PCSI Brizeux Fiche TP : CCM Altmayer-‐Henzien 2014-‐2015 CONTRÔLE DE LA PURETÉ D'UN PRODUIT : CHROMATOGRAPHIE SUR COUCHE MINCE I -‐ Principe La chromatographie est une méthode physique de séparation basée sur les différences d'affinité des substances à analyser à l'égard de deux phases, l'une stationnaire ou fixe, l'autre mobile. Selon la technique chromatographique mise en jeu, la séparation des composés entrainés par la phase mobile, résulte soit de leur adsorption et de leur désorption successives sur la phase stationnaire (chromatographie d’adsorption), soit de leur solubilité différente dans chaque phase (chromatographie de partage). Dans le cas de la Chromatographie sur Couche Mince (CCM), la phase fixe est un adsorbant solide et la phase mobile est un solvant. Elle repose principalement sur des phénomènes d’adsorption. La phase stationnaire est constituée de silice (ou parfois d’alumine), déposée sous la forme d’un gel sur une plaque de verre ou de plastique, d’où le terme couche mince. La phase mobile appelée éluant, monte le long de la plaque par capillarité. 1. La phase fixe : l’adsorbant L'adsorbant se présente sous la forme d'une couche mince d'oxydes en poudre, généralement de silice (SiO2, acide) ou d'alumine (Al2O3, basique) finement divisée, d'épaisseur uniforme, étalée soit sur un support d'aluminium ou en plastique (plaques à usage unique) La silice, comme l'alumine, sont des composés extrêmement polaires ; les substances polaires seront fortement adsorbées par suite des interactions dipôle-‐dipôle et les substances peu polaires seront, au contraire, peu retenues par l'adsorbant, donc entraînées par l'éluant. La silice et l’alumine pourront engager avec les substances déposées des liaisons hydrogène. La seule différence entre la silice et l’alumine est de type acido-‐basique : la silice est acide, elle fixe donc (trop) les bases. L’alumine est plutôt neutre à basique. On évitera donc la silice pour les bases et l’alumine pour les acides. 2. La phase mobile : l’éluant Les substances à analyser interagissent non seulement avec la phase fixe mais aussi avec la phase mobile. Elles sont plus ou moins entraînées par l'éluant qui met en jeu deux types de forces : • La première force, dite force d’élution, est due à la dissolution c'est-‐à-‐dire que les solutés ont tendance à se dissoudre dans l'éluant et à migrer avec lui. • La seconde force, dite force de déplacement, est due à un phénomène de déplacement : les molécules d'éluant cherchent les mêmes sites d'adsorption que les molécules de solutés et déplacent ainsi ces dernières. Un éluant peu polaire entraîne donc les substances les moins retenues par l’adsorbant donc les moins polaires. Et une substance polaire, fortement adsorbée sur la phase fixe (polaire) sera donc bien entraînée par un éluant fortement polaire. L’éluant sera un solvant organique, ou mieux un mélange de solvants organiques, choisi souvent par tâtonnements pour conduire à la meilleure séparation. Le pouvoir éluant d’un solvant est sa capacité à entrainer des substances polaires retenues par l’adsorbant ; d’où le classement suivant : Pouvoir éluant croissant II -‐ Réalisation 1. Préparation et migration » Préparer à l'avance une cuve fermée avec environ 0,5 cm d’éluant, afin que la cuve soit saturée en vapeurs d'éluant et ainsi éviter l'évaporation de l'éluant à la surface de la plaque. PCSI Brizeux » » Fiche TP : CCM Altmayer-‐Henzien 2014-‐2015 Préparer les échantillons à déposer en solubilisant tous les produits à déposer dans un solvant volatil (une pointe de spatule dans 1 mL). Dépôt sur la plaque : à 1 cm du bas de la plaque tracer la ligne de dépôt avec un crayon à papier sans mettre ses doigts sur la plaque. Déposer à l'aide d’un tube capillaire sur la ligne de base une ou deux gouttes des substances pas trop près des bords ; il est important que le diamètre de la tache soit faible (idéalement moins de 3 mm). Si les taches sont incolores, vérifier à l’UV que la quantité déposée permet le contrôle de la migration. Puis la plaque est placée presque verticalement dans l'éluant; attention au début l'éluant doit être au dessous de la ligne de base. Une fois la plaque introduite dans la cuve, la cuve ne doit plus être déplacée ! boîte de Petri bécher plaque x ligne de base » » x x dépôt des substances s éluant L'éluant monte par capillarité et au passage sur les tâches, entraîne plus ou moins les constituants : c'est le développement. Arrêter la migration à 1 cm du bord supérieur de la plaque, sortir la plaque, marquer le front du solvant avec un trait de crayon et laisser sécher (au sèche-‐cheveux éventuellement) front de l'éluant x H x x h ligne de base La migration d'une substance dans un éluant donné est caractérisée par le rapport frontal noté Rf, défini par : distance parcourue par la substance h R! = = distance parcourue par le solvant H Si les taches sont bien circulaires, la hauteur h est calculée au centre de la tache Le Rf dépend de la nature du produit, de l'éluant et du support, mais il ne dépend pas de la distance parcourue par l'éluant. Par suite, sur un support donné, avec un éluant donné, le Rf est caractéristique d'un produit. 2. Révélation Lorsque les composants analysés sont incolores on doit rendre les tâches visibles par un procédé de révélation. Les méthodes usuelles sont les suivantes: » Radiations UV (254 nm) : On repère les composés porteurs de systèmes conjugués ou aromatiques. Le principe de révélation par observation sous lampe UV nécessite l’utilisation de plaques sur lesquelles a été déposée un indicateur fluorescent absorbant dans l’UV et réémettant dans le visible (ici dans le vert). Lorsqu’on éclaire la plaque par un rayonnement UV approprié, le fluoresceur émet de la lumière et l’observateur voit la plaque lumineuse (ici verte). Si des espèces absorbantes dans l’UV sont présentes sur la couche de silice, le fluoresceur reçoit beaucoup moins de rayonnement UV et réemet moins : la plaque apparait donc sombre. » Iode: l'iode réagit avec les composés organiques comportant une ou plusieurs insaturations, en formant des complexes jaunes ou bruns. La révélation est réalisée en mettant la plaque préalablement séchée dans un bécher contenant des cristaux d'iode.
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