今日の話題 植物を丸ごと透明化し，中まで蛍光観察する新技術を開発 化学と生物 ● 日本農芸化学会 細胞レベルでの個体全体の観察を目指して 生物の成り立ち，働きを知るうえで，からだの構造を 隅々にまで Sca e が浸透し，からだの中が均一化され 観察することは非常に重要である．しかし，多くの生物 る．また，グリセロールはタンパク質や組織の安定化に のからだは不透明なため，からだの奥深くを直接観察す 寄与していると考えられ，蛍光タンパク質は高濃度の尿 ることは非常に困難である．これまで，からだの奥深く 素でも壊れることはないため，Sca e により透明になっ を観察するためには，からだを解剖して，その切断面を たマウスの脳を丸ごと蛍光観察することが可能となって 観察する必要があった．しかし，からだに傷をつけるた いる． め，ありのままの状態を解析することは難しかった．そ 2014 年に Warner らにより Sca e を用いた植物の透明 のうえ，切断面の観察だけでは二次元情報しか得ること 化が試みられたが，十分な透明度を得られるのに 1∼3 ができないが，からだは三次元の構造なので，もとのか 週間かかると報告された (2)．迅速な透明化を阻んでいる らだの構造を再構築するためには，極めて薄くからだを のは，植物細胞に豊富に存在する色素，クロロフィルの 切断し，また膨大な数の切断面像を欠くことなくすべて 存在であった．クロロフィルは葉緑素としても知られ， 取得するという，非常に煩雑で難しい作業が必要とな 太陽光のエネルギーを吸収して光合成にかかわる色素で る．そのため，近年，からだを透明にして，直接からだ ある．そのためクロロフィルが存在していると光エネル の奥深くまで丸ごと観察する研究が注目されている． ギーを吸収してしまうため，蛍光タンパク質を光らせる からだを透明にするとはどういうことであろうか．そ ための励起光も，光った蛍光も吸収されてしまい，蛍光 もそも，からだが不透明であるのは，光を吸収してしま タンパク質を観察することはからだの深部になるほど困 う色素などが含まれること，また，からだは屈折率の違 難であった． うさまざまな物質で構成されているためである．細胞一 昨年，筆者らは，クロロフィルを植物から効果的に取 つをとってみても屈折率は均一ではなく，植物細胞の場 り 除 く こ と が で き る 化 合 物 を ス ク リ ー ニ ン グ し て， 合，細胞壁が 1.42，細胞質が 1.36 であるため，照射した ClearSee を開発した (3)．界面活性剤としてデオキシコー 光は細胞を通過するごとに屈折してしまい，からだを ル酸ナトリウムを用いることにより，蛍光タンパク質を まっすぐ通過することはできない．そのため，からだを 壊すことなく迅速にクロロフィルを植物から取り除くこ 透明にするためには，光を吸収してしまう色素を取り除 とに成功した．図 1 はモデル植物のシロイヌナズナを透 くこと，そしてからだの中の屈折率を均一にすることが 明化したものであるが，葉の緑色が抜け，透きとおって 必要である． いることがわかる．透明化の手順は簡単で，まずパラホ しかしすべてを透明にしてしまっては，自分が観察し ルムアルデヒド溶液に 1 時間浸けて組織を固定した後， たいものも透明になり，何も見えなくなってしまう．そ ClearSee 溶液に浸けるだけである（図 1） ．植物の組織 こで活躍するのが蛍光タンパク質である．蛍光タンパク によって透明化にかかる時間は変わるが，図 1 の植物の 質は特定の細胞で発現させたり，特定のタンパク質につ 場合，ClearSee を用いると 3∼4 日間で透明化は達成さ なげることによって，自分が観察したい細胞，タンパク れる．このように透明化することで，めしべの奥深くで 質などに目印をつけることができるため，からだが透明 伸びている花粉管の様子も，カラフルに観察することが になっても観察することが可能である．透明化の研究が 可能となった（図 2） ． 活発に行われ始めたのは，2011 年理化学研究所の宮脇 植物の研究はこれまで，観察の困難さもあり，根・ 敦史博士のグループにより，蛍光タンパク質の蛍光を保 葉・花というように個々の器官にフォーカスして研究が 持したまま，マウスの脳を透明化することに成功してか 行われてきた．しかし，移動できない植物はさまざまな (1) らである ．開発された透明化試薬 Sca e は尿素，界面 環境に対応するために，各器官で感知したシグナルを全 活性剤 TritonX-100，グリセロールの 3 種類の化合物か 身に伝えることにより環境変化に対処するという研究 ら構成される．尿素，界面活性剤の作用により，組織の が，近年注目されてきている．全身的なシグナルの解析 794 化学と生物 Vol. 54, No. 11, 2016 今日の話題 ある．ClearSee による透明化には数日間かかることと， 光を吸収する物質がまだ組織に残っていることの 2 点が 挙げられる．1 点目の処理時間については，今年，透明 化にかかる時間を 2 時間程度にまで短縮した TOMEI 法 が開発された (4)．この方法では，からだの中を均一する 溶液として，1.52 と高い屈折率をもつ 97％ 2,2′-チオジエ タノールを用いている．2,2′-チオジエタノールにはクロ ロフィルを取り除く作用はないため，クロロフィルを迅 速に取り除く手段として，固定溶液に酢酸・エタノール 日本農芸化学会 混合液といった有機溶媒が用いられている．しかしなが ら，有機溶媒は蛍光タンパク質を壊してしまうため，か らだの内部を観察するためには蛍光色素で染める必要が ある．固定にパラホルムアルデヒド溶液を使うことによ り，TOMEI 法でも蛍光タンパク質を観察できるが，ク ロロフィルは残っているため，より奥深くの観察には課 2 点目として，ClearSee でクロロフィルは取り除ける 図 1 ■ クリアシーによる植物透明化 が，まだ残っている色素などが存在する．そのなかで も，細胞壁に存在し機械的強度を担っているフェノール 化合物リグニンは，植物に多量に存在するために，さら 化学と生物 ● 題が残る． なる透明化に向けては取り除きたい化合物である．木材 からリグニンを取り除き，透明化する方法もいくつか報 告されているが (5, 6)，亜塩素酸ナトリウムと 70∼80 C の 高温処理により取り除くというように，蛍光タンパク質 には厳しい条件のため，穏やかな条件でリグニンを取り 除く新たな手法の開発が望まれる．適用可能な植物種が 増え，さらなる透明化が達成されれば，野外の植物も詳 細に観察でき，農業現場における不稔や病虫害などの原 因究明・問題解決にも役立つと期待される． 図 2 ■ クリアシーにより透明化したシロイヌナズナめしべ 花粉管を 4 色の蛍光タンパク質により色分けている．文献 3 より転 載． には，個々の器官の観察だけではなく，細胞レベルで個 体全体を観察することが重要であり，今回開発した ClearSee による透明化技術は重要なツールになると期 待される． 1) H. Hama, H. Kurokawa, H. Kawano, R. Ando, T. Shimogori, H. Noda, K. Fukami, A. Sakaue-Sawano & A. Miyawaki: , 14, 1481 (2011). 2) C. A. Warner, M. L. Biedrzycki, S. S. Jacobs, R. J. Wisser, J. L. Caplan & D. J. Sherrier: , 166, 1684 (2014). 3) D. Kurihara, Y. Mizuta, Y. Sato & T. Higashiyama: , 142, 4168 (2015). 4) J. Hasegawa, Y. Sakamoto, S. Nakagami, M. Aida, S. Sawa & S. Matsunaga: , 57, 462 (2016). 5) Y. Okahisa, A. Yoshida, S. Miyaguchi & H. Yano: , 69, 1958 (2009). 6) Y. Li, Q. Fu, S. Yu, M. Yan & L. Berglund: , 17, 1358 (2016). （栗原大輔，名古屋大学，JST, ERATO） しかし，ClearSee を用いた透明化にはまだ改善点が 化学と生物 Vol. 54, No. 11, 2016 795 今日の話題 プロフィール 栗原 大輔（Daisuke KURIHARA） ＜略歴＞2004 年大阪大学工学部応用自然 科学科卒業／2009 年同大学大学院工学研 究科博士課程修了，博士（工学）／同年日本 学術振興会特別研究員（PD）（名古屋大 学）／2011 年名古屋大学大学院理学研究科 特任助教，現在に至る＜研究テーマと抱 負＞細胞間コミュニケーションを用いた植 物生存戦略．ありのままを観察する＜趣 味＞育児 化学と生物 ● 日本農芸化学会 Copyright © 2016 公益社団法人日本農芸化学会 DOI: 10.1271/kagakutoseibutsu.54.794 796 化学と生物 Vol. 54, No. 11, 2016
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