Microscopia vibrazionale coerente

S APIENZA U NIVERSITÀ DI R OMA
FACOLTÁ DI S CIENZE M ATEMATICHE , F ISICHE E N ATURALI
C ORSO DI L AUREA IN F ISICA
M ICROSCOPIA VIBRAZIONALE COERENTE
Tesi di Laurea Triennale in Fisica
Relatore
Prof. Tullio Scopigno
Laureando
Valeria Venturini
(matricola 1466919)
Anno Accademico 2013/2014
Introduzione
La microscopia è una tecnologia chiave che permette di caratterizzare gli oggetti
nelle scienze della vita. Il nostro concetto di mondo fisico è strettamente legato a
quello che vediamo intorno a noi, infatti, per la gran parte della storia, le osservazioni
venivano fatte esclusivamente per mezzo dell’occhio umano, sensibile ad una piccola
parte dello spettro elettromagnetico e alle dimensioni tipiche degli oggetti che ci
circondano, molto diverse dal mondo microscopico e macroscopico. Si scoprì che,
guardando l’universo con una luce diversa ovvero con lunghezze d’onda invisibili
per l’occhio umano, si riescono a vedere nuovi tipi di oggetti; si osservano ad esempio
galassie, stelle e buchi neri con i telescopi a raggi x e una cosa analoga accade per
il mondo microscopico. Dalla scoperta delle proprietà delle lenti, già descritta da
Seneca più di Duemila anni fa, fino alla scoperta dei microscopi avvenuta tra la fine
del Sedicesimo e il Diciassettesimo secolo in Germania, ci si interessò sempre più
al mondo microscopico. Nel Diciannovesimo secolo ci fu un notevole sviluppo dei
microscopi, grazie alla loro commercializzazione (attribuita a Carl Zeiss), che furono
usati intensivamente per fare imaging biologico e cellulare. Questo non forniva
però informazioni chimiche, indispensabili per capire le proprietà microscopiche dei
materiali [5]. Parallelamente, nel 1928 fu teorizzato e scoperto l’effetto Raman, per
merito di Raman e del suo assistente Krishnan, per cui vinsero il Nobel per la Fisica
nel 1930. É l’effetto di diffusione anelastica della radiazione elettromagnetica da
parte della materia a causa dell’interazione con i moti rotovibrazionali di essa, che si
traduce nell’emissione di luce a frequenza diversa di quella incidente; la sua versione
stimolata, in cui si utilizza un ulteriore impulso luminoso, è alla base dei processi
di Coherent Raman Scattering (CRS). Quando i due laser sono in risonanza con una
caratteristica frequenza vibrazionale del campione, tutte le molecole oscillano in fase:
la coerenza vibrazionale rende la risposta del Raman di molti ordini di grandezza
più grande di quella Raman spontanea. Alla base di questi processi vi è l’interazione
non lineare tra luce e materia del terzo ordine nella suscettività elettrica: bisogna
considerare gli effetti non lineari quando le intensità in gioco sono così alte che il
potenziale di richiamo degli elettroni non è più nell’approssimazione armonica e
quindi la polarizzazione P (t) è espressa in serie di E(t).
La microscopia vibrazionale coerente, ottenuta combinando un microscopio con
uno spettrometro Raman, sotto le condizioni del CRS, fornisce tecniche di imaging
non invasivo e label-free che si basano solo sulle vibrazioni molecolari, contrasto
chimico naturale. L’analisi vibrazionale unita alla microscopia permette infatti di sondare le vibrazioni dei materiali a scala submicrometrica o anche di singola molecola.
Essa trova notevoli applicazioni in numerosi campi come la biochimica (nello studio
della struttura delle cellule e dei cambiamenti che avvengono a causa di fattori [19]),
biomedicina (studiando le differenze tra tessuti sani e malati), scienza dei materiali,
i
farmacologia e beni culturali (per lo studio dei pigmenti pittorici [18]) anche se il
futuro del Raman è, secondo molti, nel settore biologico e medico. In particolare,
recenti ricerche mostrano l’utilizzo dell’ SRS per studiare i tumori celebrali [20] e
l’utilizzo del CARS per lo studio delle cellule cancerose in tessuti mammari umani
[9]. Negli ultimi 50 anni il progresso delle scienze dalla vita è stato spinto in avanti
dalla comprensione dei meccanismi biologici a livello molecolare. Ogni componente
biologico è caratterizzato da uno spettro vibrazionale che riflette la propria struttura
interna in termini di proprietà chimiche. Le applicazioni in questi campi sono favorite dal fatto che l’acqua è praticamente Raman-trasparente, motivo per cui l’elevata
presenza di acqua in questi materiali non è un problema.
Questa dissertazione si propone di dare una introduzione alla microscopia vibrazionale coerente dandone un background teorico (effetto Raman; CARS, SRS, RIKES)
seguito poi da una parte sperimentale: l’esperimento, condotto all’ IIT, consiste in
uno spettro CARS ed uno spettro RIKE con la tecnica della Balanced Detection (BD)
su acetone. É suddivisa in tre capitoli più le conclusioni:
Capitolo 1 è dedicato all’effetto Raman, spontaneo e stimolato, descritto secondo
trattazioni classiche.
Nel Capitolo 2 si cerca di dare un background teorico all’interazione non lineare tra
campo elettromagnetico e materia e poi alle tecniche spettroscopiche di CRS: CARS
(e alla soppressione del contributo non risonante), SRS e RIKES e alla sua versione
BD-.
Il Capitolo 3 è dedicato alla parte sperimentale: si descrive l’apparato sperimentale,
si riportano e commentano i risultati ottenuti.
ii
Indice
Introduzione
ii
1
Effetto Raman
1.1 Raman spontaneo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.2 Raman stimolato . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1
1
3
2
Spettroscopia Raman Coerente
2.1 Interazione non lineare luce-materia . . . . . . . .
2.2 CARS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2.2.1 Soppressione del contributo non risonante
2.3 SRS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2.4 RIKE(S) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
2.4.1 BD-RIKE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3
4
Apparato sperimentale e risultati ottenuti
3.1 Apparato sperimentale . . . . . . . . .
3.1.1 Operazioni preliminari . . . . .
3.1.2 OPO . . . . . . . . . . . . . . .
3.2 Risultati ottenuti . . . . . . . . . . . . .
3.2.1 CARS . . . . . . . . . . . . . . .
3.2.2 BD-RIKE . . . . . . . . . . . . .
3.2.3 Confronto e conclusioni . . . .
Conclusioni
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5
6
7
10
12
13
15
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17
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17
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19
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20
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20
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20
. . 21
.
22
28
iii
Capitolo 1
Effetto Raman
Nel 1928 C.V. Raman e K.S. Krishnan pubblicarono un articolo su Nature, A
New Type of Secondary Radiation [1], per cui vinsero il Nobel nel 1930, nel quale dimostrarono l’ effetto Raman. Partendo dall’osservazione dell’effetto Compton, nel
quale i raggi X, in seguito allo scattering anelastico sugli elettroni perdono energia,
ipotizzarono che si potesse verificare una simile perdita anche quando la luce è
diffusa dalle molecole. Il nuovo tipo ti scattering necessitava radiazione luminosa
con intensità molto elevate, motivo per cui questo tipo di spettroscopia si diffuse
negli anni Settanta.
L’effetto Raman è il fenomeno di diffusione anelastica della radiazione elettromagnetica da parte del campione, a causa dell’interazione con i moti rotovibrazionali
delle molecole ed è per questo motivo che ci fornisce informazioni sulla struttura
molecolare e chimica di un campione. Approsimativamente lo scattering anaelastico
è uno in dieci milioni rispetto a quello elastico (Rayleigh) e pertanto si ha bisogno
di laser con una potenza elevata ed impulsi ultracorti ovvero dello stesso ordine di
grandezza delle transizioni vibrazionali delle molecole.
1.1
Raman spontaneo
Facendo incidere una radiazione monocromatica a frequenza ω0 su un campione,
essa interagisce con i moti roto-vibrazionali delle molecole e si osserva che parte
della luce incidente è diffusa alla stessa frequenza (scattering Rayleigh) mentre una
percentuale minore subisce diffusione anelastica ed è diffusa a frequenza più bassa
(scattering Stokes) o più alta (scattering anti-Stokes) di quella incidente. La diffusione
anelastica avviene a ω0 ± Ω, dove Ω è una delle frequenze vibrazionali delle molecole. Il fotone diffuso da parte di una molecola può guadagnare o perdere energia e
pertanto è diffuso a energia più alta o più bassa di quella iniziale.
Quando il fascio a ω0 incide sul campione, esso induce una fluttuazione dei contributi
elettronici alla polarizzabilità ed è da queste interazioni che si generano i fotoni a
frequenza ωs e ωas quindi affinchè una molecola sia Raman-attiva deve poter avere
un cambiamento nella polarizzabilità [4] (che si traduce in un cambiamento nella
forma o nell’orientazione della nuvola elettronica). La frequenza incidente ω0 deve
essere diversa dalle frequenze in assorbimento del sistema, altrimeni l’effetto Raman
è completamente schermato dall’assorbimento, e deve essere molto maggiore delle
frequenze rotazionali e vibrazionali del sistema perchè se così non fosse, la luce
1
CAPITOLO 1. EFFETTO RAMAN
2
incidente non riuscirebbe a vedere la vibrazione e la rotazione, ma solo la loro media
nel tempo.
Cerchiamo dunque di capire, in prima approssimazione e con argomentazioni classiche, cosa accade nel Raman spontaneo quando una radiazione monocromatica a
frequenza ω0 incide su una molecola e perchè si hanno i contributi Stokes e anti-Stokes.
Il momento di dipolo indotto dal campo elettrico è:
p(r, t) = α · E(r, t)
(1.1)
dove α è il tensore di polarizzabilità e r è la coordinata macroscopica del sistema.
Assumendo che le molecole non siano libere di ruotare, si può considerare il campione
composto da un insieme di oscillatori armonici di coordinata vibrazionale Qk e,
considerando un solo moto vibrazionale di frequenza Ω, si può espandere il tensore
polarizzabilità in serie di Taylor rispetto alle cordinate Qk intorno alla configurazione
di equilibro α0 :
α ≈ α0 +
∂α
∂Q
+
0
1 ∂ 2α
2 ∂Q2
1
+ ... = α0 + α0 Q + α0 Q2 + ..
2
0
(1.2)
dove i valori calcolati in 0 sono calcolati nella posizione di equilibrio. In approssimazione armonica, l’equazione del moto per le coordinate Qk è
d2 Q
dQ
+ 2γ
+ ω02 Q = 0.
2
dt
dt
Trascurando il termine di smorzamento, ammette come soluzione
Q(t) = Q0 cos (Ωt + δ) .
(1.3)
(1.4)
Sostituendo la 1.4 nella 1.2 e fermandosi al primo ordine dello sviluppo in serie si
ottiene:
α = α0 + αk Q0 cos (Ωt + δ) .
(1.5)
Sia inoltre E(r, t) = E0 cos (ω0 t). Inserendo questa espressione e la 1.5 nella 1.1 e si
ottiene l’espressione per p
p = α0 E0 cos (ω0 t) + α E0 Q0 cos (ω0 t) cos (Ωt + δ)
(1.6)
che tramite le formule trigonometriche di Werner diventa:
p = p (ω0 ) + p (ω0 − Ω) + p (ω0 + Ω) .
(1.7)
É evidente che il dipolo elettrico indotto è formato da tre componenti distinte in
frequenza ed in particolare non oscilla solo alla frequenza del campo incidente ω0 ma
anche, per effetto Raman, a ωs = ω0 − Ω e ωas = ω0 + Ω.
Le righe anti-Stokes sono più deboli di quelle Stokes perchè, a causa del fattore di
Boltzmann, gli stati eccitati sono meno popolati di quello fondamentale. Chiamando
N1 le molecole nello stato 1 di energia E1 , N2 le molecole nello stato 2 di energia
E2 > E1 e sia T la temperatura, si ha:
E −E
N2
− 2 1
= e KB T
N1
(1.8)
CAPITOLO 1. EFFETTO RAMAN
3
Figura 1.1: Schema dei livelli energetici e delle corrispondenti linee in frequenza.
Dal punto di vista molecolare, lo scattering Raman spontaneo comporta il passaggio da uno stato i ad uno stato f attraverso lo stato v che può appartenere ad un
pacchetto di stati stazionari (in tal caso si parla di Raman risonante) o essere virtuale.
Il fotone incidente non è propriamente assorbito dalla molecola perchè ω0 non corrisponde alla differenza energetica tra gli stati iniziale e finale. Dalla conservazione
dell’energia segue che:
Ei = Ef → scattering Rayleigh
Ei < Ef → scattering Stokes
Ei > Ef → scattering anti-Stokes
Il Raman spontaneo non è un effetto lineare rispetto al campo che lo produce e per
questo motivo il segnale è debole e molto meno intenso rispetto ai fenomeni lineari
come l’assorbimento o la fluorescenza (difficile da distinguere dal Raman, se non per
le componenti anti-Stokes), che nella pratica possono schermare completamente lo
spettro. Inoltre nello studio di dinamiche ultraveloci è necessario utilizzare sorgenti
impulsate di durata sufficientemente breve rispetto ai processi fisici e chimici e
pertanto si ha un allargamento spettrale del segnale che compromette la risoluzione
in frequenza. Dal principio di indeterminazione energia-tempo si ricava che per
risolvere righe spettrali di ≈ 15cm−1 bisogna utilizzare impulsi di durata ∆t > 1ps.
1.2
Raman stimolato
Per superare le limitazioni del Raman sponteneo (bassa sezione d’urto, difficoltà
negli esperimenti nelle scale di tempo tipiche dei processi ultraveloci, competizione
con processi lineari) si introduce l’utilizzo di un ulteriore fascio. Con questa tecnica
si riesce a collezionare rapidamente gli spettri vibrazionali ad alta risoluzione sulla
scala dei tempi del f s [7], sia per lo stato elettronico fondamentale che per quelli
eccitati. L’idea è quella di far incidere sul sistema impulsi luminosi di durata molto
CAPITOLO 1. EFFETTO RAMAN
4
minore dei tempi caratteristici di transizione: in questo modo si scompone il moto
continuo in una serie di fotogrammi.
Il processo di scattering Raman stimolato (SRS) si verifica quando i due fasci di luce,
la pompa Raman a frequenza ωp e lo Stokes probe a frequenza ωS vanno ad incidere su
un campione con frequenza vibrazionale ωvib = Ω = ωp − ωs . Si ottiene luce coerente
diffusa collinearmente al probe con sezione d’urto di diversi ordini di grandezza e
proporzionale all’intensità dello Stokes.
Figura 1.2: Schema dei livelli energetici del Raman spontaneo (a) e stimolato (b). In quello
stimolato si utilizza un solo campo d’interazione.
Bisogna quindi introdurre un termine forzante nell’equazione 1.3 che diventa:
dQ
d2 Q
+ 2γ
+ ω02 Q = αk |E(r, t)|2
(1.9)
2
dt
dt
Il campo totale E(r, t) è dato dalla somma del campo del pump E(r, t)p = Ep eiωp t
e dello Stokes probe E(r, t)s = Ep eiωs t . Si ottiene quindi:
|E(r, t)|2 = |Ep |2 + |Es |2 + Ep E∗s ei(ωp −ωs )t + E∗p Es e−i(ωp −ωs )t .
(1.10)
Gli utlimi due termini oscillano a Ω = ωp − ωs ed esercitano quindi una forza di risonanza che mette in moto coerente la vibrazione delle molecole. I fotoni sono emessi
collinearmente al probe e questo permette di selezionare la direzione di acquisizione
e di migliorare il rapporto segnale rumore.
Una versione particolarmente utilizzata dell’ SRS, che permette di sondare un’ampia
zona dello spettro con il probe è ottenuta con una pompa Raman a banda stretta,
quindi lunga nel tempo, e un probe ultracorto, ovvero stretto in frequenza. Si ottengono una serie di picchi sullo spettro dello Stokes probe in corrispondenza delle
frequenze vibazionali del campione e si misura il Raman Gain (RG)
RG =
∆IS
IS0
(1.11)
in funzione di Ω dove IS0 è l’intensità del probe e ∆IS è la differenza del segnale con
la pompa Raman accesa e spenta.
Capitolo 2
Spettroscopia Raman Coerente
Lo Scattering Raman Coerente (CRS) è un tipo di spettroscopia e microscopia
che evita l’utilizzo di marcatori e che restituisce una firma chimica specifica della
molecola, basata sulle sue vibrazioni molecolari caratteristiche. La spettroscopia
coerente, basata sulla spettroscopia Raman, impiega più fotoni per selezionare le
vibrazioni molecolari e produce un segnale coerente di ordini di grandezza più
intenso dell’emissione Raman spontanea. La risoluzione spaziale in xy del Raman
spontaneo e del Raman coerente è la stessa e corrisponde al limite di diffrazione1 .
Rispetto all’asse z invece, nel caso coerente la risoluzione aumenta grazie alla non
linearità del fenomeno e nel caso spontaneo è aumentata grazie all’utilizzo dei
microscopi confocali 2 .
Le tecniche di spettroscopia Raman coerenti sono divise in due step distinti. Nel
primo step un set di laser ognuno a diversa frequenza, ma la cui combinazione lineare
corrisponde alla frequenza vibrazionale del campione, incide su di esso e induce uno
stato collettivo di vibrazione coerente. A differenza del Raman spontaneo in cui la
fase con cui ogni molecola oscilla è casuale, nelle tecniche di CRS le molecole oscillano
con la stessa fase e quindi in maniera coerente. Nel secondo step, un altro impulso,
l’impulso di probe, interagisce con il campione e modula la coerenza vibrazionale
generata alla stessa frequenza o a una frequenza diversa di quella degli impulsi
del primo step. Nelle tecniche CRS con due laser coinvolti nel primo step, chiamati
pump (ωp ) e Stokes (ωs ), la condizione per la quale le due frequenze devono essere in
risonanza con la frequenza vibrazionale del campione si traduce nella condizione
ωp − ωs = Ω . Nel secondo step, il probe a ωpr , spesso degenere con uno dei precedenti,
fa si che l’intero processo è un four-wave mixing process perchè ωp − ωs + ωpr = ωCRS .
1
Un sistema ottico con la capacità di produrre immagini con risoluzione angolare al limite teorico
dello strumento è definito diffraction limited ovvero è limitato dalla sola diffrazione. Ogni sistema
ottico ha quindi un limite imposto da questo fenomeno e non può essere ulteriormente perfezionato
[16]. Al contrario, il potere risolutivo di questi sistemi ottici può esser limitato da numerosi fattori tra
cui l’imperfezione degli elementi ottici utilizzati o il loro male allineamento.
2
Il microscopio confocale è un microscopio ottico che si basa su una tecnologia volta ad accrescere
sensibilmente la risoluzione spaziale del campione, eliminando gli aloni dovuti alla luce diffusa dai
piani fuori fuoco del campione [17].
5
CAPITOLO 2. SPETTROSCOPIA RAMAN COERENTE
2.1
6
Interazione non lineare luce-materia
L’effetto dell’interazione tra campo elettromagnetico e materia è la dislocazione di
elettroni che, per campi deboli, è approssimabile come lineare, P (t) = 0 χ(1) E(t) dove
χ(1) è la suscettività lineare. Per campi di intensità maggiore l’elettrone è dislocato
dalla posizione di equilibrio e pertanto il potenziale di richiamo non può più essere
considerato armonico e la polarizzazione è in generale espressa in serie di E(t) ([2])
P (t) =
0
χ(1) E(t) + χ(2) E 2 (t) + χ(3) E 3 (t) + ...
(2.1)
dove la quantità χ(n) corrisponde alla suscettività elettrica di ordine n. P è dunque la
funzione di E che descrive la risposta del mezzo attraversato dall’onda elettromagnetica caraterrizzata dal campo E. La suscettività lineare al primo ordine spiega tutte le
proprietà ottiche standard dei materiali come rifrazione e riflessione, assorbimento
ed emissione di un fotone. Quella del terzo ordine, di cui sfrutteremo le proprietà, è
una caratteristica di ogni materiale e spiega fenomeni come la generazione di terza
armonica, l’interazione a quattro onde, l’assorbimento a due fotoni ecc.
In ottica non lineare la polarizzazione varia nel tempo ed è quindi anch’essa sorgente
di campo elettromagnetico. Applicando le equazioni di Maxwell possiamo scrivere:
∂ 2 E(z, t)
1 ∂ 2 E(z, t)
∂ 2 P (z, t)
−
=
µ
(2.2)
0
∂z 2
c2 ∂t2
∂t2
dove la polarizzazione è composta da un contributo lineare e da uno non lineare
P (z, t) = PL (z, t) + PN L (z, t).
(2.3)
PN L = pN L ei(ω0 t−kp z) ,
(2.4)
Esprimendo PN L come
considerando un campo quasi monocromatico
E(z, t) = A(z)ei(ω0 t−k0 z)
(2.5)
e facendo alcuni conti sotto la condizione di lente variazioni del campo, si ottiene
l’equazione che descrive la propagazione degli impulsi luminosi in mezzi non lineari
e che tiene conto degli effetti di relazione di fase differenti tra la polarizzazione non
lineare e il campo elettrico.
∂A(z, t)
1 ∂A(z, t) i
∂ 2 A(z, t)
µ0 ω 0 c
=−
+ GV D
−i
pN L (z, t)e−i∆kz
2
∂z
vg ∂z
2
∂z
2n
(2.6)
Il primo termine del secondo membro descrive la propagazione nei materiali che
avviene alla velocità di gruppo definita come
vg =
1
∂k
∂ω ω0
(2.7)
ed il secondo descrive la dispersione tramite il group velocity mismatch definito
come
CAPITOLO 2. SPETTROSCOPIA RAMAN COERENTE
GV D =
∂ 2k
∂ω 2
7
(2.8)
ω0
Se GV D = 0 infatti, durante la propagazione nel materiale, l’impulso mostra un
allargamento e quindi un calo nella potenza di picco. Infine il termine legato alla
polarizzazione non lineare mostra che essa può modificare il campo elettrico.
L’effetto Raman è un processo del terzo ordine [13] quindi χ(3) = 0 e
P (3) (t) =
(3) 3
0 χ E (t)
(2.9)
A questo è direttamente legato il four-wave mixing process (FWM). Nel caso in cui i
quattro fotoni coinvolti sono legati dalla legge di conservazione
ω4 = ω1 − ω2 + ω3 .
(2.10)
e sostituendo l’espressione della polarizzazione non lineare dei quattro campi
nell’equazione 2.6 si ottiengono le equazioni (accoppiate) del FWM:
 ∂A1 (z,t)
= −iα1 χ(3) A∗2 (z, t)A3 (z, t)A4 (z, t)e−i∆kz

∂z


 ∂A2 (z,t) = −iα χ(3) A∗ (z, t)A (z, t)A (z, t)e−i∆kz
3
4
2
1
∂z
(2.11)
∂A3 (z,t)
(3)
 ∂z = −iα3 χ A1 (z, t)A2 (z, t)A∗4 (z, t)e−i∆kz


 ∂A4 (z,t)
= −iα4 χ(3) A1 (z, t)A2 (z, t)A∗3 (z, t)e−i∆kz
∂z
Queste equazioni mostrano come l’evoluzione di ogni campo dipenda dall’
accoppiamento con gli altri tre in assenza di dispersione.
αi =
3 ωi
.
8 cni
(2.12)
αi è la costante nonlineare di accoppiamento e il fattore numerico 3/8 deriva dal
fattore degenerativo. La condizione di phase mismatch
∆k = k1 + k2 − k3 − k4
(2.13)
legata alla perdita di segnale deve essere minimizzata ovvero ∆k → 0, che
rappresenta, al limite, la conservazione del momento (phase matching).
Utilizzeremo la 2.11 per descrivere CARS, SRS e RIKES.
2.2
CARS
Lo scattering Raman coerente a frequenza anti-Stokes (Coherent Anti-Stokes Raman
Sscattering) è un processo non lineare del terzo ordine realizzato tramite l’interazione
a quattro onde nel quale sono necessari tre campi elettromagnetici a frequenza ω1 , ω2
e ω3 per generare un segnale a frequenza ω4 . Generalmente si usa un solo segnale a
frequenza ω1 = ω3 per eccitare il campione. Definiamo:
ω1 = ω3 = ωp
ω2 = ωs
(2.14)
CAPITOLO 2. SPETTROSCOPIA RAMAN COERENTE
8
ω4 = ωas
dove ωp , ωs e ωas sono rispettivamente le frequenze di pump, Stokes e anti-Stokes.
A differenza del Raman spontaneo la spettroscopia CARS impiega più fotoni per
selezionare le vibrazioni molecolari e produce un segnale coerente. Questo comporta
che il segnale prodotto è diversi ordini di grandezza più intenso rispetto a quello
dell’emissione spontanea.
L’interazione è coerente se è realizzata in condizioni di risonanza, ovvero se
ωp − ωs = Ω
(2.15)
dove Ω è la frequenza vibrazionale propria delle molecole. Il segnale anti-Stokes
generato da questa configurazione ha una frequenza pari a:
ωas = 2ωp − ωs .
(2.16)
I fotoni di pump e Stokes popolano selettivamente gli stati eccetitati e i fotoni
del secondo fascio di pump, chiamato probe, sono diffusi in maniera anelastica
dallo stato vibrazionale generando così i fotoni alla frequenza di anti-Stokes, come è
mostrato nel diagramma energetico.
Figura 2.1: a) Diagramma energetico; b) conservazione del momento (phase matching); c)
output in frequenza.
Applichiamo il FWM process ai tre segnali:
 ∂A (z,t)
p
(3) ∗
−i∆kz

 ∂z = −iαp χ Ap (z, t)As (z, t)Aas (z, t)e
∂As (z,t)
= −iαs χ(3) A2p (z, t)A∗as (z, t)e−i∆kz
∂z

 ∂Aas (z,t)
= −iαas χ(3) A2p (z, t)A∗s (z, t)e−i∆kz
∂z
(2.17)
dove la condizione di phase mismatch è
∆k = kas − (2kp − ks )
(2.18)
Considerando che il segnale CARS è generato alla frequenza anti-Stokes, utilizziamo solo la terza delle equazioni della 2.17 per ricavare l’andamento dell’intensità
del segnale di output. Integriamo quindi sulla lunghezza del campione L:
L
L
dAas (z, t) = −iαas χ(3) A2p (z, t)A∗s
0
e−i∆kz dz.
0
(2.19)
CAPITOLO 2. SPETTROSCOPIA RAMAN COERENTE
9
La soluzione del 2.17 è:
Aas (L, t) = −iαas χ(3) A2p (z, t)A∗s e−i∆kL/2 sinc(
∆kL
)
2
(2.20)
che corrisponde ad un’intensità pari a
2
2
Ias = |Aas (L, t)|2 = αas
χ(3) Is Ip2 sinc2 (
∆kL
)
2
(2.21)
É importante osservare che il segnale di CARS è proporzionale alla funzione
sinc che è grande solo nel limite ∆k
π, limite per cui tende dalla δ di Dirac. In
condizioni di perfetto phase matching la sinc tende ad 1, condizioni raggiunte se la
focalizzazione dei segnali di pump e Stokes è perfetta, altrimensi il segnale di CARS
è decrescente.
2
Un’ altra importante proprietà è nella dipendenza dal χ(3) perchè la suscettività
può essere decomposta nel contributo risonante χR e in quello non risonante χN R :
χ(3) = χ(3)R + χ(3)N R .
(2.22)
Il contributo risonante, quello interessante da un punto di vista spettroscopico, è:
χ(3)R ∼
N
ωp − ωs − Ω − iΓ
(2.23)
dove Γ è la larghezza a mezza altezza della riga Raman. Questo contributo è massimo
in condizioni di risonanza ovvero quando la differenza ωp − ωs coincide con la
frequenza vibrazionale del campione Ω. Dividendo il contributo risonante nella sua
parte reale e immaginaria si ottiene che
ICARS ∝ χ(3)R + χ(3)N R
2
2
2
(3)R
= χ(3)R + χ(3)N R + 2χ(3)N R χRe .
(2.24)
Il termine risonante contiene informazioni quantitative e chimiche riguardo al
campione mentre il termine non risonante dipende dalle proprietà elettroniche del
materiale e, lontano dalle risonanze elettroniche, è indipendente dalla frequenza e
strettamente reale, ma non è invariante spazialmente in un campione eterogeneo.
Questo può essere rimosso con delle tecniche di soppressione. L’ultimo termine
mostra invece l’interferenza tra il contributo risonante e quello non risonante. Questo
impedisce di conoscere direttamente il termine risonante, producendo forme di
dispersione come possiamo vedere nella figura 2.2.
Ricapitolando:
• Dato che χ(3)R ∝ N allora ICARS ∝ N 2 dove N è il numero di molecole Ramanattive pertanto è difficile rilevare concentrazioni poco abbondanti.
• La presenza del contributo non risonante fa si che vi è una parte di segnale,
indipendente dalla frequenza, che può distorcere o coprire del tutto il segnale,
tramite il termine puramente non risonante e tramite quello di interferenza.
• L’aspetto favorevole è che il segnale CARS, privo di un background lineare, è
generato alla frequenza anti-Stokes e può pertanto essere selezionato dal campo
di eccitazione tramite un filtro opportuno.
CAPITOLO 2. SPETTROSCOPIA RAMAN COERENTE
10
Figura 2.2: a) diagramma energetico del contributo non risonante; b) differenti contributi al
segnale CARS.
2.2.1
Soppressione del contributo non risonante
La presenza del contributo non risonante impedisce al CARS applicazioni più
ampie e sensibili quindi si sono sviluppati numerosi metodi per la soppressione del
contributo non risonante.
• FM-CARS (Frequency Modulation CARS): il contributo risonante del CARS è legato alle vibrazioni molecolari e appare solo quando la condizione di risonanza
dettata dalla 2.15 è soddisfatta, mentre il contributo non risonante è costante
in un range di frequenze più ampio. Variando quindi lo Stokes a partire dalla
frequenza di risonanza, il CARS diminuirà improvvisamente mentre il contributo non risonante resterà invariato. Con un amplificatore Lock-in si modula
la frequenza di Stokes su due valori diversi ωS1 = ωS e ωS2 in modo da avere
due output: per la prima si visualizzerà il segnale CARS e il NRB mentre per la
seconda si visualizzerà solo il NRB.
Figura 2.3: Input e output del FM-CARS
• I-CARS (Interferometric CARS): utilizzando un altro segnale detto local oscillator
a frequenza ωLO = ωCARS e ricordando che Eas ∝ Ep2 Es∗ χ(3) allora il segnale
CARS sarà proporzionale a
CARS ∝ (|Eas | + |ELO |)2 = |Eas |2 + |ELO |2 +
(3)
(3)
(3)
sin ϕ
+ 2ELO Ep2 Es∗ Re χN R + χR
+ 2ELO Ep2 Es∗ Im χR
cos ϕ+
(2.25)
CAPITOLO 2. SPETTROSCOPIA RAMAN COERENTE
11
dove ϕ è la differenza di fase tra il CARS e il LO: scegliendo ϕ = 90o il contributo
risonante immaginario è massimizzato mentre il contributo reale risonante e
non-risonante è minimizzato; il primo termine può essere trascurato perchè
|Eas |
|ELO | e il secondo termine è costante. In queste condizioni si sonda
Imχ(3) e si rivela quindi il NRB. Questo metodo è complicato perchè il setup
sperimentale richiede la sincronizzazione di tre impulsi.
• Tr-CARS (Time resolved CARS): il ritardo temporale tra pump e Stokes, in condizioni di risonanza, crea una coerenza vibrazionale, che decade esponenzialmente nel tempo in poche centinaia di femtosecondi, sondata dal probe dopo
un tempo τ . Il contributo non-risonante decade istantaneamente, quindi questo
metodo permette di rivelare il segnale risonante tramite un opportuno ritardo τ , ma è generalmente accompagnato da una attenuazione significativa del
contributo risonante.
Figura 2.4: a) Diagramma energetico del Tr-CARS; b) decadimento del CARS dovuto dal
rilassamento vibrazionale.
• P-CARS (Polarization CARS): sfrutta le differenti proprietà di polarizzazione
del contributo risonante e non-risonante. Assumendo il pump polarizzato
lungo l’asse x e lo Stokes ruotato ruotato di un angolo φ rispetto ad esso ed
in condizioni di risonanza, è indotta la polarizzazione del terzo ordine. La
polarizzazione lineare e non lineare sono dirette in due direzioni diverse e
quindi, ponendo un analizzatore nella direzione perpendicolare a quella di P N R
il contributo non risonante è eliminato. La proiezione totale della polarizzazione
nella direzione dell’analizzatore è attenuata rispetto al segnale CARS e nella
pratica è impossibile la perfetta soppressione del contributo non risonante a
causa della presenza di effetti di birifrangenza legati agli elementi ottici.
• E-CARS (Epi-Detection CARS): se la dimensione tipica delle molecole è piccola
o comparabile alla lunghezza d’onda anti-Stokes allora è possibile la diffusione
del segnale CARS anche indietro. Questo può avvenire anche da riflessioni
per discontinuità di χ(3) nel campione. La rivelazione in direzione opposta a
quelle incidenti, può essere quindi utilizzata per isolare il segnale CARS di
molecole piccole dal segnale generato dal substrato di molecole ingombranti.
Questo metodo filtra il segnale in base alle dimensioni delle particelle e quindi il
segnale che deriva dalle particelle ancora più piccole può distorcere l’epi-CARS:
per questo motivo è un metodo con sensibilità limitata ([11]).
CAPITOLO 2. SPETTROSCOPIA RAMAN COERENTE
12
Figura 2.5: Schema dei vettori di polarizzazione nel P-CARS
2.3
SRS
Lo scattering Raman stimolato, Stimulated Raman Scattering come abbiamo visto
nel capitolo 2, coinvolge due impulsi, la pompa Raman e lo Stokes, e quando la loro
differenza in frequenza è uguale alla frequenza vibrazionale allora la molecola è
eccitata dallo stato fondamentale allo stato vibrazionale eccitato, passando per lo stato
virtuale. Si ha quindi la creazione dell’impulso di Stokes che si misura con l’ SRG,
stimulated Raman Gain, e l’annichilazione dell’impulso di pump che si misura con l’
SRL, stimulated Raman Loss. Il segnale è alla stessa frequenza dei campi in ingresso e
bisogna quindi misurare il cambiamento nell’intensità con e senza interazione con la
materia.
Figura 2.6: a) schema energetico; b) cambiamento nell’intensità di pump e stokes dopo
l’interazione non lineare con la materia
L’ SRS può essere spiegato come un processo del terzo ordine, come il FWM, ma
tra due onde:
∂Ap (z,t)
∂z
∂As (z,t)
∂z
= −iαp χ(3) A∗s (z, t)As (z, t)Ap (z, t)
= −iαs χ(3) A∗p (z, t)Ap (z, t)As (z, t)
(2.26)
Notiamo che la condizione di phase matching è automaticamente soddisfatta:
∆k = ks + kp − ks − kp = 0.
(2.27)
Integrando sulla lunghezza del campione L e assumendo Ap (z, t) ∼ cost si ottiene:
CAPITOLO 2. SPETTROSCOPIA RAMAN COERENTE
L
13
L
(3)
dAs (z, t) = −iαs χ
A2p
As (z, t) dz
(2.28)
∼ As (0, t) 1 − iαs χ(3) |Ap |2 L
(2.29)
0
0
As (L, t) = As (0, t)Le−iαs χ
(3) |A
p|
2
∆As = As (L, t) − As (0, t) = −iαs χ(3) |Ap |2 L
(2.30)
I detector sono sensibili alle medie temporali delle intensità quindi assumendo
|∆As |2 0 e si ottiene:
Is (L, t) = |As (0, t) + ∆As |2 =
= |As (0, t)|2 + 2 (A∗s (0, t)∆As ) =
= Is (0, t) + 2Re (A∗s (0, t)∆As ) =
(2.31)
= Is (0, t) + 2Re −A∗s (0, t)iαs χ(3) |Ap |2 As (0, t)L
L’ultimo termine mostra che il segnale è amplificato dal campo di Stokes stesso.
Si può espandere χ(3) nel contributo risonante, separato in parte reale e immaginaria,
più quello non risonante, reale puro ed ottenere:
Is (L, t) = Is (0, t) + 2αs Imχ(3)R Ip Is (0, t)L
(2.32)
Facendo gli stessi conti per Ip si possono ricavare le espressioni per le variazioni
dell’intensità dei due segnali
SRG =
∆Is
= 2αs Imχ(3)R Ip Is (0, t)L
Is (0, t)
(2.33)
∆Ip
= −2αp Imχ(3)R Is L
Ip (0, t)
(2.34)
SRL =
Entrambe le misure sono proporzionali a χ(3)R e questo fa si che il segnale non è
influenzato dal contributo dovuto a χ(3)N R ed è pertanto privo del background non
risonante e di effetti di distorsione, presenti invece nel CARS. Un altro vantaggio è la
proporzionalità diretta rispetto alla concentrazione delle molecole N , motivo per cui
questa tecnica è più comoda alle basse concentrazioni. Il problema è che il segnale
SRS sta sul background dello Stokes ed è sensibile alle instabilità di esso e difficile da
rilevare: si ha bisogno contemporaneamente di un modulatore e di un amplificatore
lock-in (vedi capitolo 3).
2.4
RIKE(S)
Il RIKE(S), Raman induced Kerr Effect (Spectroscopy) è una tecnica simile all’ SRS,
con ω1 = ω3 = ωp e ω2 = ω4 = ωs , ma la polarizzazione di pump e Stokes è differente.
In condizioni di risonanza con la frequenza vibrazionale del campione, si inducono
effetti Raman di birifrangenza che modificano il campo di Stokes. Bloccando con
un polarizzatore il campo di Stokes in ingresso e trasmettendo quello ortogonale
generato dal RIKE si rivela il segnale. Generalmente si usano due configurazioni:
CAPITOLO 2. SPETTROSCOPIA RAMAN COERENTE
14
• RIKE lineare: il pump è polarizzato a 45° rispetto allo Stokes;
• RIKE circolare: il pump è polarizzato circolarmente.
Figura 2.7: Schema del RIKE: polarizzazioni di pump e Stokes prima e dopo l’interazione
con la materia.
Utilizzando le equazioni del FWM come per l’ SRS si ottiene l’espressione per il
segnale RIKE:
∆As ∝ −iχ(3) |Ap |2 As L.
(2.35)
In questo caso bisogna tener conto della polarizzazione dei segnali e della scuscettivi(3)
tà del terzo ordine, come un tensore di rango quattro, χijkl dove i, j, k, l sono gli indici
dei quattro campi coinvolti: Ei (ω1 ), Ej (ω2 ), Ek (ω3 ), El (ω4 ) in x, y, z. In generale χ(3) è
composto da 81 elementi ma sfruttando le regole di simmetria nel caso di campioni
isotropi si ottiene che il segnale di
• RIKE lineare è
(3)
(3)
(3)
∆Alin
= i χ1122 + χ1212 |Ap |2 As L
s ∝ iχ
(2.36)
• RIKE circolare è
(3)
(3)
∆Acirc
∝ iχ(3) = − χ1122 − χ1212 |Ap |2 As L
s
(2.37)
Espandendo χ(3) nei suoi contributi risonante/non risonante e reale/immaginario
si ottiene che nel caso di RIKE circolare il segnale è proporzionale a soli contributi
risonanti ed è quindi privo del NRB, che nel caso lineare è presente ed è per questo
motivo che a livello pratico è più ragionevole l’utilizzo della configurazione circolare.
• RIKE lineare
(3)R
(3)R
(3)N R
(3)R
(3)R
(3)N R
∆Alin
s ∝ i χ1122,Re + χ1122,Im + χ1122,Re + χ1212,Re + χ1212,Im + χ1212,Re
(2.38)
• RIKE circolare
(3)R
(3)R
(3)N R
(3)R
(3)R
(3)R
(3)R
(3)R
(3)R
(3)N R
∆Acirc
∝ − χ1122,Re + χ1122,Im + χ1122,Re − χ1212,Re − χ1212,Im − χ1212,Re
s
(2.39)
(3)N R
(3)N R
Per le simmetrie di Kleinman χ1122,Re = χ1212,Re quindi si ottiene:
∆Acirc
∝ − χ1122,Re + χ1122,Im − χ1212,Re − χ1212,Im
s
(2.40)
CAPITOLO 2. SPETTROSCOPIA RAMAN COERENTE
15
(3)
Introducendo la suscettività χef f che contiene al suo interno i termini mostrati
nelle equazioni sovrastanti per ogni caso, si può scrivere:
(3)
IRIKE ∝ χef f
2.4.1
2
|Ep |2 Es L
(2.41)
BD-RIKE
Nonostante il crescente utilizzo delle tecniche di CRS, esse devono affrontare
gravi inconvenienti, che impediscono il loro utilizzo per applicazioni più ampie.
Nel tentativo di superare questi limiti, è stata sviluppata [15] una nuova tecnica di
spettroscopia CRS: Balanced Detection Raman Induced Kerr Effect (BD - RIKE), che
combina i vantaggi della spettroscopia Raman Coerente anti-Stokes (CARS), come il
fatto di essere linear-background-free, e i vantaggi dello Scattering Raman Stimolato
(SRS), quali l’assenza di background non risonante e la dipendenza lineare dalla
concentrazione [2]. Inoltre, grazie alla possibilità di misurare sia la parte immaginaria
che quella reale della suscettività non lineare, la tecnica BD-RIKE dà accesso diretto
alla fase vibrazionale e, con la rivelazione bilanciata si elimina efficacemente il rumore
del laser. L’apparato sperimentale è mostrato in figura 2.8.
Figura 2.8: Setup sperimentale per il BD-RIKE.
Per il RIKE lineare la lamina utilizzata è una λ/2 mentre per il caso circolare
si utilizza una λ/4. 3 Dopo che i due impulsi vengono combinati tramite un beam
splitter dicroico, sono focalizzati sugli obiettivi e sul campione. Il pump è bloccato
dai filtri mentre lo Stokes viene rivelato, passando prima per una lamina dello stesso
tipo di quella utilizzata precedentemente che rende la polarizzazione dello Stokes
nel primo caso ruotata di 45o e nel secondo circolare. Un prisma Wollaston separa
il fascio in due componenti di polarizzazione ortogonale che vengono rivelate da
un diodo bilanciato. Questo fa si che: se non si sta in condizioni di risonanza o se il
3
Per il RIKE lineare la polarizzazione del pump deve essere ruotata di 45o rispetto allo Stokes.
Si utilizza una lamina λ/2 inclinata di un angolo θ = 22.5o cosicchè la polarizzazione in uscita è
ruotata di 2θ = 45o rispetto a quella incidente e quindi allo Stokes. Per ottenere la polarizzazione
circolare si utilizza una lamina λ/4 che forma un angolo di 45o con l’asse verticale corrispondente alla
polarizzazione in ingresso.
CAPITOLO 2. SPETTROSCOPIA RAMAN COERENTE
16
pump è bloccato dal modulatore, le due componenti rivelate sono tra loro uguali e
quindi il segnale è nullo mentre, quando il segnale RIKE è generato, lo Stokes cambia
leggermente la sua polarizzazione e il diodo rileva due intensità diverse da quelle in
assenza di pump. Così si misura la variazione del segnale di Stokes, ovvero il Raman
Gain.
Questa tecnica offre numerosi vantaggi tra i metodi del CRS. Il segnale ottenuto è
libero da tutti i tipi di background perchè, grazie alla balanced detection, è rimosso
il rumore del laser, è proporzionale alla concentrazione N e la conoscenza di parte
Reale ed Immaginaria della suscettività del terzo ordine da informazioni aggiuntive
sulla fase vibrazionale. I risultati che si ottengono sono in perfetto accordo con quelli
teorici e gli esperimenti di microscopia mostrano il grande potenziale di questa
tecnica per l’imaging biologico e le sue applicazioni [11].
Capitolo 3
Apparato sperimentale e risultati
ottenuti
3.1
Apparato sperimentale
L’esperimento è stato svolto presso i laboratori dell’ IIT, Istituto Italiano di Tecnologia. In figura è mostrato schematicamente l’assetto del banco ottico che ha lo scopo di
poter studiare spettri CARS e BD-RIKE lineare.
La sorgente è un laser Plecter della Coherent che lavora ad un rate di 80M Hz
di lunghezza d’onda λ = 1064nm, potenza di 10W e impulsi di durata di 8ps ed
è utilizzato come segnale (fisso) di Stokes mentre la sua seconda armonica, a λ =
532nm, potenza di 5W e impulsi di 7ps, entra nell’OPO, la cui uscita signal è il segnale
tunabile utilizzato come pump. Entrambi i segnali sono polarizzati verticalmente.
La seconda armonica dello Stokes compie dentro l’OPO ∆L ∼ 2, 4m che lo Stokes
deve recuperare prima che i due segnali si ricongiungano per poterli sovrapporre
spazialmente e temporalmente.
Studiamo il percorso dei due segnali separatamente prima e dopo il beam splitter
(BS) dicroico su cui si sovrappongono.
Studiamo quindi Sokes e OPO separatamente prima della loro sovrapposizione.
Il segnale di Stokes è innanzitutto attenuato e polarizzato, compie una serie di
riflessioni per percorrere lo stesso cammino ottico dell’OPO, passa poi per la delay
line, per un collimatore che collima e focalizza il segnale con l’utilizzo di due lenti
(con rapporto tra le focali di ∼ 1.33) e dopo essere polarizzato è trasmesso dal beam
splitter (BS). Il segnale dell’ OPO passa come prima cosa per un filtro che leva
le componenti visibili, ed in seguito, per attenuarlo e polarizzarlo verticalmente
si utilizzano due glan polaroid verticali e un polaroid ruotato di un angolo θ: il
primo glan polarizza verticalmente il segnale in uscita dall’OPO (ripulendolo dalle
componenti non polarizzate verticalmente), il secondo polaroid inclinato di un angolo
variabile fa passare Esinθ se E è il campo uscente dal primo glan ed infine il terzo
glan polarizza verticalmente il segnale. Con questo metodo si attenua e polarizza
un segnale senza l’utilizzo di filtri, molto delicato a causa della forte potenza del
segnale. Il segnale è poi fatto passare per una lente, un modulatore e un’altra lente:
le due lenti servono a non renderlo ne convergente e ne dievergente (variandone la
distanza focale) e il modulatore, collegato ad un generatore di segnali di ondra quadra
che generalmente oscilla ad alta frequenza, modula il segnale in modo da poter
17
CAPITOLO 3. APPARATO SPERIMENTALE E RISULTATI OTTENUTI
18
Figura 3.1: Apparato sperimentale. La linea tratteggiata è la modulazione del segnale
dell’OPO. [S=specchio, L=lente, P=polarizzatore, GP= polarizzatore Glan, CR=cristallo (NL)].
misurare, nel caso del BD-RIKE le differenze di intensità dello Stokes in presenza o
no dell’OPO. La modulazione avviene attraverso un amplificatore Lock-in collegato
ad un generatore di segnali di onda quadra. Sfruttando la diffrazione del modulatore
e con l’utilizzo di uno specchio tagliato, si riflette il primo ordine di diffrazione,
che una volta pulito e attenuato, viene rivelato: misurandone intensità e lunghezza
d’onda si ricavano le caratteristiche dell’OPO. La componente trasmessa è polarizzata,
riflessa e fatta passare per una lamina λ/2 (valida per un ampio range di lunghezze
d’onda, necessaria per il RIKE) e poi riflessa dal BS. Nel grafico possiamo osservare i
due percorsi appena descritti.
Il segnale, una volta sovrapposto, è quindi fatto passare per un primo obiettivo,
per il campione e per il secondo obiettivo e viene poi rivelato. La rivelazione del
CARS è immediata: ricordando che il segnale di CARS ha frequenza diversa da
quella di Stokes e pump, ed in particolare frequenza maggiore e quindi lunghezza
d’onda minore delle due in ingresso, basta bloccare i due segnali con opportuni filtri
passa basso in termini di lunghezza d’onda. In questo caso si fa riflettere Nel caso del
RIKE il segnale viene fatto precedere, passa per una lamina λ/2 e per un cristallo non
CAPITOLO 3. APPARATO SPERIMENTALE E RISULTATI OTTENUTI
19
lineare (Glan Thompson) che separa il fascio in due fasci divergenti di ∼ 10o . Questi
vengono riflessi da una coppia di specchi a 45o che mandano i due fasci nel detector.
Ciascun fascio, di uguale intensità, è fatto passare per una lente (le due lenti hanno
focale diversa perchè messe a distanza diversa dal detector) e poi rivelato (acquizione
a 45o ). Il setup sperimentale di questa parte è mostrato in figura 3.2.
Figura 3.2: I due fasci dopo il BS. Per rivelare il CARS il fascio è riflesso e segue il percorso
arancione, mentre per il BD-RIKE lo specchio è rimosso e la luce segue il percorso rosso.
[L=lente; S=specchio; F=filtro; CR= cristallo (non lineare)].
Per effettuare gli esperimenti nelle condizioni più stabili la temperatura del
laboratorio è mantenuta a T ∼ 24o , la luce è spenta e il banco ottico viene chiuso.
3.1.1
Operazioni preliminari
Come prima cosa è importante l’allineamento dei fasci. Questo è realizzato allineando gli specchi a coppie: ogni specchio è affiancato da un iris e si allinea il
primo specchio con l’iris del secondo e viceversa. Il fascio inoltre non deve essere ne
convergente ne divergente: si utilizzano due iris ai due estremi del banco ottico e si
controlla la sezione del fascio con le carte IR.
Per la sovrapposizione temporale di Stokes e pump si è utilizzato un oscilloscopio
in modalità di trigger esterno collegato al laser per avere un tempo di riferimento
indipendente dei due impulsi e poter così rendere minimo il ritardo temporale
(assoluto) tra essi. Per la sovrapposizione spaziale si fa in modo che pump e Stokes
compiano lo stesso cammino ottico: in prima approssimazione si misura il cammino
dei due impulsi con il metro ricordando il percorso dentro l’OPO e poi, grazie alla
delay line si massimizza il picco dello spettro osservato che è massimo quando i due
percorsi compiono esattamente lo stesso cammino ottico. Una volta massimizzato il
picco non si sposta più la posizione della delay line.
CAPITOLO 3. APPARATO SPERIMENTALE E RISULTATI OTTENUTI
3.1.2
20
OPO
L’ optical parametric oscillator è un oscillatore parametrico, ovvero un oscillatore
i cui parametri oscillano nel tempo, che oscilla alle frequenze ottiche. Converte un
segnale laser in ingresso a frequenza ωp in due uscite a frequenza minore: il signal a
ωs e l’ idler a ωi ≤ ωs (per motivi storici) ed il pump residuo. Trascurando il pump
Figura 3.3: Struttura dell’OPO.
residuo, vale la relazione
ωp = ωs + ωi
(3.1)
L’OPO è una sorgente luminosa simile ad un laser perchè utilizza anch’esso una
cavità risonante, ma si basa sull’amplificazione parametrica in un cristallo non lineare
e non sull’emissione stimolata. La limitazione principale è che ha una soglia sulla
potenza del pump al di sotto della quale l’uscita è trascurabile: in ingresso deve
avere una sorgente caratterizzata da un’alta intensità ottica e una buona coerenza
spaziale, motivo per cui si utilizza un laser come pump. La principale caratteristica
dell’OPO per cui è molto utilzzato in spettroscopia è che signal e idler, determinati
da una condizione di phase matching, possono esser fatti variare in un ampio range di
lunghezze d’onda, variando la lunghezza della cavità L e la temperatura di essa, e
quindi l’OPO si comporta come una sorgente luminosa di lunghezza d’onda variabile.
Nell’esperimento si è utilizzato un OPO della AP E, il Levante Emerald che, con luce
verde in ingresso (la seconda armonica del laser è nel verde), è una sorgente di
impulsi al pico secondo ad alta potenza ampiamente tunabile. Gli impulsi sono
tunabili tra 690nm e 990nm per il signal e tra 1150nm e 2300nm per l’idler e questi
sono generati e quindi disponibili contemporaneamente.
3.2
Risultati ottenuti
I due spettri sono stati presi su un campione di acetone, C3 H6 O, la cui struttura
è mostrata in seguito, solvente utilizzato per testare l’apparato sperimentale e per
poterlo poi utilizzare su altri materiali, come nel nostro caso sul grafene; il suo
spettro Raman è mostrato in figura 3.5 ed ha un picco singolo e forte a 2918cm−1 che
corrispone al livello energetico del legame CH3 .
3.2.1
CARS
I dati CARS sono stati presi con uno spettrometro che da come output la lunghezza d’onda λ e l’intensità (associata ai conteggi). Lo spettro della radiazione
CAPITOLO 3. APPARATO SPERIMENTALE E RISULTATI OTTENUTI
21
Figura 3.4: Struttura dell’acetone.
Figura 3.5: Spettro Raman dell’acetone.
anti-Stokes riportato in figura 3.6 mostra un picco a λas = 656.5nm e rappresenta la
componente dello spettro CARS a frequenza 15232cm−1 . L’intero spettro vibrazionale e’ ottenibile variando la lunghezza d’onda dell’OPO e corrispondentemente λas
secondo l’equazione 2.16.
Sono stati acquisiti due spettri. Nel primo spettro, mostrato in figura 3.6 si osservano due massimi: uno a λ = 532nm che corrisponde alla seconda armonica dello
Stokes e pertanto lo trascureremo nel confronto tra lo spettro ottenuto e lo spettro
Raman, mentre il picco a λ = 656.5nm, presente in entrambi gli spettri, è il segnale
CARS. Studieremo quindi solo uno dei due spettri presi.
Per ottenere il Raman shift ovvero la frequenza vibrazionale Ω si sfruttano le
relazioni 2.15 e 2.16. Lo spettro ottenuto è mostrato in figura 3.8.
Si può quindi confrontare il picco rivelato con lo spettro Raman dell’acetone: si
vede che questi sono completamente sovrapposti e pertanto lo spettro ottenuto è
consistente con quello teorico [14] .
3.2.2
BD-RIKE
Con un programma si legge l’output dell’OPO e l’output del diodo bilanciato e si
ha un file con varie informazioni tra cui: la lunghezza d’onda dell’OPO, l’intensità
dell’OPO, l’intensità rivelata dal diodo bilanciato e l’intensità rivelata dal diodo
normalizzata all’intensità dell’OPO. Da λOP O si ricava il Raman shift Ω espresso in
CAPITOLO 3. APPARATO SPERIMENTALE E RISULTATI OTTENUTI
22
Figura 3.6: Spettro CARS in funzione di λ: il picco a λ = 532nm è la seconda armonica dello
Stokes mentre il picco a λ = 656.5nm è il segnale CARS.
cm−1 . Sono state fatte due acquisizioni nello stesso intervallo di lunghezze d’onda
che riportiamo nelle seguenti figure.
Procediamo dunque confrontando lo spettro ottenuto con il Raman dell’acetone considerando l’intensità rivelata dal diodo bilanciato: si vede che questi sono
completamente sovrapposti e pertanto lo spettro ottenuto è consistente con quello
teorico.
3.2.3
Confronto e conclusioni
Si possono confrontare i due spettri acquisiti, CARS 1 e RIKE, e osservare che
sono quasi completamente sovrapposti. Il RIKE ha sempre le code più larghe del
CARS come si può osservare nella figura. I picchi distano 7cm−1 che è un errore
assolutamente trascurabile ma, di cui discuteremo eventuali cause in seguito.
Possiamo inoltre osservare che in entrambi i casi il nostro apparato sperimentale
non rivela i picchi secondari che stanno alla base del picco del Raman [14]. Questi
sono picchi di larghezza molto minore di quello principale e quindi, non vengono
rivelati perchè il potere risolutivo non è sufficiente a risolvere queste righe. I motivi
per cui questo avviene oppure per cui si ha un allargamento spettrale sperimentale
od una eventuale fonte di errore sono legati a due cause: il campione e l’apparato. Per
quanto riguarda il campione le cause dell’allargamento spettrale sono: l’allargamento
naturale dovuto al principio di indeterminazione tempo-energia che collega il tempo
di vita di uno stato eccitato con la precisione della sua energia; l’effetto Doppler
1
Ricordiamo che lo spettro CARS non è un vero e proprio spettro vibrazionale quindi questo
confronto ha delle limitazioni.
CAPITOLO 3. APPARATO SPERIMENTALE E RISULTATI OTTENUTI
23
Figura 3.7: Confronto tra lo spettro Raman e il CARS.
poichè, se gli atomi si muovono con velocità diverse allora vengono assorbiti fotoni
di energia diversa e vi sarà uno spostamento in frequenza nello scattering della luce.
Per quanto riguarda l’apparato sperimentale, innanzitutto bisogna tener conto
del fatto che il laser non ha una riga di emissione pari ad una δ di Dirac, ma è
una gaussiana centrata intorno alla propria lunghezza d’onda nominale (1064nm):
l’intensità dello Stokes dipende quindi dalla lunghezza d’onda emessa in ogni istante.
Nella pratica si osserva pertanto la convoluzione tra i picchi che si dovrebbero
osservare teoricamente e la gaussiana caratteristica del laser. Inoltre l’esperimenso
non è svolto in regime continuo, ma discreto e i vari filtri che bloccano pump e
Stokes e che ripuliscono il segnale CARS da altre lunghezze d’onda, non lo rendono
esattamente monocromatico, ma fanno passare anche altre componenti. Ricordiamo
inoltre che nel CARS è presente il contributo non risonante che può disturbare il
segnale e spostare leggermente la posizione del picco.
CAPITOLO 3. APPARATO SPERIMENTALE E RISULTATI OTTENUTI
Figura 3.8: Spetto CARS. Il picco è in corrispondenza di Ω = 2917cm−1 .
24
CAPITOLO 3. APPARATO SPERIMENTALE E RISULTATI OTTENUTI
25
Figura 3.9: Spettro RIKE, 1: il picco è in corrispondenza di Ω = 2909cm−1 . Nelle ordinate:
nella prima figura è riportata l’intensità rivelata dal diodo bilanciato mentre nella seconda
quella normalizzata all’intensità dell’OPO.
CAPITOLO 3. APPARATO SPERIMENTALE E RISULTATI OTTENUTI
26
Figura 3.10: Spettro RIKE, 2: il picco è in corrispondenza di Ω = 2911cm−1 . Nelle ordinate:
nella prima figura è riportata l’intensità rivelata dal diodo bilanciato mentre nella seconda
quella normalizzata all’intensità dell’OPO.
CAPITOLO 3. APPARATO SPERIMENTALE E RISULTATI OTTENUTI
Figura 3.11: Confronto tra lo spettro Raman e il RIKE.
Figura 3.12: Confronto tra lo spettro CARS e RIKE.
27
Capitolo 4
Conclusioni
La ricerca di metodi per poter studiare le proprietà molecolari della materia
ad alta risoluzione mostra sempre più interesse ed applicazioni. La microscopia
vibrazionale coerente, che unisce un microscopio alle tecniche di Scattering Raman
Coerente, fornisce un metodo capace di studiare le proprietà chimiche della materia
facendo imaging non invasivo e label-free. La crescita di questo ambito di ricerca è
notevolmente aumentata negli ultimi anni, grazie alle nuove tecnologie dei laser e a
nuovi metodi sperimentali.
Questa dissertazione pone le basi della teoria dello scattering Raman coerente:
partendo da un’introduzione sull’effetto Raman, spontaneo e stimolato, trattato
con argomentazioni classiche. Il CRS supera la principale limitazione del Raman,
troppo debole da rilevare, grazie alla coerenza vibrazionale indotta nel moto di
oscillazione delle molecole. Introducendo campi di intensità elevata bisogna studiare
l’interazione non lineare tra luce e materia: sono i fenomeni del terzo ordine, tra cui
in particolare il FWM process che spiegano il CRS. In particolare, è stato discusso il
CARS. Il segnale è facilmente rilevato perchè generato a frequenza di quelle incidenti,
ma è proporzionale al quadrato della concentrazione N ed ha il grande problema
di avere il background non risonante. Per questo motivo sono state sviluppate e
discusse numerose tecniche di sopressione del NRB. Lo SRS ha i principali vantaggi,
confrontato al CARS, di essere privo del NRB e di essere proporzionale a N , motivo
per cui è più utile per le basse concentrazioni. Il segnale sta sul background dello
Stokes, motivo per cui è sensibile ad eventuali instabilità di esso e, soprattutto, è
più difficile da rilevare (si utilizza un modulatore ed un amplificatore Lock-in). Il
RIKE, privo del NRB solo nel caso lineare, è una valida alternativa alle altre tecniche
nella sua versione BD che permette una più facile rivelazione del segnale rispetto a
SRS e RIKE, ma soprattutto una migliore sensibilità, minor rumore e informazioni
aggiuntive.
É stato inoltre descritto il setup sperimentale realizzato ai laboratori dell’ IIT e
utilizzato per poter eseguire tutte queste tecniche. Nella pratica sono stati eseguiti, su
un campione di acetone, uno spettro CARS spettro BD-RIKE. Si è visto che gli spettri
ottenuti sono in accordo con il Raman teorico e tra di loro.
28
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