est réalisée à 30° C dans le milieu YMA
( Yeast Mannitol Agar ) dont la composition en gramme / litre est :
Mannitol (10), K2 Hp04 (0.5), Mg S04 7H20 (0.2), NaCl (0.1) et
extrait de
levure (04) ( Vincent,1970 ).D autres milieux sont
utilisés selon les testes appliqués à savoir : le Glucose peptone Agar
( GPA) : le Calcium-glycerophosphate et le 3-Cetolactose, une
solution nutritive de Ferheüs, le Mannitol nitrate Agar (MNA) et
des dilutions phagiques.
L isolement des bactéries est réalisée selon la technique de
Vincent ( 1970) ; Beck et al, (1993), les nodules collectés à partir de
la plante légumineuse ( Cicer arietinum L.), sont conservés par
dessiccation sous CaCl2 , stérilisés par leur immersion dans
l Ethanol à 95 % ( 5 à 10 secondes ) puis dans une solution de
Chloride de Mercure (MgCl2) acidifié à 0,1 % ( P/V ) pendant 3
mm et par leur rinçage plusieurs fois par de l eau distillée stérile.
Les nodules sont écrasés et le broyât est ensemencé sur milieu YMA
+ rouge de Congo. Pour distinguer entre le genre Rhizobium et
Agrobactérieum, les isolats ont subi deux tests : le test de
précipitation de Calcium glycérophosphate et celui du 3
cétolactose. Les bactéries sensées être du genre rhizobium sont
purifiées et conservées sur milieu YMA + CaC O3.
Authentification des isolats :
458
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Réalisée selon la technique de jarre de Léonard (Vincent; 1970).
Les graines de pois chiches sont stérilises par immersion dans
l Ethanol à 95 % puis dans une solution de Chloride de Mercure (
HgCL2) acidifié à 0,1 % pendant 3 m, les graines sont ensuite rincées
plusieurs fois par de l eau distillé stérile. Les grains germés sont
semés dans des Jarres contenant du vermiculite stérile et une solution
nutritive de Ferheüs, après 8 semaines, la nodulation est estimée.
Car actér isation bactér ienne
Utilisation de sour ce de car bone :
Les cultures sont réalisées sur YMA contenant 0.1% de
différents sucre : D. galactose, lactose, D. saccharose, D. glucose, D.
xylose, Sorbitol, le Mannitol a servi de témoin (Somasegaram et al
1985-1993).
Tempér atur e maximale de cr oissance et tolér ance au sel :
Les cultures bactériennes sont réalisées sur le milieu YMA à
différentes températures : 4°C , 20°C , 37°C, 40°C ( Nour et al,
1994) et à différentes concentrations au NaCl ( Struffi et al 1998).
Pr oduction d'enzymes:
Les bactériens sont testées pour l'hydrolyse de l urée, (
somasegaram et Hoben 1994), pour leur capacité de réduire les
nitrates ( vincent 1970 , Benguedouaret al,1993-1997), pour leur
activité
cellulolytique,
et
enfin
pour
leur
pouvoir
pectinolytique(Beeck et al 1993).
Résistance intr insèque aux antibiotiques
Les concentrations minimales inhibitrices (CMI) aux
antibiotiques, sont obtenues par la méthode de dilution de solutions
stocks pour des quantités appropriées d antibiotiques (Vincent,
1970 ; Somasegaram, et Hoben, 1994).
Test de phages
Ce test est réalisé selon la technique décrite par (Somasegaran et
al., 1994). Les suspensions phagiques sont déposées toutes sur la
même boite contenant les suspensions bactérienne en phase
exponentiel à raison de 5µl. L'inspection des boites est réalisée Après
une incubation de 24h- 48 h. La présence de plaque montre la
sensibilité de la bactérie au phage présent (Semasegaran et Hoben,
1994).
Résultats et discussion
Toutes les souches bactériennes testées montrent leur aptitude à
utiliser les différentes sources de carbone appliquées. Les trois
isolats DS51; DS52; DS61 ainsi que les souches de références
n exigent pas du Mannitol et peuvent assimiler toutes les sources de
carbone disponibles,
Elles peuvent réduire les nitrates en ammonique, hydrolysent
l'urée et possèdent toute une gamme d'enzymes grâce à la quel elle
peuvent résister a leurs environnement et infecter leurs plantes hôtes
à savoir la cellulase, la péctinase.
459
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Tableau 2 : Car actér isation des isolats et des souches de r éfér ence
Souches
Utilisation
de
sour ce de car bone
Mannitol
Glucose
Galactose
Maltose
D(+)Xylose
D(+)Saccharose
T 0 M aximal
Hydr olyse d ur ée
Activité
enzymatique
Nitrate réductase
Cellulase
Pectinase
Résistance aux
A6
I S123
CC13
335
843
CM 2
DS51
DS52
DS61
CP
39
+
+
+
+
+
+
40
+
+
+
+
+
+
+
37
+
+
+
+
+
+
+
37
+
+
+
+
+
+
+
37
+
+
+
+
+
+
+
40
+
+
+
+
+
+
+
40
+
+
+
+
+
+
+
40
+
+
+
+
+
+
+
40
+
+
+
+
+
+
+
40
+
+
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
60
20
60
10
2
250
50
50
80
15
2
220
40
50
80
8
4
250
40
50
80
10
1
200
60
20
100
10
1
250
50
30
120
20
24
280
40
30
120
20
2
300
50
40
120
20
2
300
60
50
100
10
3
250
antibiotiques
(CM I , ug/ml)
Viramycine
Streptpmycine
Péniciline
Chloramphinicol
460
Journées Internationales sur la Désertification et le Développement Durable
Oxatetracycline
Acide nalidixique
Le suivi de la croissance bactérienne montre que les colonies
sont apparues après 24 heures d incubation et le nombre maximal
des bactéries est obtenu entre 48 à72 h, (fig1), ceci permet de
conclure que les bactéries isolées sont à croissance rapide (Zaho et
al, 1984).
Tableau 3: Nombr e de nodules par plante
Fig. 1: Cr oissance des isolats et de la souche CP39 sur milieu YM B
dur ant 108 heur es d incubation.
1,2
1
0,8
0,6
DS51
0,4
DS52
0,2
DS61
CP39
0
0
2
4
8
18
24
36
42
72
96
Temps
108
Fig. 2 : Cr oissance des isolats et de la souche CP39 sur milieu
YM B à différ entes Concentr ation en Na Cl apr ès 48 heur es
Souches
DS
DS
Densités
1,2
12
Nbr optiques
4
1
Ecartype
(
DS
15
61
6 =540
22
DS
20
8
DS
51
15
DS
52
18
DS
11
15
DS
Log du nombre de
18
6 cellules /ml
0,8
DS51
0,6
DS52
0,4
DS61
CP39
0,2
0
0
0,1
0,5
1
2
3
5
10
Fig. 3: Evolution du nombr e de bactér ies Rhizobium au cour s du temps
différ entes tempér atur es apr ès 48 heur es d'incubation
461
Journées Internationales sur la Désertification et le Développement Durable
1,2
1
0,8
0,6
DS51
DS52
0,4
DS61
0,2
CP39
0
4
20
30
37
40
Les trois isolats DS52 DS61et DS51ont monté une tolérance
élevée concernant les facteurs extrinsèques appliqués dans ce travail.
En effet les isolats DS52 DS61 ont pu tolérer 5% de Na Cl et une
température de 40°C (fig. 2-fig3).
Il existe une variable dans le degré de tolérance aux
antibiotiques entre espèces de Rhizobium et même entre les souches
de la même espèce (Vincent 1970), ceci fait des antibiotiques un bon
trait pour comparer entre différentes souches bactériennes, dans ce
même but nous avons utilisé une gamme de concentration croissante
pour chaque antibiotique appliqué.
Excepté pour l Oxatétracilline et l ampicilline aux quels les
souches hydisari (CC1335) et melliloti (CM2) présentent
successivement la plus grande CMI (concentration maximale
inhibitrice), les isolats présentent un CMI supérieure ou égal à celle
des autres souches de références et réagissent de la même façon pour
chaque
antibiotique,
notamment
pour
la
pénicilline,
l Oxatetracycline, le chloramphinicol et l acide nalidixique.
Le phage aussi, est un excellent marqueur. En effet les
interactions entre les Rhizobiophages et leurs hôtes sont hautement
spécifique (Vincent 1970). D ailleurs le test phagique a été utilisé par
Somasegaran et al (1994) pour caractériser plusieurs souches de
Bradyrhizobium, et une rangée de Bactériophages a été appliquée
par Struffi et al (1998) pour différencier entre les souches d une
population de Rhizobium hydisarum. Nous l avons également
appliquée pour identifier les isolats et pour pouvoir sélectionner les
plus tolérantes.
Conclusion
L identification des bactéries isolées est basée sur des caractéristiques
phénotypiques (morphologiques et culturaux), et sur la performance
symbiotique.
Les trois isolats DS51; DS52; DS61 présentent les mêmes caractères
phénotypiques que ceux des souches de référence qui sont du genre
Rhizobium, en plus, nos isolats ont montré plusieurs comportements
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Journées Internationales sur la Désertification et le Développement Durable
identiques a celles du genre Mediterraneum notamment leur vitesse de
croissance, leur grande résistance au Na Cl, au chloramphénicol et à l acide
nalidixique (Garg et al, 1985 ; Nour et al 1994, Gaur et al, 1981). Les isolats
réagissent presque de la même façon pour chaque concentration
d antibiotique utilisé et vis a vis de chaque phage, donc il pourrait s agir
d une même souche de rhizobium algérienne mais ceci ne doit être confirmé
que par un moyen plus délicat.
Cependant nos isolats ont montré une variabilité concernant, La
résistance aux différentes température, et aux concentrations de sel
appliquées. En effet les bactéries DS51-DS52-et DS61ont montré la plus
grande résistance à ces deux paramètres. Sachant qu'elles ont montrées le
plus grand nombre nodules (15-22 nodule/plante) suite au test de nodulation,
nous pourrions les sélectionner pour production d'un inoculum dans le but
d'une bactérisation des champs de Cicer-arietinum.
L efficience des bactéries testées n a pas été suivie dans cette étude
mais les propriétés montrées par nos isolats, notamment leur résistance aux
facteurs extrinsèques et leur adaptation au sol, surtout leur grande résistance
à la concentration de NaCl variant de 3% (DS52) à 5% (DS51, DS61), fait
de ces bactéries feront un bon choix pour enrichir le sol algérien en azote
biologique et en particulier les sols irrigués par de l eau riche en sel.
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