EGFR変異陽性肺癌における血中腫瘍DNAの動態病理

2016/12/21 第57回日本肺癌学会学術集会ランチョンセミナー25 (LS25)
EGFR変異陽性肺癌における
血中腫瘍DNAの動態病理
株式会社DNAチップ研究所
加藤菊也
• 技術紹介
– Deep sequencing
• 臨床試験
– 診断精度の決定
– 血中腫瘍DNA動態観察
• 第３世代EGFR−TKIコンパニオン診断の可能性
– AURA phase I 付随研究（Dana Farber, AstraZeneca, NTU）
• 製品紹介
– DIVA-EGFR
2
言葉の定義
• Cell-free DNA（cfDNA) （血中遊離DNA）
– 血液中に溶解している細胞から放出されたDNA
• Circulating tumor DNA (ctDNA) (血中腫瘍DNA）
– cfDNAの中で腫瘍細胞から放出されたもの
• Liquid biopsy
– 末梢血で腫瘍の構成要素（細胞、DNA等）を検出する
技術
– 最近の総説ではctDNA
3
cfDNAの生化学的特性
血管
細胞死により放出
〜１７０塩基対
〜３０００ゲノム /ml
（CTC 1~10個 /ml）
半減期 16.5分（分娩）
１４４分（外科切除）
がん
細胞
腫瘍特異的遺伝子異常（癌関連
遺伝子変異等）でctDNAを検出
正常
細胞
4
変異特異的PCR
A
正常
G
変異
C
変異特異的プライマー
• 部位依存性が高い
– 個々の遺伝子について別個の最適化が必要
– 最適化しても変異検出性能は部位によって異なる
–
多数の変異部位への対応が難しい
• 定量検出は難しい
5
デジタルPCR
限外希釈
増幅
蛍光標識
6
PM （plasma mutation) score
１０万リードあたりの変異リード数
7
診断精度（感度特異度）の決定〜多施設前向き検証試験
（UMIN-CTR 番号：UMIN000006762）
• 臨床試験実施内容：生検材料と血液を同時採取。生検検体の
結果（PNA-LNA Clamp) を絶対標準として感度特異度を算出。
– 目標症例数算定根拠 – 全体感度の９５％信頼区間を２０％以内に
する症例数として算出。
• 目標症例数：３２０症例。３２１症例収集し２８８例を解析へ。脱
落例は血液あるいは生検検体の不採取による。
• 参加施設：大阪府立成人病センター、大阪市立総合医療セン
ター、大阪大学医学部附属病院。
• 患者登録期間：２０１１年１１月−２０１４年４月。
• EGFR変異測定期間：２０１２年９月−２０１４年７月。
• STARD (Standards for Reporting of Diagnostic Accuracy)
(2003 version) の前向き試験基準をすべて満たしている。
8
前向き試験の結果〜検出システムの性能
感度
特異度
全体感度
Exon 19 del 50.9%
(37.9 - 63.9)
L858R
51.9%
Exon 19 del 98.0%
(38.7 - 64.9)
(88.5 - 100)
L858R
T790M
94.1%
99.0%
(83.5 - 98.6)
(94.2 - 100)
全症例
I - IIIA
IIIB - IV
54.4%
22.2%
72.7%
(44.8 - 63.7)
(11.5 - 38.3)
(60.9 - 82.1)
感度：血液検体陽性症例 / 生検検体陽性症例
特異度：血液検体陰性症例 / 生検検体陰性症例
全体感度：変異の種類を問わない
括弧内：９５％信頼区間
Uchida, J. et al. Clin Chem 2015, 61, 1191
9
活性化変異診断精度〜他の研究との比較
研究種別
測定方法
EGFR変異
陽性症例数
ステージ
感度
（）: IIIB-IV
特異度
I-IV
54.4
(72.7)
94.1, 98.0
進行癌
65.7
99.8
IIIB-IV
76.7
98.2
IIIA-IV
46.0
97.4
研究によっ
て異なる
62.0
95.7
（）：全症例数
Uchida et al.
Deep
前向き
105 (288)
(2015)
sequencing
Douillard et
Qiagen
後ろ向き
118 (859)
al.(2014)
Therascreen
ENSURE
前向き
Rosche
付随研究
214 (601)
後ろ向き？ Cobas v. 2
(FDA 2016)
ACCESS study
施設によって 189 (1152)
前向き
(ELCC 2015)
異なる
Qiu et al.
研究によって
メタ解析
3110
（2015）
異なる
10
リキッド･バイオプシー承認状況
コンパニオン診断薬
Qiagen Therascreen
Rosche Cobas v.2
Rosche Cobas v.2
対象変異
exon 19 del, L858R
exon 19 del, L858R
T790M
対象薬剤
承認
承認日
ゲフィチニブ
CE-IVD 2015/1/12
エルロチニブ
FDA 2016/6/1
オシメルチニブ
FDA 2016/9/29
注：
Qiagen Therascreen 通常生検 -> 血液 (exon 19 del, L858R)
Rosche Cobas v.2
血液 -> 通常生検 (exon 19 del, L858R)
通常生検 -> 血液 (T790M)
11
時系列解析
• 長期動態〜獲得耐性
– 後ろ向き保存検体
• 患者数５７名、解析対象１０例、血液検体数１９０
• ２０１０年１０月〜２０１３年８月
– 前向き探索研究
• 患者数５２名、解析対象２９例、血液検体数５５９
• 患者登録２０１１年１１月〜２０１４年３月、検体採取は２０１４年６月３０日で終了
• 短期動態〜 EGFR-TKI治療開始直後
• 解析対象患者数２１名、血液検体数１６５
• 患者登録２０１３年８月〜２０１４年４月、検体採取は２０１４年８月まで
参加施設：大阪府立成人病センター
12
ctDNA動態の例 (patient 1r)
PML858R
score
(variant allele/100,000 reads)
T790M
CEA
CEA
Gefitinib
Erlotinib
25000
80
20000
60
activating
mutation
15000
40
10000
5000
20
0
-50
0
50
Initiation of EGFR-TKI
150
250
350
PD
resistant
(T790M)
mutation
13
その他の例
patient 5p
patient 4p
Erlotinib+PEM
PEM
Gefitinib
15000
15000
12000
12000
9000
9000
Gefitinib
CDDP+PEM
18000
15000
12000
9000
6000
6000
3000
3000
0
6000
3000
0
0
-50
0
50
100
patient 11p
Gefi% ib,
Erlo%nib
150
200
0
250
400
600
Patient 13p
CBDCA Erlo%nib
n
+nabPTX
Gefi% ib,
Erlo%nib
n
3000
3000
600
2000
2000
400
1000
1000
200
0
-200
200
0
200
400
600
0
-50
0
50
150
250
350
14
A
A
B
Erlo%nib
Gefitinib
B
Erlotinib
CDDP+PEM
50000
18000
16000
40000
15000
12000
Gefitinib
Gefitinib
8000
15000
9000
20000
4000
3000
2000
0
100
200
300
0
500
1000
1500
0
200
400
600
C
500
Gefi% ib,
CBDCA Erlo%nib
n
+nabPTX
Erlo%nib
D
Gefi% ib,
Erlo%nib
n
40000
3000
20000
150
15000
0
100
200
300
400
Gefi, ib$
15000
25000 n
12000
12000
20000
9000
9000
15000
6000
6000
10000
6000
3000
100
1000
10000
2000
-200
0
200
400
600 -100
-50
0
0
100
200
300
400
60
0
50
100
150
200
Gefitinib
250
-200
500
Gefi% ib,
Erlo%nib
n
3000
Gefi% ib,
1000
500
200
0
50
150
250
0
350
0
200
400
Gefitinib
600
200
300
CEA
Cytotoxic
Gefitinib
8000
120
1500
6000
90
1000
4000
60
500
2000
30
-50
0
50
100
150
200
250
0
300
Gefitinib
200
400
Cytotoxic
Cytotoxic +
Erlotinib Cytotoxic
Erlotinib
+Bevacizumab
L858R
0
0
800
CBDCA+PEM
100
2000
e
Gefitinib
0
0
d
800
Erlotinib
600
Erlotinib
CEA
T790M
20000
5000
2500
4000
2000
3000
1500
2000
1000
1000
500
600
200
0
0
800
-50
400
400
2000
20
400
1000
30000
600
4000
T790M
1500
CBDCA
+PTX+BEV
600 40000
2000
-20
F
CDDP+PEM
2500
Erlo%nib
F
800
6000
c
20
0
2000
E
1000
8000
0
0
E
0
0
10000
54000
60
L858R
T790M
CEA
5000
3000
80
0
-50
4000
0
T790M
CEA
Gefitinib
5000
CBDCA+nabPTX
2000
20000
Erlotinib
500
8000
30000
Gefitinib
Exon 19 del
10000
D
15000
CEA
40
0
-100
Erlotinib+PEM
PEM
Gefitinib
C
400
25000
200
50
0
0
250
100
5000
0
0
0
-500
10000
6000
10000
Myocardial
infarction
4000
b
L858R
T790M
300
20000
6000
8000
PEM
25000
12000
30000
a
CBDCA+PEM
Erlotinib
0
50
100
150
200
250
!100$
0$
100$
200$
300$
400$
500$
600
20000
1000
10000
Gefitinib
Erlotinib
400
200
Gefitinib
200
60000
0
50000
PEM
CBDCA
+PEM+BEV
DOC
S1+BEV Gefitinib
0
AMR
-100
-50
0
0
50
150
250
350
-100
0
100
300
Erlo. nib"
n
Cytotoxic
40000
400
600"
30000
Gefitinib
8000
800
200"
L858R
200"
20"
80"
150"
15"
100"
10"
50"
5"
500
25
400
20
-200
0
200
400
600
800
0
1200
1000
(100""
Gefitinib+GEM
6000
600
300
4000
400
2000
200
G
Gefitinib
10
100
5
200
4000
160
3000
120
2000
0
-100
0
100
300
500
700
0
0
100
200
300
400
1000
500
-200
Gefitinib
8000
20
24441
6000
17407
4000
H
10
2000
200
400
Gefitinib
600
CDDP+PEM
0
1000
800
100
200
300
400
(100""n
Cytotoxic
Cytotoxic"+"
CEA
Gefi. ib
Gefi. ib"
0
-50
-150
25
5000
20
4000
15
3000
10
2000
5
1000
0
50
150
250
350
200""
300""
0"
400""
d
6000
5000
100""
L858R n
T790M
30
15000
10000
0""
0
150
Erlo. nib
200
250
300
350
400
e
PEM
100
2000
80
20000 n
5000"
1500
60
15000
4000"
1000
40
10000
500
20
Exon 19 del
T790M
Gefi. ib"
3000"
0
0
200""
2500
5
0
100""
20000
40
0
15
0""
L858R
T790M
80
0
C
-100
0
800
CEA
Gefi. ib"
0"
0"
300"" 400"" 500""
c
Gefitinib+PEM
5000
15
200
20"
0"
0
PEM
700
40"
200
10000
B
600
100"
60"
20000
Gefitinib
500
CEA
400"
A
400
b
Gefi. ib"
800"
100 200 300 400 500 600
200
a
600
L858R
0
0
0
AZD
9291
0
-100
0
0
100
200
300
400
500
600
700
800
2000"
5000
1000"
0
0"
50"
100"
150"
0"
200"
15
PD検出点とctDNA上昇開始点との関係
活性化変異
T790M
最終測定点
(ctDNA+)
最終測定点
(ctDNA-)
-400
-200
0
１００日
PD
200
400
600
800
1000
（ctDNA上昇開始日）-（PD検出日）
16
Monitoring EGFR T790M with plasma DNA from lung cancer patients in a prospective
observational study
１００日
Sueoka-Aragane, N. et al. Cancer Sci 2016, 107, 162
17
獲得耐性症例のctDNA出現率
18
血漿検体のみによる診断の可能性
(by KK based on AURA I)
アレル比（T790M/活性化変異） ≥ ０．１？
オシメルチニブ
アレル比（T790M/活性化変異） < ０．１？
他治療
活性化変異 (+)
他治療
活性化変異 (-)
判定不能？
オシメルチニブ？
T790M (+)
T790M (-)
アレル比（T790M/活性化変異） ≥ ０．１？
オシメルチニブ
アレル比（T790M/活性化変異） < ０．１？
他治療
活性化変異 (+)
判定不能？
オシメルチニブ？
注：T790M(+)活性化変異(-)症例については別途評価必要. ？：臨床試験による評価必要.
活性化変異 (-)
19
Indication of use for the cobas® EGFR Mutation Test v2
(from FDA home page)
The efficacy of TAGRISSO™ (osimertinib) has not been established
in the EGFR T790M plasma-positive, tissue-negative or unknown
population and clinical data for T790M plasma-positive patients are
limited; therefore testing using plasma specimens is most
appropriate for consideration in patients from whom a tumor biopsy
cannot be obtained.
20
EGFR-TKI Rechallenge
Erlotinib
+Bevacizumab
L858R
patient 5r
Cytotoxic
Cytotoxic +
Erlotinib
Erlotinib Cytotoxic
Erlotinib
CEA
T790M
20000
5000
2500
4000
2000
3000
1500
2000
1000
1000
500
0
-100
0
0
100
200
Erlotinib
300
Gefitinib
CBDCA
+PEM+BEV
Gefitinib
400
500
PEM
600
700
DOC
S1+BEV Gefitinib
800
AMR
AZD
9291
60000
600
50000
40000
patient 9p
400
30000
20000
200
10000
0
-200
0
200
400
600
800
1000
0
1200
21
ctDNA動態の数値指標化
ctDNAレベル
A
治療開始
MART=
B
A
Mutation Allele Ratio in Therapy (MART)
B
時間
EGFR-TKI初回投与１４日
PD後諸治療７〜９８日 (中央値３６日）
22
薬物療法の効果判定 ~ RECIST vs MART
EGFR-TKI初回投与
PD後諸治療
1.00E+03
1.00E+03
1.00E+02
1.00E+02
1.00E+01
1.00E+01
1.00E+00
1.00E+00
1.00E-01
1.00E-01
1.00E-02
1.00E-02
1.00E-03
1.00E-03
1.00E-04
1.00E-04
1.00E-05
1.00E-05
0
PD1
2
PR
3
0
1
PD/SD
2
PR
3
予測精度 (PD/SD vs PR)
94.7% (95%CI, 73.5-100)
23
短期動態 ~ EGFR-TKI開始直後のctDNA動態
16,000
16
1,600
12,000
12
1,200
250
200
150
8,000
800
8
100
4,000
4
0
0
-10
0
10
20
30
40
400
50
0
-10
0
10
20
30
40
0
0
10
20
30
40
1 week
8,000
6,000
500
150
400
120
300
90
200
60
100
30
600
300
400
200
200
100
4,000
2,000
0
-20
0
0
20
40
0
0
0
10
20
30
40
0
0
10
20
30
40
EGFR-TKIによる細胞破壊のため新たに放出されるctDNAがある
24
ctDNA動態のデータはすべて公開
• 長期動態後ろ向き研究
– Uchida, J., Imamura, F., Kukita, Y., Kumagai, T., Nishino, K., Inoue, T.,
Kimura, M., Oba, S. and Kato, K. Dynamics of circulating tumor DNA
represented by the activating and resistant mutations in epidermal growth
factor receptor–tyrosine kinase inhibitor treatment. Cancer Science. 107
(2016) 353-358.
• 長期動態前向き探索研究
– Kato, K., Uchida, J., Kukita, Y., Kumagai, T., Nishino, K., Inoue, T., Kimura,
M., Oba, S. and Imamura, F. Numerical indices based on circulating
tumor DNA for the evaluation of therapeutic response and disease
progression in lung cancer patients. Scientific Reports. 6 (2016) 29093.
• 短期動態前向き探索研究
– Kato, K., Uchida, J., Kukita, Y., Kumagai, T., Nishino, K., Inoue, T., Kimura,
M. and Imamura, F. Transient appearance of circulating tumor DNA
associated with de novo treatment. Scientific Reports. 6 (2016) 38639.
25
まとめ
• 診断方法
– 感度 65 – 75%、特異度 95 – 100%（活性化変異）
– 次世代シーケンシングのメリット
• ctDNAを定量できる
• 多数の遺伝子変異部位に拡張可能
– Exon 19 del BEAMing, ddPCR (2016 version) 4タイプ、deep sequencing 8タイプ
– （ALK fusion, RET fusion, ALK resistant, MET準備中）
• 長期動態
– EGFR-TKI投与開始後ctDNAは急速に消失
– 再出現
•
•
•
•
活性化変異が早期に出現する傾向、ctDNA量も多い
PD後１００日を越えて出現する例は殆ど無い
PD症例中のT790M出現率 30 – 40%
新規治療が奏功する場合ctDNAが消失するので注意が必要
– ctDNAの増減は薬剤奏功性と相関
26
コンパニオン診断への応用
• 第一世代EGFR-TKI （ゲフィチニブ、エルロチニブ）
– 特異度が高い → 血液検体陽性 ≈ 生検検体陽性
– 血漿検体第一選択というスキームが成り立つ
• 第三世代EGFR-TKI （オシメルチニブ）
– 測定のタイミング
• 画像診断によるPDよりも最大１００日出現が遅れる可能性がある
• 他治療の介入によりctDNA消失の可能性がある
– 血漿T790M陽性陰性群ともにオシメルチニブ奏功例非奏功例が混在
– 臨床試験による検証が必要
• 相対アレル比（T790M/活性化変異）とオシメルチニブ奏功性との関連性
• ctDNA陰性（活性化変異陰性）例のオシメルチニブ奏功性
• （PD後のctDNA陽性率の時系列解析）
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成人病センター研究所
加藤菊也
久木田洋児
佐々木志穂
京都大学情報学研究科
大羽成征
成人病センター呼吸器内科
今村文生
内田純二
熊谷融
西野和美
奥山貴子
大阪市立総合医療センター
田中晃司
駄賀晴子
大阪大学医学部附属病院
長友泉
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DIVA-EGFR
(Digital Identification of Variant Alleles for EGFR)
•
Deep sequencingによるEGFR変異検出の製品版
– 現時点では研究用検査
•
最も検証された血中腫瘍DNA定量検出システム
– ２８８症例の多施設前向き試験で検証
•
対象疾患
– （IIIB及びIV期）非小細胞性肺癌
•
対象EGFR変異
–
–
–
–
•
エクソン１９欠失、L858R、T790M
L861Q
RAF (relative allele frequency) T790M / activating mutation
C797Sも追加可能
検査結果報告
– ２週間
– 指定せず
29
判定基準
PM score
100,000
[偽陽性率]
~1%
活性化変異
>=LOQ
＋
<LOQ >=LOD
±
<LOD
ー
T790M
＋
ー
ー
~5%
定量限界
Limit of quantitation
(LOQ)
＋：陽性
±：陽性、通常生検試料での確認が望ましい
ー：陰性
検出限界
Limit of detection
(LOD)
[偽陽性率]：肺生検検体の結果を真とした場合の偽陽性率
30
専用採血管キット使用上の注意
• 専用採血管（Streck tube)
– 細胞安定剤入り、4 – 37 ℃で安定
– 丁寧な撹拌が必要
– EDTA採血管の後・血糖採血管の前に使用
• 検体の輸送
– 宅急便（ゆうパック指定）常温輸送
– ３重梱包
– 発送確認のため依頼書をファックスで送信のこと
31

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