Diapos

Mémoires et logique génétique
pour la détection d’événements rares
Jérôme Bonnet
Groupe de biologie synthétique
Centre de Biochimie Structurale,
Montpellier.
Ecole de Berder à Porquerolles, avril 2014
Types d’évenements
Persistent
Fréquent
Rare
Fugace
Exemple
Signal transient
?
1.Comment détecter des evenements rares et fugaces dans une
population cellulaire ou un organisme?
2. Quelle est l’influence à long terme de ces evenements sur les souspopulations exposées?
Systèmes synthétiques de mémoire biologique
1. Systemes de mémoire
“simples”
2. Systèmes mémoire à logique Boolèene
Temps
A
A
=
B
=
+
B
=
Mémoire en biologie
Cancer
Drosophila melanogaster
Comment encoder une mémoire biologique?
Epigenetique
Boucles de rétrocontrôle
Genetique
Recombinases
R1
Language visuel etc...
Composants génétiques
Promoteur: active la
transcription d’un gene
gene
Actions:
activation
inhibition
represseur
ADN
RNA pol
gene
RNA pol
R
gene
ARN
RNA pol
Proteine
gene
P
R
Mémoire à inhibition mutuelle
IN
Signal 1
OUT
R1
R2
Lysogénie
Lyse
Signal 2
Signal 1
0
R2
R1
Signal 2
R2
R1
1
Pour plus de détails, voir le petit livre: “a genetic switch” par Marc Ptashne
Détection et mémoire de l’endommagement de l’ADN
DNA
damage
R2
R1
Toman et al., 1985
reporter
Systèmes de mémoire autocatalytique
Activateur
transcriptionnel
Signal 1
A1
promoteur répondant au signal
A1
promoteur activé par
l’activateur A1
GFP
Ajo-Franklin et al., 2007
Systèmes de mémoire autocatalytique
A1
promoteur activé par
l’activateur A1
GFP
Ajo-Franklin et al., 2007
Mémoire autocatalytique
Signal
Ajo-Francklin et al., Gene & Dev., 2007
Memoire
https://www.youtube.com/watch?v=nlqltVI2jSc
Mémoire de l’endommagement de l’ADN
Burrill et al., 2011, 2012
Limitations des systèmes à boucle de rétrocontrole
Si les cellules se divisent trop rapidement,
dilution et perte de mémoire
La maintenance de la mémoire nécessite la synthése
constante de proteines: charge métabolique et nécessité
que la cellule soit vivante.
Options de lecture de l’état de la mémoire sont limitées:
expression génique uniquement.
L’ADN présente de nombreux avantages
Facilement
Heritable
stable
Grotte de Rouffignac, ~13. 000 Av. JC
Modes de lecture Rapporteur (GFP) PCR sequencage
Voir aussi: Bancroft et al., 2001; Ham et al., 2007;
Les bacteriophages: experts en manipulation d’ADN
10
31
Phages sur terre
IN
OUT
See also, Hambly & Suttle, 2005
Integration du bacteriophage
Phage
Genome
Integrase
attP
attB
attP
attP
attP
attB
attB
attB
Bacterial
Genome
grase
attL
attP
Bacterial
Bacterial
Genome
Genome
Integrase
Integrase
Integrase
Integrase
Integrase
Integrase Binding ++
+
Integrase
Excisionase
Excisionase
Excisionase
Integrase
attR
Prophage
Phage
Genome
Phage
Phage
Genome
Genome
Phage
Genome
attL
attL
attR
attR
attL
Prophage
Prophage
attL
attP
attB
attP
attB
attB
Phage
Genome
Phage
Genome
Bacterial
Genome
Bacterial
Genome
Bacterial
attP
attP
attP
attB
attB
attP
attB
attB
Phage
Phage
Genome
Genome
Phage
Integrase
Genome
Phage
Genome
attL
Bacterial
Bacterial
Genome
Genome
Bacterial
Genome
Bacterial
Integrase
Integrase
Genome
Bacterial
Genome
Integrase
+
Excisionase
attR
Prophage
Integrase
Integrase
Integrase
Genome
+ Break and Exchange ++
Integrase
Integrase
Integrase
Excisionase
Excisionase
Excisionase
Integrase
Integrase
+
Integrase
+
+
Excisionase
Excisionase
attR + attL
attR
attL
attR
Excisionase
Excisionase
Prophage
Prophage
Prophage
attL
attR
See
also: Grindley et al, 2006.
attR
L’orientation des sites
de recombinaison détermine le résultat de la reaction
P
B
P
B
INVERSION
Integration
Excision
L
R
L
See also: Reyes et al., 1979 ; Pollock and Nash, 1983; Podhajska et al., 1985
R
Inversion pour le controle de l’expression des genes
Ham et al, 2006
Friedland et al., 2009
Ecriture et stockage in vivo d’information numérique dans l’ADN
Bonnet, et al, 2012.
Ecriture et stockage in vivo d’information numérique dans l’ADN
integrase
promoter répondant à un
signal environemental
Bonnet, et al, 2012.
Ecriture et stockage in vivo d’information numérique dans l’ADN
Microscope
recombination sites
RFP
GFP
0
integrase
promoter répondant à un
signal environemental
% Cel
40
20
0
Bonnet, et al, 2012.
Ecriture et stockage in vivo d’information numérique dans l’ADN
Microscope
recombination sites
GFP
RFP
0
Microscope
Signal
Int
integrase
RFP
GFP
1
promoter répondant à un
signal environemental
% Cel
40
20
0
Bonnet, et al, 2012.
SORT
Stabilité du stockage ADN
FP
G
100
80
60
40
t₀= State 0
20
0
t₀= State 1
0
20
40
60 80 100 120
Generations
% of Switched Cells
104
% of Cells Switched
t
F
100
t₀= State 0
80
t₀= State 1
60
40
20
0
0
20
40
60
80 100 120
Generations
Cas particulier:
réponse autonome a des combinaisons rares d’évenements
Evenements nonnécessairement rares...
Mais rarement
observes ensembles...
Ou rarement observés
séparément
Utile pour les cas dans lesquels on veut une réponse cellulaire autonome:
destruction, synthése de molécule therapeutique in situ...
Boole, Shannon, transistors et portes logiques
George Boole
1854
AND
NAND
Claude Shannon
1937
NOT
OR
NOR
XOR
XNOR
A B sortie
0 0
0
0 1
0
1 0
0
1 1
1
Table de vérité
Ingénierie d’un transistor génétique
Transistor
Transcriptor
Control signal
Control Signal
Transcriptor
Transcriptor
asymmetric
terminator
recombination
sites
DNA
Int
Exemple: porte AND
AND gate
RNA
Polymerase
T
Control Signal #1
T
Control Signal #2
Exemple: porte AND
AND gate
Integrase 2
T
T
T
Control Signal #1
T
RNA
Polymerase
Integrase 1
Control Signal #2
Portes logiques a mémoire
Bonnet et al, 2013.
Public domain
Transmission de messages a ADN
Ortiz and Endy, JBE, 2012
Transmission de messages a ADN
Ortiz and Endy, JBE, 2012
recombination
control unit
M13 helper phage
Int A
D
AN
logic element
GFP
M13 ori
I-A
Int B
I-B
logic element
AND
M13 ori
Transmission de messages a ADN
M13 ori
Predi
GFP fluorescence (% max)
20
40
60
80 100
11
0
0
0
1
ATc
AND
0.8
0.8
AND
0.6
0.6
M13 ori
I-B
logic element
0
0
1
1
Architecture
0.4
0.4
GFP
I-A
0
1
0
1
0.2
0.2
D
AN
Int B
0000001111001111
Int A
ARA ATC OUT
00
M13 helper phage
logic element
AND
recombination
control unit
−0.2
−0.2
Truth
Table
Gate
Ara
ARA ATC OUT
11
0.8
0.8
0.6
0.6
0.4
0.4
0.2
0.2
0000
NAND
00
−0.2
−0.2
0 0 1
1 0 1
0 1 1
ATc
Ortiz and Endy, JBE, 2012
Figure 2: Programmable in vivo Boolean
of Recombinase Functions
Amplification du signal a travers une population cellulaire
Production de phage
activée par l’évènement
Transmission de
l’information aux autres
cellules de la population
Limites des systemes actuels
1. Pas acces aux echelles de temps tres courtes
2. Le signal est limité aux sources transcriptionnelles
3. Limité aux signaux que l’on connait...
Merci!
Diapositives supplémentaires
Monod, 1961:Théorie de motifs de circuits génétiques a
rétrocontrole pour l’etablissement de la differentiation!
inhibition mutuelle
rétrocontrôle positif
Monod & Jacob, 1961
Mémoire séquentielle a ADN (1)
Comportement du systeme dependant de son histoire
Temps
A
+
B
+
C
=
A
+
C
+
B
=
B
+
A
+
C
=
Mémoire séquentielle a ADN (2)
A
Int A
A
Voir Ham et al., 2007
Int A
Integrase B
Int B
B
Int B
B
Int B
A
Integrase A
Int A
B
Probleme: ambiguité! plusieurs configurations nécessaires ou plus de recombinases
Mémoire séquentielle a ADN (2)
A
Int A
A
Voir Ham et al., 2007
Int A
Integrase B
Int B
B
Int B
B
Int B
A
Integrase A
Int A
B
Probleme: ambiguité! plusieurs configurations nécessaires ou plus de recombinases
Mémoire séquentielle a ADN (2)
A
Int A
A
Voir Ham et al., 2007
Int A
Integrase B
Int B
B
Int B
B
Int B
A
Integrase A
Int A
B
Probleme: ambiguité! plusieurs configurations nécessaires ou plus de recombinases
Chromatin silencing in yeast
http://2008.igem.org/files/presentation/UCSF.pdf
iGEM UCSF 2008
References (1)
Mémoire rétrocontrôle
1. Ptashne M (2004) A Genetic Switch (Cold Spring Harbor Lab Press, Cold Spring
Harbor, NY).
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Cold Spring Harbor Symposia on quantitative Biology 26, 389-401 .
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Escherichia coli induced by DNA-damaging agents. J Mol Biol 186:97–105.
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1;25(5):434-9.
Phages, recombinaison
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nucleosome-like structure in site-specific recombination of bacteriophage lambda. J Mol Biol 170:1–18.
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vivo: Construction of the heat-pulse-activated att-nutL-p-att-N module. Gene 40:163–168.
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system utilizing thefim inversion recombination switch. Biotechnol. Bioeng. 94, 1–4.
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recombination switch for heritable sequential genetic memory. PLoS One 3:e2815.
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8. Bonnet J, Subsoontorn P, Endy D. Rewritable digital data storage in live cells via engineered control of
recombination directionality. Proc Natl Acad Sci U S A. 2012 Jun 5;109(23):8884-9.
9. Bonnet J, Yin P, Ortiz ME, Subsoontorn P, Endy D. Amplifying genetic logic gates. Science. 2013 May
3;340(6132):599-603
10. Ortiz ME, Endy D. Engineered cell-cell communication via DNA messaging. J Biol Eng. 2012 Sep 7;6(1):16.

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