Presentazione standard di PowerPoint

LA TECNOLOGIA
SANGER SEQUENCING
RICERCATORE TEAM LEADER:
DOTT.SSA VELCA BOTTI
WORKSHOP - MERCOLEDÌ 17 SETTEMBRE 2014, LA SALLE, CENTRO DI RICERCA SCIENTIFICO-NATURALISTICO DEL MARAIS
CENNI
STORICI
1953: scoperta del DNA (Watson e Crick)
1977: metodo di Sanger per il sequenziamento del DNA
(pubblicazione della prima sequenza completa del batteriofago ϕX174)
1984: decifrata la sequenza del virus Epstein-Barr
1987: Applied Biosystems commercializza il primo sequenziatore
completamente automatico
1990: National Institute Health (USA) promuove sequenziamento dei genomi
E. coli, S. cerevisiae, C. elegans
1990: Progetto Genoma Umano (si conclude nel 2003, con 8 anni di ritardo)
Fine del millennio: avvento delle tecnologie Next Generation Sequencing
2014: Sanger sequencing ancora ampiamente utilizzato (lab che non necessitano di
alta processività e che richiedono sequenze di circa 800 basi)
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COS’E’
IL SANGER SEQUENCING
E’ una tecnologia del sequenziamento del DNA che permette di determinare
l’ordine dei diversi nucleotidi e quindi delle quattro basi azotate (adenina, timina,
citosina e guanina) che costituiscono l'acido nucleico.
Il sequenziamento del DNA è considerato uno strumento essenziale per la ricerca
biologica per correlare il genotipo di un organismo al suo fenotipo.
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IL SANGER SEQUENCING:
REAZIONE ENZIMATICA
Reazione detta anche cycle sequencing che ricorda in maniera sostanziale
la PCR (Polymerase Chain Reaction)
dNTP
(desossigunaosina trifostafato)
ddNTP
(didesossigunaosina trifostafato)
Nel momento in cui l’enzima DNA polimerasi incorpora ddNTPs nella
catena nascente si determina l’ARRESTO DELLA SINTESI: per questa
ragione la tecnica di Sanger viene anche detta metodo dei terminatori
di catena.
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LA LETTURA DEL PRODOTTO
DEL SANGER SEQUENCING
Oggi il DNA così ottenuto viene letto in moderni sequenziatori automatici a capillari
come quello in dotazione all’Unità di Ricerca VDNA Barcoding (AB 3500,
Lifetechnologies).
sequenziatori automatico a 8 capillari
elettroforesi a capillari
elettroferogramma
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APPLICAZIONI:
INDAGINE DEL DNA
MITOCONDRIALE
 MEDICINA: studio di patologie umane in cui è
coinvolto il DNA mitocondriale (DIABETE, CANCRO
ecc.), studio dei meccanismi dell’invecchiamento
 MEDICINA FORENSE: strumento per tracciare la
matrilinearità
 PALEONTOLOGIA: per valutare l’origine e l’evoluzione
umana
 STUDIO DELLA BIODIVERSITA’: per indagare le specie
viventi
DNA BARCODING
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APPLICAZIONI: DNA BARCODING
 DIFESA DEI CONSUMATORI
•
per la tracciabilità dei prodotti agroalimentari
(intesa come corrispondenza fra le specie animali
e vegetali dichiarate come ingredienti di un prodotto)
 RISPETTO DELLE NORME DOGANALI
•
•
per analisi di prodotti sospetti
per impedire il commercio di specie protette da
convenzioni internazionali
Birstein V. J. et al. 2000.
Polyphyly of mtDNA
lineages in the Russian
sturgeon, Acipenser
gueldenstaedtii: forensic
and evolutionary
implications.
Conservation Genetics
Domingo-Roura X. et al. 2006.
Badger hair in shaving
brushes comes from protected
Eurasian badgers.
Biological Conservation
 MONITORAGGIO AMBIENTALE
•
•
per stilare liste specifiche per il monitoraggio
della salute del territorio
per l’identificazione precoce di specie
aliene/invasive
Cini et al. 2012
A review of the invasion of
Drosophila suzukii in Europe
and a draft research agenda
for integrated pest
management.
Bulletin of Insectology
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APPLICAZIONI: DNA BARCODING
 VALORIZZAZIONE DELLE
COLLEZIONI MUSEALI
Puillandre N. et al. 2012.
New
taxonomy
and
old
collections: integrating DNA
barcoding into the collection
curation process.
Molecular Ecology Resources
 MEDICINA FORENSE
Bruni I. et al. 2010
• per analisi di sostanze biologiche
causa di avvelenamenti umani e animali
Identification of poisonous
plants by DNA barcoding
approach.
Int J Legal Med.
Veratro comune
 ENTOMOLOGIA FORENSE
• per il riconoscimento di larve
di insetti che colonizzano i cadaveri
Meiklejohn, K. A. et al. 2013
DNA barcoding identifies all
immature life stages of a
forensically important flesh fly
(Diptera: Sarcophagidae)
Journal of Forensic Sciences
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APPLICAZIONI:
MICROBIOLOGIA
 IDENTIFICAZIONE MICROBICA (batteri, virus, funghi)
 MONITORAGGIO DI MICRORGANISMI AMBIENTALI
 INDIVIDUAZIONE DI MICRORGANISMI PATOGENI
 TEST DI ROUTINE PER VALUTARE CONTAMINAZIONI BATTERICHE
genotipizzazione batterica
genotipizzazione fungina
gene 16S del rRNA
regione D2 del gene 26S del
rRNA
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