博士論文氏名森村壮志

博士論文
論文題目マウス乾癬モデルにおける CX3CL1/CX3CR1 の役割
氏名
森村壮志
1
目次
１）要旨 ……………………………………………………………………………4
２）序文……………………………………………………………………………..5
３）研究方法 ………………………………………………………………………11
１）動物
２）マウス皮膚での乾癬様皮膚炎の形成と評価
３）Quantitative reverse-transcriptase polymerase chain reaction (PCR)
４）組織切片と免疫染色
５）Enzyme-Linked Immunosorbent Assay（ELISA）
６）Flow cytometry
７）統計解析
４）結果 ……………………………………………………………………………16
1）皮膚炎の肉眼的評価
2）皮膚炎の組織学的評価
3）皮膚組織における浸潤細胞の評価
4）皮膚炎におけるサイトカインの産生
2
5）皮膚炎とマクロファージによる IL-1β, IL-6, TNF-α の産生
6）M1 と M2 マクロファージの浸潤
7) マクロファージにおける CCR2 の発現
５）考察…………………………………………………………………………………22
６）まとめ……………………………………………………………………………….28
７）謝辞…………………………………………………………………………………30
８）文献…………………………………………………………………………………31
９）図表…………………………………………………………………………………39
3
１．要旨
CX3CR1 は CX3CL1 のレセプターでマクロファージの遊走に重要である。乾
癬は皮膚角化性紅斑を特徴とした炎症性皮膚疾患である。乾癬における CX3CL1 と
CX3CR1 の役割を調べるために、イミキモド誘発型乾癬マウスモデルを用いた。
CX3CR1-/-マウスでは野生型マウスと比較してイミキモドで誘発された皮膚炎は減弱
し、サイトカインの産生も低下していた。CX3CR1-/-マウスでは M2 マクロファージが
優位に浸潤して IL-1β、IL-6、TNF-α の産生は減少し、CCR2 を発現するマクロファー
ジが多かった。CX3CL1 刺激自体は、IL-1β、IL-6、TNF-α の産生を抑制した。以上よ
り、CX3CR1 の欠損は、CX3CL1 の刺激が入らないことでサイトカイン産生が下がる
のではなく、M2 マクロファージを優位にすることで乾癬様皮膚炎を減弱させると考
えた。
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２．序文
皮膚は人体を被い、外界との境を成すが、単なる隔壁ではなく、それ自体生
命の保持に絶対不可欠な種々の機能を営む重要な臓器である。皮膚の構造は組織学的
に表皮、真皮、皮下組織に分類される。表皮の成分の大部分はケラチノサイトで、他
にメラノサイト、ランゲルハンス細胞、メルケル細胞などが存在する。真皮には線維
芽細胞、血管内皮細胞、真皮樹状細胞、肥満細胞等の細胞成分と膠原線維、弾性線維
を主体とする間質成分から形成される。さらに炎症時にはリンパ球、マクロファージ、
好酸球、好中球、好塩基球などが浸潤する。これらの細胞はサイトカインやケモカイ
ンを産生して相互に作用する。
乾癬は遺伝的素因（HLA-Cw6 など）を背景にケラチノサイト、樹状細胞、Th1
細胞、Th17 細胞などを介した種々の免疫学的異常を呈する慢性炎症性皮膚疾患であ
る[1]。臨床的には、銀白色調の厚い鱗屑を伴う角化性の紅斑が特徴である。また関節
炎や爪の変形も合併することがある。本疾患は、完治ないし長期にわたる寛解を維持
することが困難な皮膚疾患の一つである。乾癬の病態は、当初ケラチノサイトの異常
からくるものとされたが、シクロスポリンが著効したことで T 細胞による疾患と考え
られるようになった。最近では interleukin-23 (IL-23)、Th17 細胞が発見され、樹状細
5
胞が引き金となっていると言われている。すなわち、樹状細胞から放出される tumor
necrosis factor-α (TNF-α)や IL-23、さらに IL-23 により維持される Th17、STAT3 を活
性化する IL-19 と IL-20、IL-24、表皮増殖能を有する IL-22 などが重要であると考え
られるようになった[2]。最近では、TNF-α や IL-12/23p40 などの分子を標的とした生
物学的製剤が開発された。このように乾癬の病態はケラチノサイト、T 細胞、樹状細
胞の相互作用によって形成されるとされているが、マクロファージの役割はあまり分
かっていない。
イミキモドはイミダゾキノリン系の合成低分子化合物で、樹状細胞、単球に
作用して抗ウイルス作用、抗腫瘍作用を有する。1997 年に米国で尖圭コンジローマの
治療薬として初めて承認されて以来、2004 年には日光角化症、表在型基底細胞癌に対
して保険適応が追加された。日本では 2007 年に尖圭コンジローマの治療薬として承
認され、2011 年には日光角化症が追加承認された。イミキモドは、樹状細胞や単球に
存在する Toll 様受容体 7/8 に作用し、NFкB を活性化させ、interferon-α (IFN-α)、TNF-α、
IL-12 などのサイトカイン産生を促進させる[3,4]。最近、イミキモドを外用して乾癬
様皮膚炎や乾癬に特徴的なサイトカインを産生させるマウスモデルが報告されてい
る[5]。このマウスモデルは、剃毛したマウスの背部皮膚に 6 日間イミキモドを外用す
ると、イミキモド刺激で形質細胞様樹状細胞が活性化され、Th1 と Th17 細胞を介し
6
た免疫反応が起こり、乾癬様皮膚炎を引き起こすとされている。
ケモカインは G タンパク質共役受容体を介してその作用を発現する塩基性タ
ンパク質である[6]。ケモカインは多くの役割をもっており、血管新生、組織再生、腫
瘍形成、生体の生存および恒常性などに関与している。ケモカインは構造上の違いか
ら、C ケモカイン、CC ケモカイン、CXC ケモカイン、CX3C ケモカインに分類され
る。CX3CL1 は唯一の CX3C ケモカインで別名フラクタルカインと呼ばれる[6]。
CX3CL1 は膜結合型と可溶型の 2 つの形態で存在し、それぞれ異なる生態学的機能を
もつ[7]。CX3CL1 のレセプターである CX3CR1 は分子量 40kDa の膜貫通型ケモカイ
ンレセプターで、膜結合型の CX3CL1 と結合することで細胞間の接着を促進し、一方
で可溶型 CX3CL1 と結合することで単球、マクロファージ、NK 細胞、T 細胞、樹状
細胞、マクログリアなどの CX3CR1 発現細胞の遊走を誘導する[8]。CX3CL1 は内皮
細胞、上皮細胞、マクロファージ、血管平滑筋細胞などに発現するとされ、CX3CR1
は T リンパ球、好中球、マクロファージ、NK 細胞、肥満細胞などの様々な細胞に発
現しているとされている[9]。CX3CL1 と CX3CR1 の役割は関節リウマチ [10]、血管
炎[11]、アトピー性皮膚炎[12]などの多くの炎症性疾患で指摘されている。上記の疾
患では、血管内皮細胞が発現する CX3CL1 が CX3CR1 を発現するマクロファージや
リンパ球、好中球、肥満細胞と結合し、遊走や浸潤を促進して病態に関わると示され
7
ている。このように、CX3CL1 と CX3CR1 の作用は疾患や炎症部位、刺激の違いによ
って様々な機能を呈する。
マクロファージは細菌などの有害な物質に対する防御を行っているが、それ
と同時に体の老廃物を除去するという生体の恒常性を維持する機能をもっている。単
球は骨髄から末梢血に移行した後、組織に入り、マクロファージに分化する[13]。マ
クロファージは機能的に M1 と M2 との 2 種類が存在することが知られている[13]。
M1 マクロファージは細菌やウイルス等の感染時に活性化し、それらの病原体の排除
に重要な TNF-α、nitric oxide (NO)、IL-6、IL-1β、IFN-α、IFN-β などの炎症性サイトカ
インを産生したり、Th1 型の免疫応答を誘導したりする。M2 マクロファージは Th2
細胞や好塩基球、肥満細胞が産生した IL-4 や IL-13 により活性化され、寄生虫感染、
アレルギー応答、創傷治癒、癌転移に寄与している。腫瘍の進展に伴って腫瘍組織に
浸潤しているマクロファージは、M1 から M2 へのシフトが起きていると考えられて
いる[14]。M1 マクロファージは MCP-1 遺伝子を発現し、M2 マクロファージは MRC-1、
Arginase 1, Ym1/2 などの遺伝子を発現しているとされている[15]。マクロファージの
前段階である単球は、常在性と炎症性の 2 つに分類される[16-18]。常在性単球は、マ
ウスでは Gr-1-/ CD43+/ CD 62L-/ CX3CR1high/ CCR2-/ VEGFR1low 、人間では CD14low/
CD16+/ CD62L-/ CX3CR1high/ CCR2-/ VEGFR1low のフェノタイプをなし、炎症性単球は、
8
マウスでは Gr-1+/ CD43-/ CD 62L+/ CX3CR1low/ CCR2+/ VEGFR1high 、人間では
CD14high/ CD16-/ CD62L+/ CX3CR1low/ CCR2+/ VEGFR1high のフェノタイプをなす
[16-25]。CX3CL1 と CX3CR1 は定常状態における組織マクロファージの浸潤に重要で
あり、
CCL2 と CCR2 は炎症におけるマクロファージの遊走や浸潤に重要である[19]。
今まで CX3CL1 欠損マウス (以降、CX3CL1-/-マウスと称す)または CX3CR1
欠損マウス (以降、CX3CR1-/-マウスと称す)を用いて様々な疾患の病態が研究されて
きた。CX3CR1 の欠損はマクロファージから産生される TGF-β1、vascular endothelial
growth factor (VEGF)を低下して創傷治癒を遅延させる[26]。CX3CR1 の欠損は NK 細
胞の遊走を阻害して実験的自己免疫性脳脊髄炎を悪化させる[27]。CX3CR1 欠損マウ
スに B16 メラノーマ細胞を投与すると、単球と NK 細胞の浸潤が減弱することやメラ
ノーマ細胞への免疫応答が減少することで肺での腫瘍形成を促進させる[28]。しかし
ながら、乾癬の病態に CX3CL1 と CX3CR1 の役割について研究された報告はない。
また、マクロファージは乾癬に関与するとの報告はあるが(29,30)、マクロファージの
フェノタイプや分布について詳しく調べた報告は少ない。我々は Toll 様受容体 7/8 の
アゴニストであるイミキモドを外用して乾癬様皮膚炎を起こす系において、
CX3CR1-/-マウスを使用して、CX3CL1 と CX3CR1 が乾癬の病態にどのように関わっ
ているか、浸潤しているマクロファージがどのように乾癬の病態に影響するかを調べ
9
た。本研究は、様々な炎症疾患には CX3CL1/CX3CR1 の系が強く関わっているので、
乾癬にも関わっていると考え検証をした。結果、乾癬では CX3CL1/CX3CR1 の系が直
接作用しているのではなく、M1/M2 マクロファージの分布に作用することで乾癬の
病態に関わっていることがわかった。本研究は、乾癬の病態にマクロファージが重要
であることを示した。
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３．研究方法
1) 動物
C57BL/6 マウス (以降、野生型マウスと称す ) 及び CX3CR1-/- は Jackson
Laboratory (Bar Harbor, ME)より購入した。研究に用いたマウスはすべて 9-12 週齢であ
り、12 時間の明暗サイクル、水と餌を自由に摂取できる環境にて飼育した。実験毎に
野生型マウスと CX3CR1-/-マウスをそれぞれオス 6 匹使用した。全ての実験プロトコ
ールは東京大学の動物実験委員会の承認を受けた。
2) マウス皮膚での乾癬様皮膚炎の形成と評価
9-12 週の CX3CR1-/-マウスと野生型マウスにジエチルエーテルを吸入させて
鎮静をかけ、背部の毛をシェーバーで剃った。背部と右耳に 6 日間連続して 62.5mg/
日のイミキモドクリーム (5%;
ベセルナクリーム;
持田製薬, 東京, 日本)を外用し
た。CX3CR1-/-マウスと野生型マウスは別々のケージに入れ、それぞれの個体がどれ
かわかるように尻尾に印をつけた。背部の乾癬様皮膚炎を客観的に評価するため
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Psoriasis Area and Severity Index (PASI)スコアを用いた。紅斑、落屑、皮膚の厚さを 0:
症状なし、1:軽度、2:中等度、3:重度、4:最重度と数値化し、合計点(0-12)を計算して
皮膚炎の重症度を評価した。また、右耳の皮膚の厚さを連日ダイヤルシックネスゲー
ジで測定した。
3) Quantitative reverse-transcriptase polymerase chain reaction (PCR)
マウスの右耳に 62.5mg/日のイミキモドクリームを連日塗布して 24 時間後、48
時間後の右耳を採取して粉砕、QIA shredder (QIAGEN, Hilden, Germany)でホモジナイ
ズしたのち、RNeasy Fibrous Tissue Mini Kit (QIAGEN, Velno, Netherlands)を用いて
RNA を抽出した。RNA はその後 Taqman Gene Expression Protocol (Applied Biosystems,
Foster City, CA, USA)を用いて逆転写を行い、cDNA にした。プライマーとプローブは
Sigma-Aldrich (St.Louis, MO, USA)または Operon (Alameda, CA, USA)にてデザインし
た。プライマーとプローブのデザインは表 1 に記した。IL-17A, IL-17F, IL-22 は Taqman
Gene Expression Assays (Applied Biosystems) のプライマーを購入した。合成した cDNA
に SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems) を加えた。Quantitative real-time
PCR は以下の条件で ABI Prism 7000 Sequence Detector (Applied Biosystems) を用いて
12
行った； 50℃2 分を 1 サイクル、95℃10 分間を 1 サイクル、92℃ 15 秒間を 40 サイ
クル、60℃1 分を 40 サイクル。Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH)を
用いて mRNA を標準化した。GAPDH PCR 産物と比較して、ターゲットとなる転写産
物の相対発現量をCt method にて算出した。つまり、fold induction は 2-[Ct]と定義
され、ここで Ct は threshold cycle, つまりサンプルの比較蛍光がバックグランド蛍光
をこえるサイクル数をさす。Ct = [ターゲットとなる遺伝子の Ct (発現量不明のサ
ンプル) - GAPDH の Ct (発現量不明のサンプル)] - [ターゲットとなる遺伝子の Ct (キ
ャリブレータのサンプル) - GAPDH の Ct (キャリブレータサンプル)]。野生型マウス
におけるサイトカイン mRNA 発現量をキャリブレータとして使用した。それぞれの
サンプルは triplicate で流し、平均の Ct を解析に使用した。
4) 組織切片と免疫染色
62.5mg/ 日のイミキモドクリームを連日塗布した野生型マウスもしくは
CX3CR1-/-マウスの背部皮膚を 10%ホルマリンで固定し、パラフィン包埋の後、ヘマ
トキシリン・エオジン (HE)染色を行った。また、凍結切片を作成して、VECTASTAIN
ABC Kit (Vector Laboratories, Burlingame, CA) を用いて免疫組織学的検討を行った。凍
13
結組織から 6 μm の厚さの切片を作り、アセトン固定し、phosphate-buffered saline (PBS)
で希釈した 10％正常ウサギ血清と 37℃、10 分間反応させ、非特異的な染色をブロッ
クした。切片は次いで抗体を 100 倍希釈して反応させた。抗体は抗 CD3 抗体
(BD
Biosciences, San Jose, CA)、抗 CD4 抗体
(BD
Bioscience)、抗 CX3CR1 抗体
抗 MCP-1 抗体
(BD Bioscience)、抗体 CD8 抗体
(Abcam, Cambridge, UK) 、抗 CCR2 抗体
(Abcam)、抗 arginase 1 抗体
(Abcam)、
(Santa Cruz, CA, USA)を用いた。
5) Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)
CX3CR1 が IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-23 の産生にどのように関与しているか調
べるために、腹腔内マクロファージを調べた。ナイーブ状態の野生型マウスもしくは
CX3CR1-/-マウスの腹腔に PBS 5ml を 27G 針で注入して腹腔内でよく混合させた。21G
針で腹腔液を回収し、細胞数をカウントした。1x106 個の細胞に調節後、24well のプ
レートに Roswell Park Memorial Institute medium (RPMI) 液 1ml 入れて培養した。
CX3CL1 (0.04、0.4 ng/ml) を添加した後 24 時間培養した。24 時間培養後、蛋白を抽
出し ELISA キット (R&D Systems)を使ってプロトコールに従い、IL-1β、IL-6、TNF-α、
IL-23 の産生を調べた。
14
6) Flow cytometry
ナイーブ状態の野生型マウスもしくは CX3CR1-/-マウスの腹腔に PBS 5ml を
27G 針で注入し腹腔内でよく混合させた。21G 針で腹腔液を回収し、細胞数をカウ
ントした。1x106 個の細胞に調節後、1% Fetal bovine serum (FBS)添加 PBS で細胞を
よく洗浄し、1 次抗体の抗 CCR2 抗体（Abcam）、抗 CX3CR1 抗体(Abcam)を氷上の
上で 30 分間反応させ、コントロールには goat IgG isotype、rabbit IgG isotype を用い
た。1 次抗体を反応させ、1%FBS 添加 PBS で細胞をよく洗浄し、2 次抗体の PE
conjugated anti-goat IgG (R&D)、FITC conjugated anti-rabbit IgG (Santa Cruz) を氷上の
上に 30 分間反応させた。1% FBS 添加 PBS で細胞をよく洗浄した後、Cell Quest
software (BD Biosciences) がインストールされている FACScan flow cytometer を使い
解析した。
7) 統計解析
データは平均値 ± SEM を用いて表した。相互間の有意差には Mann-Whitney U
検定、 student t 検定を用いた。P < 0.05 を統計学的に有意と判断した。
15
４．
結果
1) 皮膚炎の肉眼的評価
イミキモド連日外用 6 日後の背部の皮膚炎は、肉眼的には CX3CR1-/-マウスの
方が野生型マウスと比較して紅斑や鱗屑が減弱していた (図 1)。皮膚炎を評価するた
め右耳の厚さを測定したところ、イミキモド外用して 4 日目以降から右耳の皮膚の厚
さは、CX3CR1-/-マウスでは有意に減弱していた (図 2)。背部の皮膚にイミキモド外
用して 2 日目から野生型マウスに紅斑、鱗屑、皮膚の厚さなどの皮膚所見が認められ
た。CX3CR1-/-マウスでは野生型マウスと比較してイミキモド外用して 2 日目以降、
鱗屑 (図 3B)、皮膚の厚さ (図 3C)、合計 (図 3D) のスコアは有意に低下していた。
2) 皮膚炎の組織学的評価
野生型マウスにおけるイミキモド外用で誘発された皮膚炎の組織学的所見は、
典型的な乾癬で認められる過角化、錯角化、角層下の微小膿瘍、表皮の肥厚を示した
(図 4A)。一方、CX3CR1-/-マウスの皮膚炎では上記の所見を示さなかった (図 4A)。
16
次に背部にイミキモド外用して 0、2、6 日後の表皮の厚さを測定した。病理組織で表
皮の厚さを測定したところ、CX3CR1-/-マウスの方が 2 日後、6 日後で有意に減少して
いた (図 4B)。
3) 皮膚組織における浸潤細胞の評価
イミキモドを背部に 6 日間連日で外用後、発症した皮膚炎の部分を採取して、
病理組織にて浸潤している CD3 陽性細胞、CD4 陽性細胞、CD8 陽性細胞、好中球の
数を測定した。400 倍の視野で真皮に浸潤している細胞をカウントした。結果、真皮
に浸潤している CD8 陽性細胞と好中球の数は、CX3CR1-/-マウスの方が野生型マウス
と比較して有意に減少していた (図 5C, D)。一方、CD3 陽性細胞と CD4 陽性細胞の
数に有意な差を認めなかった (図 5A, B)。
4) 皮膚炎におけるサイトカインの産生
イミキモド外用で誘発された右耳の皮膚炎部分における IL-12/IL-23p40、
IL-23p19、IL-12p35、IL-17A、IL-17F、IL-22、IL-36α、IL-36γ、CX3CL1 の産生を 24
17
時間後、
48 時間後に mRNA レベルで測定した (図 6, 7)。結果、IL-12/IL-23p40、IL-23p19
の産生は CX3CR1-/-マウスでは野生型マウスと比較して 24 時間後のみ有意に減少し、
IL-12p35、IL-17A は 48 時間後のみ有意に減少、IL-17F、IL-22、IL-36α、IL-36γ の産
生は 24 時間後、48 時間後ともに有意に減少していた。CX3CL1 はイミキモド刺激前
から有意に減少していた。以上より、CX3CR1-/-マウスでは野生型マウスと比較して
サイトカインの産生が有意に減少していた。
5) 皮膚炎及びマクロファージにおける IL-1β、IL-6、TNF-α の産生
CX3CR1-/-マウスではイミキモド外用で誘発された右耳の皮膚炎部分の IL-1β、
TNF-α の産生は 24 時間後、48 時間後ともに野生型マウスと比較して有意に減少し、
IL-6 は 48 時間後のみ有意に減少していた (図 7)。
腹腔マクロファージの数は、イミキモド外用刺激をする前の状態では野生型
マウスの方が CX3CR1-/-マウスより約 3 倍多かった (図 8)。次に腹腔内から回収した
マクロファージに CX3CL1 (0.04、0.4 ng/ml) 刺激を加えた上で培養後、IL-1β、IL-6、
TNF-α mRNA の産生を調べた。野生型マウスでは CX3CL1 の刺激により IL-1β、IL-6、
TNF-α mRNA の産生は減少傾向を示した (図 9A, B, C)。一方、IL-23p19 mRNA の産
18
生はどちらのマウスも CX3CL1 の刺激で変化を認めなかった (図 9D)。培養上清中の
蛋白を測定したところ、同様の結果が ELISA で得られた (図 10A, B, C, D)。加えて、
CX3CR1-/-マウスの腹腔から採取したマクロファージから産生される IL-1β、IL-6、
TNF-α は、CX3CL1 刺激する前の段階から野生型マウスと比較して有意に減少してい
た (図 9A, B, C, 図 10A, B, C)。以上の結果より、CX3CR1-/-マウスでは腹腔内に存在
しているマクロファージ数が有意に少なく、さらにマクロファージから産生される
IL-1β, IL-6, TNF-α は CX3CL1 の刺激のない状態で有意に減少していることが示され
た。
6) M1 と M2 マクロファージの浸潤
M1 マクロファージのマーカーである MCP-1 と M2 マクロファージのマーカ
ーである MRC-1、Arginase 1、Ym1/2 の発現を調べた。ナイーブ状態の耳から採取し
た組織からの MCP-1 の mRNA 発現は CX3CR1-/-マウスでは野生型マウスと比べて有
意に減少していた (図 11A)。一方、MRC-1、Arginase 1、Ym1/2 の mRNA 発現は有意
に上昇していた (図 11B, C, D)。ナイーブ状態の腹腔液中のマクロファージでも同様
に MCP-1 の発現は CX3CR1-/-マウスでは有意に減少し (図 12A)、MRC-1、Arginase 1,
19
Ym1/2 の発現は有意に上昇していた (図 12B, C, D)。次にナイーブ状態の背部皮膚に
浸潤しているマクロファージが発現している MCP-1 と Arginase 1 を病理組織染色に
て調べた。400 倍の視野で浸潤している細胞数をカウントした結果、CX3CR1-/-マウス
では MCP-1 陽性のマクロファージが有意に減少し (図 13A, B)、逆に Arginase 1 陽性
マクロファージが有意に増加していた (図 13A, C)。すなわち、CX3CR1-/-マウスでは
M1 マクロファージが減少し、M2 マクロファージが増加していた。
7) マクロファージにおける CCR2 の発現
ナイーブ状態の耳と腹腔内に浸潤しているマクロファージの役割を調べるた
め、CX3CR1 と CCR2 の mRNA の発現を調べた。CX3CR1-/-マウスでは、耳では CX3CR1
を発現しておらず、CCR2 の発現は野生型マウスと比較して有意に上昇していた (図
14)。同様に CX3CR1-/-マウスの腹腔液中マクロファージは CX3CR1 を発現しておらず、
CCR2 の発現は有意に上昇していた (図
14)。次に、病理組織の免疫染色にて背部皮
膚に浸潤している CX3CR1 と CCR2 を発現するマクロファージを調べた。結果、
CX3CR1-/-マウスでは CX3CR1 を発現するマクロファージを認めず (図 15A, B)、一方
CCR2 を発現するマクロファージは野生型マウスと比較して有意に増加していた (図
20
15A, C)。加えて、Flow cytometry でも CX3CR1 と CCR2 の発現を調べた。腹腔液から
採取した野生型マウスのマクロファージは CX3CR1 を発現し、CX3CR1-/-マウスでは
発現していなかった (図 16)。CCR2 の発現は野生型マウスではあまり認めなかった
が、CX3CR1-/-マウスでは発現を認めた (図 16)。以上の結果から、CX3CR1-/-マウス
では野生型マウスと比較して CCR2 を発現しているマクロファージが多く浸潤してい
ることがわかった。
21
５．
考察
本実験では、イミキモド誘発型乾癬マウスモデルにおける CX3CR1 と CX3CL1
の関与について調べた。CX3CR1-/-マウスは野生型マウスと比較し、背部および耳の
皮膚における皮膚炎及びサイトカインが減少し、CX3CR1 の欠損により M2 マクロフ
ァージが多く浸潤していることがわかった。
マクロファージは炎症プロセスの制御を理解する上で機能により M1 と M2
マクロファージに分けられる[13]。マクロファージのフェノタイプや機能による偏り
があることも報告されてきており、それらの分布はリンパ球における Th1/Th2 の分布
や区分と似ている[31]。CCR2 陽性単球、マクロファージは炎症状態で出現し、CX3CR1
陽性単球、マクロファージは非炎症状態で出現する報告されている[19]。これまで
CCR2 を発現する炎症性単球は M1 マクロファージに、CX3CR1 を発現する常在性単
球は M2 マクロファージへ分化すると考えられてきたが[13,32]、近年これを否定する
報告もなされている。すなわち、マウス慢性皮膚炎症モデルにおいて炎症性単球は
CCR2 に依存的に炎症の部位に浸潤するが、好塩基球は CCR2 に非依存的に浸潤し、
これまで M1 マクロファージに分化すると考えられていた炎症性単球が、好塩基球の
産生する IL-4 により M2 マクロファージに分化することが報告された[33]。本実験で
22
は、CX3CR1-/-マウスでは野生型マウスと比較し、刺激を受けない皮膚と腹腔内に M2
マクロファージが多く浸潤していた。また、CCR2 陽性細胞が非炎症状態で出現し、
CX3CR1 陽性マクロファージは炎症状態で出現していた。この結果は、CX3CR1 の欠
損が M2 マクロファージを多く浸潤させ、サイトカインの産生低下とイミキモド誘発
型皮膚炎の減弱を引き起こしたと考えられたと同時に CCR2 を発現する単球が M2 マ
クロファージに、CX3CR1 を発現する単球が M1 マクロファージに分化または誘導さ
れている可能性を示唆した。本実験では、
M1 マクロファージのマーカーとして MCP-1
の mRNA 発現を用いたが、MCP-1 は線維芽細胞や血管内皮細胞からも産生されるの
で、評価としては限定的であった。また、M1、M2 マクロファージが CCR2 または
CX3CR1 を発現しているかどうか、今後検討する必要がある。マウス実験モデルにお
いて M1、M2 マクロファージの分布の違いは様々な疾患で報告されている。M1 マク
ロファージによる脂肪組織の浸潤は肥満とインスリン耐性に関わる[34,35]。また、イ
ンシュリンの感性や脂肪組織のリモデリングを改善させる体重減少には、M2 マクロ
ファージの増加が関与している[36]。このように、マクロファージの分布の極性は様々
な病態で重要である。本実験でも M2 マクロファージ主体であることが、乾癬様皮膚
炎の低下と関係していると考えられた。
CCR2 と CX3CR1 はともに単球やマクロファージの遊走や浸潤に関わるケモ
23
カインの受容体である[19]。CX3CL1 は CD16+CX3CR1highCCR2low の単球の浸潤や遊走
をコントロールし、CX3CR1-CX3CL1 の経路が定常状態における単球の遊走に重要で
あると報告されている[37]。本実験では、CX3CR1-/-マウスから採取した腹腔内マクロ
ファージの数は、野生型マウスと比較し約 1/3 の数であった。また、CX3CR1-/-マウス
の耳や皮膚および腹腔内には CCR2 を発現するマクロファージが野生型マウスより多
かった。すなわち、CX3CR1 の欠損により完全にマクロファージの浸潤が抑制される
わけではなく、CCL2 と CCR2 の経路がマクロファージの浸潤を補完したと推察した。
過去の報告によると CCR2 と CX3CR1 のダブルノックアウトマウスでは CCR2 と
CX3CR1 は独立してマクロファージの遊走や浸潤に働くと示されている[38]。マクロ
ファージにおける CCR2 や CX3CR1 の役割についてまだ解明してないことが多く、さ
らなる研究が必要と考える。
IL-1β、IL-6、TNF-α などの炎症性サイトカインは、好中球やマクロファージ
から産生される[39,40]。上記のサイトカインは乾癬の病態に強く関わる[41]。本実験
では、イミキモド外用して皮膚炎を起こさせた 48 時間後の耳と刺激をしていない腹
腔内マクロファージから産生される IL-1β、IL-6、TNF-α は CX3CR1-/-マウスの方が野
生型マウスと比較して有意に減少していた。また好中球の皮膚浸潤も CX3CR1-/-マウ
スでは有意に減少していた。CX3CR1 はマクロファージと好中球にも発現しており、
24
CX3CR1 がマクロファージと好中球の浸潤に重要であると考えられる。本実験では、
細胞数のカウントはイミキモド外用後 6 日目の組織で数えており (図 5)、イミキモド
外用後 2 日目などの早期に数えて評価する必要もある。興味深いことに、野生型マウ
スから採取した腹腔内マクロファージに CX3CL1 の刺激を加えても IL-1β、IL-6、
TNF-α の産生は上昇せず、むしろ抑制していた。過去の論文でもマクロファージに
CX3CL1 0.03 nM の刺激を与えると TNF-α の産生が低下することが報告されており、
ERK1/2 のリン酸化の抑制や NF-kappaB p50 のサブユニットの減少が機序の可能性と
考えられている[42]。すなわち、CX3CL1-CX3CR1 の経路は直接 IL-1β、IL-6、TNF-α
の産生を促していないことが示唆された。
血管新生は乾癬において臨床的、病理組織的に特徴的な所見である。乾癬の
皮疹ではアウスピッツ現象と言って、鱗屑をはがすと点状の出血がみられる。乾癬の
病理組織は真皮乳頭層に微小血管の増生と拡張を認める。我々は CX3CL1/CX3CR1
の経路が血管炎の機序に関与していると報告した[11]。本実験では、CX3CR1-/-マウス
の方が野生型マウスと比較してイミキモド外用 6 日目で紅斑が有意に減弱していた
(図 3A)。この結果は、CX3CR1 欠損により血管新生や炎症細胞浸潤が乏しくなった可
能性が考えられる。血管新生について VEGF など発現を調べて評価する必要がある。
イミキモド外用後 6 日目の背部皮膚を採取して病理組織で評価した結果、
25
CX3CR1-/-マウスの膠原線維は、野生型マウスと比較して減少しているもの (図 4)と、
むしろ膠原線維が増加しているもの (資料未記載)とがあった。強皮症マウスモデルを
使用した実験では、CCL2/CCR2 の経路は TGF-β 作用による線維化のみに関与し、
connective tissue growth factor (CTGF)の作用には影響なく、一方 CX3CL1/CX3CR1 の経
路は、TGF-β 作用による線維化の開始と CTGF 作用による線維化の維持に重要である
と報告されている[43]。この論文では、CCR2-/-マウス及び CX3CR1-/-マウスでは、野
生型マウスと比較して皮膚の線維化が抑制されていた。本実験では、CX3CR1-/-マウ
スの皮膚の線維化が野生型マウスと比較して線維化が減少または増生している症例
があり、COL1A2 等の産生を調べて検討する必要がある。
今回我々は、マクロファージに注目して研究を進めてきたが、乾癬の病態には
樹状細胞や γδT 細胞が関与しているので、今後はこれらの細胞で CX3CL1/CX3CR1
の役割を研究しようと考えている。
以上より、CX3CL1-CX3CR1 の経路は、イミキモド誘発型乾癬マウスモデル
において CX3CL1 自体の刺激が直接皮膚炎やサイトカイン産生に関与しているので
はなく、M1 から M2 マクロファージへの分布の変化が皮膚炎やサイトカイン産生に
影響したと考えた。CX3CR1 の欠損は M2 マクロファージの浸潤を優位にし、イミキ
モド外用で誘発される皮膚炎を減弱させていることがわかった。また、CX3CR1 が欠
26
損していてもマクロファージの浸潤が完全に抑制されるわけでなく、CCL2-CCR2 の
経路がマクロファージの浸潤を補っていると考えられた。マクロファージのフェノタ
イプについてまだわからないことが多いが、ある特定のマクロファージ、特に
CX3CR1 を発現しているマクロファージを解析することが、乾癬の病態を知る一つの
手がかりとして期待される。
27
６．まとめ
本研究では、CX3CR1 と CX3CL1 のイミキモド誘発型乾癬マウスモデルにお
ける関与について検討した。
CX3CR1-/-マウスでは野生型マウスと比較し、背部および耳の皮膚におけるイ
ミキモド外用で誘発された皮膚炎の減弱が認められた。
皮膚炎を誘発された耳において乾癬の病態に関連するとされる多くのサイト
カインが CX3CR1-/-マウスでは減弱していた。さらに炎症性サイトカインである IL-1β、
IL-6、TNF-α の産生は皮膚炎を起こした耳と刺激していない腹腔液において減少して
いた。培養した腹腔マクロファージに CX3CL1 を添加すると IL-1β、IL-6、TNF-α の
産生は減少していた。CX3CL1 の刺激が入らないことが CX3CR1-/-マウスにおける
IL-1β、IL-6、TNF-α の産生低下を引き起こしているのではなかった。また皮膚および
腹腔内マクロファージのフェノタイプについて調べたところ、M2 マクロファージが
CX3CR1-/-マウスに優位であった。加えて、CCR2 を発現しているマクロファージが優
位に浸潤していた。
以上のことから、CX3CR1-/-マウスでは M2 マクロファージが優位に浸潤する
ことで IL-1β、IL-6、TNF-α の産生が減弱してイミキモド外用で誘発された皮膚炎が
28
減弱すること、マクロファージの浸潤に必要な CX3CR1 がなくても CCR2 を発現する
マクロファージが優位に浸潤することでマクロファージの役割を補足していること
が考えられた。
29
７．謝辞
大学院で学ぶ機会をお与え下さり、終始懇切な御指導御鞭撻を賜りました東京大学
医学部皮膚科学教室、佐藤伸一教授に深謝致します。また、本研究に共同研究者とし
て御指導御協力くださった東京大学医学部皮膚科学教室、菅谷誠准教授に深謝致しま
す。
30
８．文献
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Dermatol Sci. 69:250-258, 2012
38
９．図表
表 1 Qunatitive reverse-transcriptase PCR の primer の配列
Target
GAPDH
IL-12/IL-23p40
IL-23p19
IL-12p35
IL-1β
IL-6
TNF-α
IL-36α
IL-36γ
CX3CL1
CX3CR1
CCR2
MCP-1
MRC-1
Arginase 1
Sequence
forward
5' CGTGTTCCTACCCCCAATGT 3'
reverse
5' TGTCATCATACTTGGCAGGTTTCT 3'
forward
5’ CTCACATCTGCTGCTCCACAAG 3’
reverse
5’ AATTTGGTGCTTCACACTTCAGG 3’
forward
5’ TGTGCCTAGGAgTAGCAGTCCTGA 3’
reverse
5’ TTGGCGGATCCTTTGCAAGCAGAA 3’
forward
5’ ACTCTGCGCCAGAAACCTC 3’
reverse
5’ CACCCTGTTGATGGTCACGAC 3’
forward
5’ ACCTGTCCTGTGTAATGAAAG 3’
reverse
5’ GCTTGTGCTCTGCTTGTG 3’
forward
5’ AGTTGCCTTCTTGGGACTGA 3’
reverse
5’ TCCACGATTTCCCAGAGAAC 3’
forward
5’ CCACCACGCTCTTCTGTCTAC 3’
reverse
5’ AGGGTCTGGGCCATAGAACT 3’
forward
5’ TGCCCACTCATTCTGACCCA 3’
reverse
5’ CTGCCACAGAGCAATGTGTC 3’
forward
5’ ATGGACACCCTACTTTGCTG 3’
reverse
5’ TGTCCGGGTGTGGTAAAACA 3’
forward
5’ ATGACCTCACGAATCCCAGTG 3’
reverse
5’ CCGCCTCAAAACTTCCAATGC 3’
forward
5’ TCCAGAACGATCAAGCACAG 3’
reverse
5’ CGGTGTTCAGTTCCACATTG 3’
forward
5’ GTTACCTCAGTTCATCCA 3’
reverse
5’ CAAGGCTCACCATCATCGTAGTC 3’
forward
5’ CTGGATCGGAACCAAATGAG 3’
reverse
5’ CGGGTCAACTTCACATTCAA 3’
forward
5’ GCAAATGGAGCCGTCTGTGC 3’
reverse
5’ CTCGTGGATCTCCGTGACAC 3’
forward
5’ GCTGTCTTCCCAAGAGTTGGG 3’
reverse
5’ ATGGAAGAGACCTTCAGCTAC 3’
39
Ym 1/2
forward
5’ GGGCATACCTTTATCCTGAG 3’
reverse
5’ CCACTGAAGTCATCCATGTC 3’
40
WT
CX3CR1-/-
図１皮膚炎は CX3CR1-/-マウスで減弱していた。
イミキモドクリームをマウスの背部に 6 日間連日で外用した後の皮膚炎の状態を撮影
した。野生型マウスの背部は皮膚が粗造で皮膚が厚く、紅斑も認めるが、CX3CR1-/マウスの背部では同症状が減弱していた。
41
耳の厚さ
0.4
*
(mm)
0.35
WT
0.3
0.25
*
*
CX3CR1-/-
0.2
0.15
1
2
3
4
5
6 (日)
図 2 耳の厚さは CX3CR1-/-マウスで減弱していた。
イミキモドクリームをマウスの右耳に連日外用し、耳の厚さを測定した。CX3CR1-/マウスの耳の厚さは、野生型マウスと比較して外用 4 日後以降から有意に減少してい
た。データは平均値 ± SEM を用いて表した。*P < 0.05,
42
A
紅斑
スコア(0-4)
3
2
**
WT
1
0
CX3CR1-/1
2
C
4
5
厚さ
4
WT
3
** **
2
**
1
0
3
1
2
鱗屑
4
6
3
WT
2
1
**
CX3CR1-/-
4
5
6
10
CX3CR1-/-
4
5
6
(日)
**
WT
8
* **
**
CX3CR1
*
6
-/-
4
0
(日)
3
**
合計
12
2
3
2
D
**
** **
** *
1
0
(日)
スコア(0-12)
スコア(0-4)
4
スコア(0-4)
B
1
2
3
4
5
6 (日)
図 3 PASI スコアは CX3CR1-/-マウスで減少していた。
イミキモドクリームをマウスの背部に外用した状態を PASI スコアで評価した。紅斑
(A)、落屑(B)、皮膚の厚さ(C)を 0:症状なし、1:軽度、2:中等度、3:重度、4:最重度と数
値化し合計点(0-12:D)を計算して皮膚炎の重症度を評価した。CX3CR1-/-マウスの背部
の鱗屑、厚さ、合計スコアは、野生型マウスと比較して 2 日後以降から有意に減弱を
認めた。データは平均値 ± SEM を用いて表した。*P < 0.05, **P < 0.01
43
A
B
WT
表皮の厚さ
CX3CR1-/(μm)
**
80
70
60
50
40
30
20
10
0 WT CX3CR1-/- WT CX3CR1-/-WT CX3CR1-/-
*
0
図 4
2
6 (日)
CX3CR1-/-マウスでは乾癬で認められる組織所見は乏しく、表皮の厚さは減少
していた。
イミキモドクリームをマウスの背部に 6 日間外用した後、皮膚生検を施行し、組織学
的に評価して表皮の厚さを測定した。組織学的には野生型マウスでは角層の肥厚と角
層下膿疱、表皮の肥厚を認めたが、CX3CR1-/-マウスでは上記所見をほとんど認めな
かった(A)。表皮の厚さは CX3CR1-/-マウスでは外用して 2 日後、6 日後に有意に減少
していた(B)。データは平均値 ± SEM を用いて表した。病理組織は 200 倍の倍率。
*
P < 0.05, **P < 0.01
44
A
B
CD3
12
細胞数/HPF
細胞数/HPF
25
20
15
10
5
10
8
6
4
2
0
0
CX3CR1-/-
WT
C
WT
**
**
細胞数/HPF
60
5
4
3
2
1
CX3CR1-/-
好中球
D
CD8
6
細胞数/HPF
CD4
50
40
30
20
10
0
0
WT
CX3CR1-/-
WT
CX3CR1-/-
図 5 皮膚炎の組織にて CD8 陽性細胞と好中球の数は CX3CR1-/-マウスで減少してい
た。
イミキモドクリームをマウスの背部に 6 日間外用した後、皮膚生検を施行し、免疫染
色にて組織学的に浸潤している細胞を調べた。CD3、CD4 陽性細胞の数に有意な違い
を認めなかったが(A,B)、CD8 陽性細胞と好中球の数は CX3CR1-/-マウスでは野生型マ
ウスと比較して有意に減少していた(C,D)。データは平均値 ± SEM を用いて表した。
**
P < 0.01
45
GAPDHに対する相対発現量
0 hours
24 hours
*
0.0016
0.0014
0.0012
0.001
0.0008
0.0006
0.0004
0.0002
0
WT CX3CR1-/- WT CX3CR1-/- WT CX3CR1-/-
0 hours
24 hours
0.0002
0.00015
0.0001
0.00005
0
48 hours
WT CX3CR1-/- WT CX3CR1-/- WT CX3CR1-/-
0 hours
48 hours
IL-17A
*
0.00025
24 hours
IL-17F
0.003
0.002
**
0.0015
0.001
0.0005
0
WT CX3CR1-/- WT CX3CR1-/-WT CX3CR1-/-
0 hours
24 hours
IL-12p35
0.01
0.009
0.008
0.007
0.006
0.005
0.004
0.003
0.002
0.001
0
48 hours
**
0.0025
GAPDHに対する相対発現量
WT CX3CR1-/- WTCX3CR1-/- WT CX3CR1-/-
IL-23p19
48 hours
*
WT CX3CR1-/- WT CX3CR1-/- WT CX3CR1-/-
0 hours
GAPDHに対する相対発現量
**
GAPDHに対する相対発現量
0.0008
0.0007
0.0006
0.0005
0.0004
0.0003
0.0002
0.0001
0
GAPDHに対する相対発現量
GAPDHに対する相対発現量
IL-12/IL-23p40
24 hours
48 hours
IL-22
0.00018
0.00016
0.00014
0.00012
0.0001
0.00008
0.00006
0.00004
0.00002
0
*
*
WT CX3CR1-/- WTCX3CR1-/- WT CX3CR1-/-
0 hours
24 hours 48 hours
* P<0.05, ** P<0.01
図6
皮膚炎における IL-12/IL-23p40、IL-23p19、IL-12p35、IL-17A、IL-17F、IL-22
の産生は CX3CR1-/-マウスで減少していた。
イミキモドクリームをマウスの耳に外用して 24 時間後、48 時間後に炎症部分を採取
し、IL-12/IL-23p40、IL-23p19、IL-12p35、IL-17A、IL-17F、IL-22 の mRNA 発現を調
べた。CX3CR1-/-マウスでは IL-12/IL-23p40、IL-23p19 は 24 時間後に有意に減少し、
IL-12p35、IL-17A は 48 時間後に有意に減少し、IL-17F、IL-22 は 24 時間後と 48 時間
後ともに有意に減少していた。データは平均値 ± SEM を用いて表した。*P < 0.05, **P
< 0.01
46
*
WT CX3CR1-/- WT CX3CR1-/- WT CX3CR1-/-
0 hours
24 hours
*
0.006
0.005
0.004
0.003
0.002
0.001
0
WTCX3CR1-/- WTCX3CR1-/- WT CX3CR1-/-
0 hours
48 hours
**
0.25
0.2
0.15
0.1
0.05
0
WT CX3CR1-/- WT CX3CR1-/- WT CX3CR1-/-
0 hours
24 hours
GAPDHに対する相対発現量
GAPDHに対する相対発現量
*
TNF-α
0.007
0.006
0.005
0.004
0.003
0.002
0.001
0
48 hours
*
0.2
**
0.15
0.1
0.05
0
48 hours
WT CX3CR1-/-WTCX3CR1-/-WT CX3CR1-/-
0 hours
24hours
0 hours
48hours
CX3CL1
*
0.25
*
WT CX3CR1-/-WT CX3CR1-/-WTCX3CR1-/-
IL-36γ
IL-36α
0.3
24 hours
GAPDHに対する相対発現量
*
IL-6
24 hours 48 hours
GAPDHに対する相対発現量
0.018
0.016
0.014
0.012
0.01
0.008
0.006
0.004
0.002
0
GAPDHに対する相対発現量
GAPDHに対する相対発現量
IL-1β
0.012
0.01
0.008
0.006
*
*
**
0.004
0.002
0
WT CX3CR1-/-WT CX3CR1-/-WT CX3CR1-/-
0 hours
24 hours
48 hours
* P<0.05, ** P<0.01
図 7
皮膚炎における IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-36α、IL-36γ、CX3CL1 の産生は
CX3CR1-/-マウスで減少していた。
イミキモドクリームをマウスの耳に外用して 24 時間後、48 時間後に炎症部分を採取
し、IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-36α、IL-36γ、CX3CL1 の mRNA 発現を調べた。CX3CR1-/マウスでは IL-1β、TNF-α、IL-36α、IL-36γ は 24 時間後と 48 時間後ともに有意に減少
し、IL-6 は 48 時間後に有意に減少し、CX3CL1 は 0、24、48 時間後とすべて有意に
減少していた。データは平均値 ± SEM を用いて表した。*P < 0.05, **P < 0.01
47
*
9
(1x106)
8
7
6
5
4
3
2
1
0
CX3CR1-/-
WT
図 8 腹腔内マクロファージの数は CX3CR1-/-マウスで減少していた。
CX3CR1-/-マウスと野生型マウスの腹腔内に PBS を 5ml 注入し、腹腔液を回収してマ
クロファージの数をカウントした。CX3CR1-/-マウスの腹腔内マクロファージの数は
野生型マウスと比較し有意に減少していた。データは平均値 ± SEM を用いて表し
た。*P < 0.05
48
**
**
*
CX3CL1(ng/ml)
GAPDHに対する相対発現量
C
0.8
WT CX3CR1-/-
0
0.04
*
TNF-α
0.4
0.4
0.3
0.2
0.1
CX3CL1(ng/ml)
0
WT CX3CR1-/-
0.04
*
0.0025
0.002
0.0015
0.001
0.0005
0
WT CX3CR1-/-
0
D
0.5
0.04
WT CX3CR1-/-
0.4
IL-23p19
0.03
0.025
0.02
0.015
0.01
0.005
0
CX3CL1(ng/ml)
0.4
WT CX3CR1-/-
0.035
WT CX3CR1-/-
WT CX3CR1-/-
**
0.003
CX3CL1(ng/ml)
0.6
WT CX3CR1-/-
**
0.0035
WT CX3CR1-/-
0.7
0
IL-6
GAPDHに対する相対発現量
0.18
0.16
0.14
0.12
0.1
0.08
0.06
0.04
0.02
0
WT CX3CR1-/-
図9
B
IL-1β
GAPDHに対する相対発現量
GAPDHに対する相対発現量
A
0
WT CX3CR1-/-
0.04
WT CX3CR1-/-
0.4
CX3CR1-/-マウスでは、mRNA レベルにおいて、IL-1β、IL-6、TNF-α の発現
は減少し、CX3CL1 の刺激は IL-1β、IL-6、TNF-α の発現を抑制する傾向があった。
CX3CR1-/-マウスと野生型マウスの腹腔内に PBS を 5ml 注入し、腹腔液を回収しマク
ロファージを採取した。マクロファージを RPMI 液で培養して CX3CL1 (0、0.04、0.4
ng/ml)を添加して 24 時間培養した。24 時間培養後マクロファージを回収し IL-1β、IL-6、
TNF-α、IL-23p19 の mRNA 発現を測定した。IL-1β、IL-6、TNF-α の産生は、CX3CL1
の刺激がない状態または刺激した状態で CX3CR1-/-マウスの方が野生型マウスと比較
して有意に減少していた(A, B, C)。IL-23p19 の産生に有意な差はなかった(D)。野生型
マウスのマクロファージに CX3CL1 を添加すると IL-1β、IL-6、TNF-α の産生は減少
傾向を示した(A, B, C)。CX3CL1 を添加しても IL-23p19 の産生に変化はなかった(D)。
データは平均値 ± SEM を用いて表した。*P < 0.05, **P < 0.01
49
A
B
20
19.5
19
18.5
18
17.5
17
16.5
16
15.5
15
CX3CL1(ng/ml)
C
70
*
*
WT CX3CR1-/-
0
*
WT CX3CR1-/-
0.04
0.4
20
15
30
10
0
WT CX3CR1-/
0.04
0
D
TNF-α
40
WT CX3CR1-/-
WT CX3CR1-/-
CX3CL1(ng/ml)
(pg/ml)
(pg/ml)
*
25
0
WT CX3CR1-/-
20
図 10
*
5
50
CX3CL1(ng/ml)
*
10
60
0
IL-6
30
(pg/ml)
(pg/ml)
IL-1β
WT CX3CR1-/-
0.04
WT CX3CR1-/-
0.4
IL-23
20
18
16
14
12
10
8
6
4
2
0
WT CX3CR1-/-
CX3CL1(ng/ml)
0.4
WT CX3CR1-/-
0
WT CX3CR1-/-
0.04
WT CX3CR1-/-
0.4
CX3CR1-/-マウスでは、蛋白レベルにおいて、IL-1β、IL-6、TNF-α の発現は
減少し、CX3CL1 の刺激は IL-1β、IL-6、TNF-α の発現を抑制する傾向があった。
CX3CR1-/-マウスと野生型マウスの腹腔内に PBS を 5ml 注入し、腹腔液を回収してマ
クロファージを採取した。マクロファージを RPMI 液で培養して CX3CL1(0、0.04、
0.4 ng/ml)を添加して 24 時間培養した。24 時間培養後の溶液を回収して IL-1β、IL-6、
TNF-α、IL-23 のタンパク量を ELISA で測定した。IL-1β、IL-6、TNF-α の産生は、CX3CL1
の刺激をしない状態で CX3CR1-/-マウスの方が野生型マウスと比較して有意に減少し
ていた(A, B, C)。IL-23 の産生に有意な差はなかった(D)。野生型マウスのマクロファ
ージに CX3CL1 を添加すると IL-1β、IL-6、TNF-α の産生は減少していた(A, B, C)。
CX3CL1 を添加しても IL-23 の産生に変化はなかった(D)。データは平均値 ± SEM
を用いて表した。*P < 0.05
50
MCP-1 (M1)
B
*
GAPDHに対する相対発現量
GAPDHに対する相対発現量
A
0.0035
0.003
0.0025
0.002
0.0015
0.001
0.0005
0
CX3CR1-/-
WT
MRC-1 (M2)
*
0.0005
0.00045
0.0004
0.00035
0.0003
0.00025
0.0002
0.00015
0.0001
0.00005
0
D
C
Ym1/2 (M2)
GAPDHに対する相対発現量
Arginase1 (M2)
GAPDHに対する相対発現量
CX3CR1-/-
WT
*
0.9
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
WT
*
0.00016
0.00014
0.00012
0.0001
0.00008
0.00006
0.00004
0.00002
0
WT
CX3CR1-/-
CX3CR1-/-
図 11 CX3CR1-/-マウスでは耳において MRC-1、Arginase 1、Ym1/2 の mRNA 発現
が増加していた。
CX3CR1-/-マウスと野生型マウスから耳を採取し MCP-1 (M1 マクロファージのマーカ
ー)、MRC-1、Arginase 1、Ym1/2 (M2 マクロファージのマーカー)の mRNA 発現を測
定した。CX3CR1-/-マウスでは MCP-1 の発現は有意に減少していたが(A)、MRC-1、
Arginase 1、Ym1/2 の発現は有意に上昇していた(B, C, D)。データは平均値 ± SEM
を用いて表した。*P < 0.05
51
*
0.03
0.025
0.02
0.015
0.01
0.005
0
WT
GAPDHに対する相対発現量
C
0.2
0.15
0.1
0.05
0
0.4
0.35
0.3
0.25
0.2
0.15
0.1
0.05
0
CX3CR1-/-
CX3CR1-/-
WT
D
**
0.45
*
0.25
CX3CR1-/-
Arginase1 (M2)
WT
図 12
MRC-1 (M2)
GAPDHに対する相対発現量
MCP-1 (M1)
B
GAPDHに対する相対発現量
GAPDHに対する相対発現量
A
Ym1/2 (M2)
**
4.5E-07
0.0000004
3.5E-07
0.0000003
2.5E-07
0.0000002
1.5E-07
0.0000001
5E-08
0
WT
CX3CR1-/-
CX3CR1-/-マウスでは腹腔マクロファージにおいて MRC-1、Arginase 1、
Ym1/2 の mRNA 発現が増加していた。
CX3CR1-/- マウスと野生型マウスから腹腔内マクロファージを回収して MCP-1、
MRC-1、Arginase 1、Ym 1/2 の mRNA 発現を測定した。CX3CR1-/-マウスでは MCP-1
の発現は有意に減少していたが(A)、MRC-1, Arginase 1, Ym 1/2 の発現は有意に上昇し
ていた(B, C, D)。データは平均値 ± SEM を用いて表した。*P < 0.05, **P<0.01
52
A
WT
CX3CR1-/-
B
*
細胞数/HPF
25
MCP-1
20
15
10
5
0
細胞数/HPF
C
Arginase1
CX3CR1-/-
WT
*
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
WT
CX3CR1-/-
図 13 CX3CR1-/-マウスでは背部の皮膚において MCP-1 陽性細胞は減少し、Arginase
1 陽性細胞は多く存在した。
CX3CR1-/-マウスと野生型マウスから背部の皮膚を採取し、免疫染色にて真皮に浸潤
している MCP-1 または Arginase 1 発現細胞の数を high power field (HPF, x400)で調べ
た(A)。CX3CR1-/-マウスでは MCP-1 陽性細胞の数は有意に減少し(B)、Arginase 1 陽性
細胞の数は有意に増加していた(C)。データは平均値 ± SEM を用いて表した。*P <
0.05
53
A
B
**
0.0004
0.00035
0.0003
0.00025
0.0002
0.00015
0.0001
0.00005
0
CX3CR1-/-
WT
GAPDHに対する相対発現量
**
0.00018
0.00016
0.00014
0.00012
0.0001
0.00008
0.00006
0.00004
0.00002
0
WT
CX3CR1-/-
D
C
腹腔
GAPDHに対する相対発現量
CX3CR1
*
0.12
0.1
0.08
0.06
0.04
0.02
0
WT
CX3CR1-/-
GAPDHに対する相対発現量
耳
GAPDHに対する相対発現量
CCR2
*
0.009
0.008
0.007
0.006
0.005
0.004
0.003
0.002
0.001
0
WT
CX3CR1-/-
図 14 CX3CR1-/-マウスでは耳と腹腔液において CCR2 の mRNA 発現が増加してい
た。
CX3CR1-/- マウスと野生型マウスから耳または腹腔液を採取し CCR2、CX3CR1 の
mRNA 発現を測定した。耳と腹腔液ともに CX3CR1-/-マウスでは MCP-1 の発現は有意
に減少していたが、MRC-1, Arginase 1, Ym 1/2 の発現は有意に上昇していた。データ
は平均値± SEM を用いて表した。*P < 0.05, **P < 0.01
54
A
WT
CX3CR1-/-
B
**
細胞数/HPF
14
CX3CR1
12
10
8
6
4
2
0
細胞数/HPF
C
CCR2
**
18
16
14
12
10
8
6
4
2
0
WT
図 15
CX3CR1-/-
WT
CX3CR1-/-
CX3CR1-/-マウスでは背部皮膚において CCR2 陽性細胞が増加していた。
CX3CR1-/-マウスと野生型マウスから背部の皮膚を採取し、免疫染色にて真皮に浸潤
している CX3CR1 または CCR2 発現細胞の数を high power field (HPF, x400)で調べた
(A)。CX3CR1-/-マウスでは CX3CR1 陽性細胞をほとんど認めず(B)、CCR2 陽性細胞の
数は有意に増加していた(C)。データは平均値 ± SEM を用いて表した。**P < 0.01
55
CX3CR1-/Frequency
Frequency
WT
s
CX3CR1
CX
CX3CR1
Frequency
CCR2
Frequency
CX3CR1
CCR2
CCR2
図 16
CCR2
CX3CR1-/-マウスの腹腔マクロファージは CCR2 を発現していた。
CX3CR1-/-マウスと野生型マウスから腹腔マクロファージを採取し抗 CX3CR1 抗体と
抗 CCR2 抗体、コントロールには goat IgG と rabbit IgG をそれぞれ用いた。青色はコ
ントロール、赤色は CX3CR1 または CCR2 の発現を表現した。CX3CR1-/-マウスの腹
腔マクロファージは CX3CR1 をほとんど発現せずに CCR2 を発現し、一方野生型マウ
スの方は CX3CR1 を発現していたが、CCR2 をほとんど発現していなかった。
56

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