Einfluss von Filaminen auf die Aktindynamik im Podozyt

Einfluss von Filaminen auf die Aktindynamik im Podozyt
Jonas Greiten1, Felix Kliewe1, Karlhans Endlich1, Nicole Endlich1
1 Institut
für Anatomie und Zellbiologie, Universitätsmedizin Greifswald, Greifswald
Hintergrund
Podozyten sind hoch spezialisierte epitheliale Zellen der Niere, die einen wesentlichen Bestandteil der glomerulären Filtrationsbarriere ausmachen.
Zur Gewährleistung ihrer Filtrationsfunktion bilden die Zellen interdigitierende Fußfortsätze aus. Morphologische Veränderungen dieser Podozytenfußfortsätze bzw. der Verlust der Zellen führen zum Verlust von hochmolekularen Proteinen, dem klinischen Bild der Proteinurie. Die Folge ist oft eine
nicht zu therapierende Niereninsuffizienz.
Die AG Endlich konnte zeigen, dass Podozyten in vitro bei Druckbelastung die Organisation ihres Aktinzytoskeletts drastisch verändern. Bisher ist
jedoch kein Mechanosensor identifiziert, welcher für die Wahrnehmung und Weiterleitung der mechanischen Kräfte verantwortlich ist.
Ein möglicher Kandidat ist die Gruppe der Filamine, da diese durch Bindung an Integrinen eine wichtige Rolle im outside-in-signaling spielen könnten.
Filamine im Podozyten

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Sind Gerüstproteine und Vernetzer der Aktinfilamente
Organisieren die Bildung und den Erhalt von Zellfortsätzen
Mögliche Mechanosensoren, da sie Integrine binden und eine Rolle im outside-in-signaling spielen
Nehmen an unterschiedlichen Signalwegen abhängig von der Dehnung des Aktin-Zytoskeletts teil
Ergebnisse und Ausblick
Filamin A und B wurden mit spezifischen siRNAs heruntergeknockt, um die Auswirkungen auf immortalisierte murine Podozyten zu untersuchen. Der
Knockdown konnte mit Immunfluoreszenz und Western Blot bestätigt werden. Dabei fiel auf, dass das Aktin-Zytoskelett bei Filamin A KnockdownZellen verändert ist und weniger bzw. unorganisiertere Stressfasern aufweist. Gleichzeitig zeigte sich, dass Filamin B hochreguliert ist. Eventuell fängt
Filamin B den Verlust von Filamin A ab. Dies erscheint schlüssig, da im mechanischen Stressmodell Filamin A bzw. B Knockdown-Zellen genauso häufig
von der Extrazellulärmatrix abfallen wie unbehandelte Zellen. Sind jedoch sowohl Filamin A als auch B gleichzeitig heruntergeknockt, fallen ca. 20
Prozent mehr Zellen ab als bei der Kontrollgruppe. Bei Filamin A Knockdown ist darüber hinaus das podozytenspezifische Aktin-bindende Protein
Synaptopodin deutlich heruntereguliert. Dieser Zusammenhang soll nun weiter charakterisiert werden. Außerdem soll die Migration der Podozyten
bei Verlust der Filamine und der Einfluss auf Fokalkontakt-Proteine, wie Talin-1 und Vinculin, nähergehend untersucht werden.
Mechanisches Stressmodel
Murine immortalisierte Podozyten werden auf flexiblen Silikonmembranen kultiviert und zyklischem
biaxialen mechanischen Stress ausgesetzt. Damit wird die Druckbelastung der Podozyten simuliert,
wie sie beispielsweise bei glomerulärer Hypertonie im Rahmen diapetischer Nephropathie auftritt.
Die Zellen antworten mit einer typischen Umstrukturierung des Aktinzytoskeletts unter Bildung von
ARCs (actin rich center).
Kontrolle
Stretch
Fragestellung:
Relative Zellzahl mit Filamin A oder B Knockdown im
Vergleich zur Kontrolle nach 72h mechanischer Dehnung
Podozyten scheinen auf
mechanischen Stress reagieren zu
können.
1,2
1
Welche Proteine ermöglichen den
Zellen die Mechanosensibilität?
Quelle: „The podocyte in health and disease: insights from the mouse”;
Jean-Louis R. Michaud, Chris R. J. Kennedy
Quelle: „Filamin and filamin-binding proteins in integrin-regulation and
adhesion. Focus on: FilaminA is required for vimentin-mediated cell adhesion
and spreading“; Matthew MacPherson, Susanna C. Fagerholm
Knockdown von Filamin A verändert das Aktin-Zytoskelett
Filamin A
F-Aktin
0,6
Knockdown von Filamin B
Filamin A F-Aktin Zellkern
Kontrolle
Filamin B Knockdown
Filamin B
GAPDH
Filamin A
Filamin B
Filamin B
GAPDH
GAPDH
GAPDH
Knockdown von Filamin A mittels spezifischer siRNA führt zu einem
verändertem Aktin-Zytoskelett (siehe links), einer Hochregulation von
Filamin B (siehe WB; Mitte) und einer Herunterregulation der Synaptopodin-Expression (siehe rechts).
Relative Zellzahl mit Filamin A und B Knockdown im
Vergleich zur Kontrolle nach 72h mechanischer Dehnung
1,2
Wie verhalten sich Filamin A/B KD Zellen im mechanischen Stressmodell?
1
Einfachtransfektion
0,8
Dazu wird die Adhäsivität der
Zellen in Abhängigkeit der
Filamine untersucht.
Tangentiale Dehnung: 5%; Frequenz: 0,5Hz
Schematische Darstellung des Dehnungsapparates
1,00409286
1
1,081639881
0,6
0,4
0,4
0,2
0,2
0
CTRL siRNA
CTRL siRNA
FLNAFLNAsiRNA
siRNA
Doppeltransfektion
0,8
FLNB siRNA
0
FLNB siRNA
1
0,747452081
CTRL CTRL
siRNA
siRNA
FLNA
FLNB siRNA
FLNAsiRNA
siRNA + FLNB +
siRNA
Filamin A Knockdown reduziert die Synaptopodin-Expression
Filamin A
Synaptopodin
F-Aktin
Filamin A Synpo F-Aktin

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