lezione 4

Strumenti della Genetica Molecolare Umana (2)
Capitoli 7-8
Prof. Mario Ventura
La stringenza di una PCR
Anche la PCR come le ibridazioni puo’ essere vincolata dalla
stringenza che in questo caso e’ definita dalla capacita’ dei primer di
legarsi al DNA target.
In questo caso la temperatura e’ il principale fattore influenzante la
stringenza e quindi specificita’ della reazione di PCR. Alte temperature
implicano maggiore stringenza, basse temperature minore stringenza.
A parita’ di temperatura e’ possibile avere piu’ bande ... come mai?
I primer possono legarsi oltre che al sito per i quali sono stati
disegnati anche a minore efficienza in altri loci del genoma e cio’
comporta che la PCR abbia bande aggiuntive e non sia specifica.
Prof. Mario Ventura
PCR per la ricerca di delezioni (ΔF508)
PCR di una regione di 100pb che comprende la sequenza deleta e
corsa su gel di poliacrilammide
controllo
++
ΔF508/+
ΔF508/
ΔF508
ΔF508
Prof. Mario Ventura
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PCR nella tipizzazione dei polimorfismi dei
siti di restrizione
questo metodo identifica SNPs (single nucleotide polymorfisms)
Prof. Mario Ventura
SNPs
La sostituzione di una base puo’ provocare la perdita o l’insorgenza di un sito di
restrizione, utilizzando PCR e digestione dell’amplificato si puo’ rapidamente
evidenziare l’avvenuto cambiamento senza utilizzare il southern, il radioattivo etc..
1241bp
750bp
491bp
X CX C X CX T X CX C X CX C
Prof. Mario Ventura
L’allele XT e XC sono distinguibili
dopo digestione con TaqI.
L’amplificato e’ di 1241 bp dopo
digestione se e’ presente la
sostituzione si hanno 2 bande
Utilizzo degli SNPs
• SNPs nella regione codificante di un gene, alterando la struttura di una proteina, possono
essere la causa di disordini monogenici ereditati in maniera dominante
sono routinariamente usati a scopo diagnostico
•  SNPs che alterano la struttura primaria di una proteina coinvolta nel
metabolismo di un farmaco
bersagli dell’analisi farmacogenetica
•  SNPs nelle regioni non-codificanti del genoma, quindi senza impatto
sul fenotipo dell’individuo
markers usati in genetica di popolazione e negli studi di evoluzione
Prof. Mario Ventura
PCR allele specifica-ARMS (equivalente a ASO)
Trova applicazione per individuare
specifiche e NOTE mutazioni patogene
in un sistema che nel complesso e’
detto ARMS, Amplification refractory
mutation system)
Il sitema differisce dagli
ASO per la localizzazione
del “nucleotide rivelatore”
IMP. Il test ARMS puo’ essere inteso
semplicemente come la possibilita’ di
amplificare in modo specifico un allele,
non necessariamente deve essere inteso
come raffronto tra i due prodotti di PCR
Prof. Mario Ventura
Test per mutazioni note
Ricerca di mutazioni puntiformi: ARMS
(Amplification Refractory Mutation System):
si eseguono 2 reazioni di PCR in parallelo IN 2 PROVETTE
in una i primer sono entrambi per la sequenza normale,
nell’altra un primer e’ un ASO specifico per la mutazione.
Si ha la banda di amplificazione solo se entrambi i primer si
appaiano.
Di solito il test e’ multiplex utilizzando primer che permettano
di vedere piccole variazioni nella corsa elettroforetica.
Prof. Mario Ventura
PCR allele specifica-ARMS (equivalente a ASO)
Mutazione NOTA (C  T) in un gene voglio scoprire lo stato di eterozigosi o
omozigosi dei miei samples. Costruisco tre primers: Primer forward G (finisce al 3’
con una G); primer forward A (al 3’ A) e un primer reverse CON (che si lega in una
porzione non mutata del gene). Chiamo PCRG quella con la combinazione dei
primer G-CON e PCRA quella con combinazione dei primer A-CON.
Sample 1
Sample 2
Sample 3
PCRG
SI
SI
NO
PCRA
NO
SI
SI
Genotipo
C/C
C/T
T/T
IMP. Il test ARMS puo’ essere inteso semplicemente come la possibilita’ di
amplificare in modo specifico un allele, non necessariamente deve essere inteso
come
raffronto
tra i due prodotti di PCR.
Prof. Mario
Ventura
Esempio di ARMS (multiplex)
per la ricerca delle mutazioni in
CF
• 3 pazienti (1,2,3)
• Primer normali APOB e OTC (controlli positivi)
• Primer ASO (11m.puntiformi,1ΔF508wt 1ΔF508m)
• In un sistema di PCR multiplex
Per il paziente1: provetta A con APOB+OTC+DF508m+ 5 mutazioni m1, m2, m3, m4,m5
Per il paziente1: provetta B con APOB+OTC+DF508wt+ 6 missenso m6, m7, m8, m9, m10, m11
quali sono i primer specifici di DF508N e quali quelli di DF508M?
Prof. Mario Ventura
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ARMS per la ricerca delle mutazioni in CF
PCR con primer multipli in ogni provetta e controlli per geni non
correllati a CF, l’amplificato viene caricato su gel di agarosio il DNA
proviene da affetti
ApoB
A:
5 alleli
+ ΔF508
Mutato
+OTC
+ApoB
Mutaz
Mutaz
B:
6 alleli
+ ΔF508
Normale
+OTC
+ApoB
ΔF508 OTC
A
1
Prof. Mario Ventura
B
A
2
B
A
B
3
1 SANO
2 2 ALLELI CON MUTAZIONE PUNTIFORME
3 1 ALLELE DELETO E 1 CON MUTAZIONE PUNTIFORME
PCR per la tipizzazione di STRs
(short tandem repeats)
Esempio di tipizzazione di unita’ CA
Nota: nelle cellule il sistema e’ instabile. Espansioni
a carico di questi loci avvengono con elevata
frequenza e cio’ comporta instabilita’ della regione
stesas. Nell’individuo troveremo cellule conun grado
diverso di amplificazione
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Microsatelliti o short tandem repeats (STRs)
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Microsatelliti o short tandem repeats (STRs)
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Esempio
utile per la
definizione
di aplotipo
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Applicazioni pratiche del fingerprinting del DNA
1. Paternity and Maternity
Because a person inherits his or her VNTRs from his or her parents, VNTR patterns can be used to
establish paternity and maternity. The patterns are so specific that a parental VNTR pattern can be
reconstructed even if only the children's VNTR patterns are known (the more children produced, the
more reliable the reconstruction). Parent-child VNTR pattern analysis has been used to solve standard
father-identification cases as well as more complicated cases of confirming legal nationality and, in
instances of adoption, biological parenthood.
2. Criminal Identification and Forensics
DNA isolated from blood, hair, skin cells, or other genetic evidence left at the scene of a crime can be
compared, through VNTR patterns, with the DNA of a criminal suspect to determine guilt or innocence.
VNTR patterns are also useful in establishing the identity of a homicide victim, either from DNA found
as evidence or from the body itself.
3. Personal Identification
The notion of using DNA fingerprints as a sort of genetic bar code to identify individuals has been
discussed, but this is not likely to happen anytime in the foreseeable future. The technology required to
isolate, keep on file, and then analyze millions of very specified VNTR patterns is both expensive and
impractical. Social security numbers, picture ID, and other more mundane methods are much more likely
to remain the prevalent ways to establish personal identification.
Prof. Mario Ventura
PCR per espansione di ripetizioni
trinucleotidiche
Sca2/+
Sca2/+
+/+
SCA2
Gel di poliacrilamide
Primer della regione
fiancheggiante il sito di espansione
in SCA2
(Atassia spinocerebellare 2)
La tripletta e’ CAG, e’ in un esone
ed e’ mutazione piena da 41 a 81
espansioni.
Normale
Prof. Mario Ventura
Trasmissione: Autosomica
dominante
PCR per Corea di 60
Hungtinton (HD)
Gli alleli normali
arrivano fino a 29.
Ci sono raramente gli
intermedi fino a 35.
I patologici sono oltre
36.
46
48
44
42
40
33
19
18
Prof. Mario Ventura
18
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Ricerca di Mutazioni
(sara’ approfondito in identificazione geni-patologici in uomo)
Spesso la ricerca di mutazioni non si avvale di un solo metodo ma di piu’ strategie
combinate tra loro. Alcuni esempi si possono trovare nell’identificazione di mutazioni
associate ad amplificazione di triplette.
PCR utilizzando:
sia fiancheggianti l’espansione (si puo’ non avere amplificazione e si ricorre ai
Southern blot)
sia primer nella sequenza trinucleotidica, la regione di espansione (si genera una
“ladder” per lo scivolamento durante la replicazione)
 
 
 La regione di espansione puo’ fornire indicazioni su: livello di espansione e quindi sull’insorgenza
del fenotipo patologico
 La PCR e’ risolutiva nel caso delle premutazioni in cui l’espansione e’ limitata o in quei casi in cui
anche la mutazione piena non raggiunge grande dimensioni (Corea, SCA...di solito quelle con CAG
poliglutamina).
ATT.NE Nel caso di espansioni molto ampie la Taq polimerasi puo’ non amplificare oppure la
sequenza rende difficile la costruzione di primer appropriato.In questi casi per avere conferma della
presenza della mutazione si ricorre al Southern blot di genomico digerito con enzimi di restrizione
Prof. Mario Ventura
DOP-PCR
PCR ideata per rendere possibile l’amplificazione di numerosi prodotti
anche a sequenza nucleotidica non nota.
Si puo’ utilizzare per amplificare l’intero genoma
In questo caso e’ nota la sequenza aminoacidica!
Prof. Mario Ventura

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