I metodi RFLP SSCP

I metodi
•
•
•
•
Restriction fragment lenght polymorphism
(RFLP)
RFLP
SSCP/DGGE/TGGE
Ibridazione con sonde oligonucleotidche
Sequenziamento Preceduti da amplificazione
Eventuale clonaggio
• DNA microarrays
• Pyrosequencing
RFLP
Prodotto della PCR delle sequenza di interesse
Purificazione e quantificazione
Digestione con l’enzima scelto (concentrazione, tempo, temperatura)
Elettroforesi in gel di agarosio
Digestione con più enzimi di restrizione
Confronto di amplificati di ceppi diversi
SSCP
Normale
Denaturazione
Singoli filamenti
Forme differenti
per la presenza di
mutazioni
Mutato
T
A
G
C
T
G
A
C
Gel
Mobilità differente
Mutazione
1
SSCP
• Sensibilità:
– 70-95% mutazioni (<200 pb)
– 50% mutazioni (>400 pb)
Parametri:
–
–
–
–
–
DGGE/TGGE
• Diversa migrazione elettroforetica del
singolo filamento
– In gradiente di denaturazione chimico
– In gradiente di temperatura
Temperatura
Concentrazione del tampone
Concentrazione di acrilamidde
Presenza di additivi
Marcatori
DGGE
– Purificazione del prodotto della
PCR
– Determinazione del profilo di
melting e del gradiente di
denaturazione
DGGE
• Formula di Fodde e Losekoot
– % di denaturante=(3,2xTm)182,4
– Clamp
DGGE
• Vantaggi
– Alta sensibilità
– Sonde radioattive: NO
– Possibilità di ottimizzare il sistema
Svantaggi
– Tempi per la messa a punto del sistema
– Clamp
– Possibilità di ottimizzare il sistema
– Dimensioni dei frammenti (max 500 pb)
– Localizzazione mutazione: NO
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Sequenziamento
• Metodo di Maxam e Gilbert
Limiti del Metodo
Sequenziamento
• Metodo di Sanger
Limiti del Metodo
– Scarsa riproducibilità
– Scarsa riproducibilità
– Materiale radioattivo
– Materiale radioattivo
– Sequenze brevi
– Sequenze brevi
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Marcatura
• Fluorocromo dell’infrarosso
• Fluorocromi : fluoresceina, Texas red, ecc.
Sequenziatori automatici
• Modulo elettroforetico
– Raggio laser
– Fotodiodi
– Piastra termostatica
• Modulo per l’alimentatore
• Computer
– Software
Sequenziatori
ABI PRISM 310, 3100, 8000
• Tecnologia per il sequenziamento
automatico in elettroforesi capillare
• Terminatori fluorescenti a trasferimento
di energia
• Cycle Sequencing
• Controllo del sistema
• Analisi ed elaborazione dati
Sequenziatori
8000 (BECKMAN)
CEQTM2000,
DNA microarrays
• Cycle Sequencing
• Marcatori: ddNTP marcati in fluorescenza
• Tecnologia dell’elettroforesi capillare
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“formati”
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Pyrosequencing: principio
(DNA)n +dNTP
(DNA)n+1+ PPi
polymerase
Analisi dei dati
• Allineamento delle
sequenze
• Confronto con sequenze
di riferimento (banche
dati)
• Elaborazione dei dati
– NCBI
(www.ncbi.nlm.nih.gov/)
– EMBL (www.emblheidelberg.de)
– Blast, Fasta, Phylip,
Neighbor-Joining Method
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