DISS. ETH No. 23852 ENGINEERING - ETH E

DISS. ETH No. 23852
ENGINEERING INORGANIC NANOMATERIALS FOR THE CAPTURING, STORAGE
AND RELEASE OF BIOMOLECULES
A thesis submitted to attain the degree of
DOCTOR OF SCIENCES of ETH ZURICH
(Dr. sc. ETH Zurich)
presented by
VLADIMIR ZLATESKI
MSc Molecular Life Sciences, Jacobs University
born on 12.05.1987
citizen of Macedonia
accepted on the recommendation of
Prof. Dr. Wendelin J. Stark, examiner
Prof. Dr. Javier Pérez-Ramírez, co-examiner
Dr. Robert N. Grass, co-examiner
2016
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Zusammenfassung
Partikel-Hybridsysteme aus Biomolekülen und anorganischen Materialien sind aufgrund ihrer
Anwesenheit in der Natur gut bekannt. Sie werden von optimierten biologischen Prozessen,
die sich auf der Nanoskala befinden, geregelt. Die Nanotechnologie als wissenschaftliche
Disziplin hat viel vom erweiterten Verständnis der schwachen chemischen Wechselwirkungen
und der kombinierten Eigenschaften der biomolekularen/anorganischen Hybridmaterialien
profitiert. Dies hat während der letzten Jahrzehnte zur Entwicklung von neuartigen,
einzigartigen und intelligenten Hybridmaterialien geführt. Diese Materialien sind für
biologische und auch für nichtbiologische Anwendungen vielversprechend. Die vorliegende
Doktorarbeit setzt sich mit den Fortschritten in der Entwicklung und Anwendung von
biomolekularen/anorganischen Partikel-Hybridsysteme (vor allem Proteine und Nukleinsären
in Kombination mit anorganischen Materialien) in verschiedenen Disziplinen auseinander.
Kapitel 1 fasst die Wechselwirkungen zwischen Biomolekülen und anorganischen Partikeln
zusammen, mit dem Fokus auf Nanomaterialien. Dieses Kapital gibt einen Überblick über die
Nanotechnologie und über das neue Feld der Nanobiotechnologie. Hier sehen wir auf welche
Art und Weise die Biomoleküle und die anorganischen Materialien zusammenwirken können
und wie daraus einen Vorteil erzielt werden kann. Es wird aufgezeigt, wie das Verständnis
dieser Wechselwirkungen von Forschern angewendet wurde, um eine Vielfalt von
Hybridmaterialien zu erschaffen, welche für biologische und nichtbiologische Anwendungen
nützlich
sind.
Zum
Schluss
wird
ausführlich
über
die
Anwendungen
dieser
biomolekularen/anorganischen Partikel-Hybridsysteme in den Bereichen Biokatalyse und
DNA-Anreicherung gesprochen.
Kapitel 2 konzentriert sich auf die Anwendung von Hybridmaterialien bestehend aus einer
Kombination von Enzymen und magnetischen Nanopartikeln in der Biokatalyse. Im Streben
nach robusten und wiederbenutztbaren Biokatalysatoren für die industrielle synthetische
Chemie, nimmt die Bedeutung von Nanotechnologie stetig zu. In letzter Zeit wurden vermehrt
Biomoleküle, insbesondere Enzyme, auf verschiedene Nanomaterialien immobilisiert.
Kohlenstoff-beschichtete magnetische Nanopartikel haben sich aufgrund ihrer grossen
Oberfläche, der hohen magnetische Sättigung und der bekannten Chemie als ein
vielversprechender Enzymträger erwiesen. Hier wird gezeigt, wie kohlenstoffbeschichtete
Kobaltnanopartikel chemisch funktionalisiert werden können um Enzyme auf die Oberfläche
zu immobilisieren. Die Enzym/Kobaltpartikel Konjugate konnten sowohl im Kleinansatz
(Milliliter) als auch in grösseren Pilotreaktionen (mehrere Liter) rezykliert werden.
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In Kapitel 3 wird ein neuartiges Vorgehen gezeigt, mit dem Enzyme auf mesoporöse Silikate
immobilisiert, eingeschlossen, inaktiviert und danach beliebig wieder in aktivem Zustand
freigesetzt werden können. Beta-Glukosidase wurde als Modellenzym auf mesozellulären
Silika-Schaumstoff immobilisiert. Zusätzlich wurde das Enzym durch das Ausfällen von
Silika in den Kanälen des Materials eingeschlossen. Das Enzym war im eingeschlossenen
Zustand nicht reaktiv und zeigte eine grosse Thermostabilität. Nach einem milden SilikaAuflösungsschritt durch die Verwendung eines fluoridhaltigen Puffers wies das Enzym
wieder den grössten Teil der ursprünglichen Aktivität auf. Dieses Prinzip zur Enzymlagerung
in Silika kann neben Beta-Glukosidase auch auf weitere Enzyme angewendet werden.
Kapitel 4 beschreibt die Verwendung von neuartigem Silikat-beschichteten Eisen-Kohlenstoff
Verbundwerkstoff für die Anreicherung von spezifischen DNA Sequenzen. Dank des
magnetischen Kernes können die Partikel sehr schnell abgetrennt werden und die intrinsisch
nicht-DNA
bindende
Silikatoberfläche
ermöglicht
eine
einfache
chemische
Funktionalisierungen mit Hilfe von Silanchemie. Das im Labor hergestellte Material wurde
chemisch funktionalisiert um einzelsträngige DNA-Moleküle auf die Silikaoberfläche
kovalent binden zu können. Das mit einzelsträngiger DNA geladene Material wurde dafür
verwendet um auf selektive Art und Weise die komplementäre Sequenz aus einer Mischung
von verschiedenen DNA-Sequenzen aufzukonzentrieren. Hier wird somit eine einfache,
schnelle
und
zuverlässige
Methode
erarbeitet,
welche
die
selektive
Bindung,
Aufkonzentration, Aufreinigung und zum Schluss das Detektion der zu analysierenden DNASequenz ermöglicht.
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Summary
Biomolecule/inorganic particle hybrid systems are well known for their existence in living
organisms. They are governed by nanoscale bioprocesses that have been optimized for years.
Nanotechnology is the field that largely profited from the understanding of those weak
interactions and from combining the chemical and physical properties of both entities into a
single unit. Throughout the last decades this has led to the development of novel, unique and
smart hybrid materials which hold a great promise for both biological and non-biological
applications.
In the present thesis recent advances in the design and application of
biomolecule/inorganic particle hybrids (mainly proteins and nucleic acids as biomolecules) in
different disciplines are reported.
Chapter 1 gives an overview of the interactions between biomolecules and inorganic materials
with a focus on nanomaterials. It gives a brief introduction about the field of nanotechnology
and the emerging field of bionanotechnology. In this chapter we see how biomolecules and
inorganic materials interact in nature to their mutual benefit. We see how scientists exploited
the understanding of these interactions for the purpose of creating a variety of hybrid
materials and use them in many biological and non-biological applications. Lastly, we talk
more in detail about the applications of such biomolecule-inorganic material hybrids in
biocatalysis and DNA enrichment.
Chapter 2 focuses on the use of enzyme/magnetic nanoparticle hybrids in biocatalysis. In the
pursuit
of
robust
and
reusable
biocatalysts
for
industrial
synthetic
chemistry,
nanobiotechnology is currently taking a significant part. Recently, enzymes have been
immobilized on different nanoscaffold supports. Carbon-coated metallic nanoparticles were
found to be a practically useful support for enzyme immobilization due to their large surface
area, high magnetic saturation, and familiar surface chemistry. Carbon-coated cobalt
nanoparticles were chemically functionalized, activated for bioconjugation and subsequently
used in enzyme immobilization. The enzyme-support conjugates could be recycled on a
millilitre to litre scale.
In Chapter 3, we talk about a novel approach to immobilize and then release enzymes from
mesoporous silicates. Beta glucosidase was immobilised as a model enzyme within
mesocellular foam (MCF) at a high loading. The enzyme was further entrapped within the
material by precipitating additional silica within the channels. Although unreactive while
entrapped, in this state the enzyme was highly stable towards heat treatments. Upon release
from the matrix by a mild silica dissolution step involving a fluoride comprising buffer, the
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enzyme regained most of its original activity. The principle can be adapted to many
previously developed mesoporous silica/enzyme biocomposites.
Chapter 4 describes the use of novel silica-coated iron-carbon composites in DNA
enrichment. The magnetic iron core allows a fast separation whereas the silica surface has an
anti-fouling character and could be easily functionalized simply by silane chemistry. The inhouse produced material was further functionalized for DNA binding and single-stranded
DNA sequences were covalently bound to the silica surface. The ssDNA-loaded material was
used to selectively fish out the complementary oligonucleotide from a DNA mixture, from
different volumes and at different concentrations. An easy, fast and reliable procedure to bind
and release a target ssDNA and subsequently detect and quantify it with standard in-house
equipment was shown.

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