分子の自己組織化を利用する簡便・高感度な蛍光

分子の自己組織化を利用する
簡便・高感度な蛍光センシング
九州大学大学院工学研究院
野口
誉夫
背景
1
生体中に存在するアニオン性物質
－生命活動や病態の指標となる鍵物質－
生命現象：
低分子
 物質生産・代謝
 遺伝情報の転写・翻訳・複製
 細胞内外の情報伝達
DNA
RNA
 生体防御機構（免疫応答）
生命活動を担う鍵物質の量・分布
生命活動・病態の指標
タンパク
特定・検出する技術
病態診断・創薬へ応用
技術概要
2
生体由来アニオンを検出する蛍光センサ
 従来型： Lock-and-Key 結合
標的物質
結合
会合
蛍光センサ
発蛍光
消光
 新技術：自己組織化型蛍光センサ
標的物質
結合
蛍光センサ
自己組織化
発蛍光
標的物質と共に組織化して初めて蛍光を発する蛍光センサ
分子設計指針
3
凝集誘起発光性色素を利用する蛍光センサ
OPVセンサ
発蛍光部位
オリゴフェニレンビニレン (OPV)
積層構造を形成することで初めて
蛍光を発光 → turn-on型蛍光応答
 励起・蛍光波長制御
 大きなストークスシフト
(>100 nm)
 高いシグナル/ノイズ(S/N)
比(>10)
エーテルスペーサー
水溶性の付与
(アルキル鎖では水に不溶)
グアニジウムレセプター
アニオン基とのイオン性
水素結合
新技術：自己組織化を利用する蛍光センシング
4
分子構造の微視的な差異 → 全く異なる蛍光アウトプット
L-酒石酸
(anti型)
・・・
蛍光強度
・・・
J-type stacking
in supramolecular fiber
1 μm
・・・
meso-酒石酸
(gauche型)
・・・
H-type stacking
in finite aggregate
1 μm
[標的物質濃度]
T. Noguchi, et al., Chem. Eur. J. 2014, 20, 13938.
自己組織化現象：分子情報変換システム
標的分子構造
自己組織化
5
センサ応答
J-会合体
H-会合体
分子構造のわずかな違いを精密に認識する蛍光センシング技術
新技術の特徴
Topics
• ジカルボン酸の蛍光識別
• 生理的条件下におけるATPセンシング
• グリコサミノグリカンの蛍光センシング
6
ジカルボン酸の蛍光識別
oxalic acid
malonic acid
succinic acid
glutalic acid
60
60
50
50
30
20
FL int.
ΔF/F0
adipic acid
adi
40
40
adi
glu
suc
mal
ox
7
suc
30
glu
20
mal
10
10
ox
0
0
0
2000
4000
6000
8000
10000
[dicarboxylate] / μM
ジカルボン酸：代謝疾患のマーカー
0
200
400
600
800
1000
1200
Threshold / μM
代謝疾患のスクリーニング検査
従来技術との比較―ジカルボン酸検出
 従来：蛍光標識法
(ex.)
発蛍光基
• ジカルボン酸との有機反応
• 有機溶媒の利用
• HPLC分析
• LC/MS分析
ジカルボン酸
 新技術：自己組織化型蛍光センシング
ジカルボン酸
蛍光センサ
水中
混合
自己組織化
発蛍光
①水中で ②混合するのみの ③高S/N比蛍光検出
分析手順の簡略化
8
蛍光センシングへの展開
9
自己組織化を利用する蛍光センシング系の構築
FL Intensity
• Turn-on
• Selectivity
Turn-on
選択性
• Detection range
検出濃度レンジ
Detection range
・・・・
[target]
①自己会合による発蛍光の抑制
②標的に対するturn-on応答
塩濃度の増加に伴う自己会合挙動
10
１分子中に多数の正電荷基を導入することで
自己会合耐性を付与することができる
・・・・
G2 自己会合による
発蛍光
500
G2
FL intensity / a.u.
400
300
200
生理食塩濃度でも
自己会合しない
100
G6
G6
0
0
50
100
150
[NaCl] / mM
200
[G2] = [G6] = 6.0 μM, [HEPES] = 10 mM (pH 7.4)
生理的条件下におけるATPセンシング
AMP
ADP
20
11
ATP
λex = 388 nm, λem = 514 nm
ATP
ΔF/F0
15
ATP
10
G6
AMP
ADP
ATP
ADP
AMP
[G6] = 6.0 μM, [nucleotide] = 180 μM
5
ADP
AMP
0
0
40
80 120 160
[Nucleotide] / μM
200
240
[NaCl] = 125 mM, [KCl] = 5.0 mM
[CaCl2] = 1.0 mM, [MgCl2] = 0.5 mM
in HEPES buffered (10 mM, pH 7.4) water
T. Noguchi, et al., Chem. Sci. 2015, 6, 3863.
なぜATP選択性を示すのか？
12
結合阻害によるATP選択性の向上
no salt
CaCl2 1.0 mM
30
30
ATP
25
25
ADP
20
ΔF/F0
20
ΔF/F0
ATP
15
15
ATP
ADP
10
10
5
5
AMP
キレート形成
→ 結合阻害
ADP
ADP
AMP
AMP
0
0
0
10
20 30 40 50
[nucleotide] / μM
60
0
10
20 30 40 50
[nucleotide] / μM
60
従来技術との比較―ATPセンシング
従来型： Lock-and-Key 結合
13
新技術：自己組織化型蛍光センサ
蛍光センサ
AMP
ADP
ATP
結合
ADPとATPの区別は困難
Ka / M−1
ADP
1.7×106
①
②
①
結合阻害によるATP選択性の向上
②
自己組織化による高S/N比検出
ATP
ATP
10
ADP
AMP
G6
5
ADP
AMP
0
ATP
1.3×106
発蛍光
15
ΔF/F0
–
自己組織化
20
結合力の指標
AMP
結合
0
40
80 120 160
[Nucleotide] / μM
200
240
AMP
ADP
ATP
ポリアニオン(PA)センシングへの展開
 従来型： Lock-and-Key 結合
標的物質
結合
会合
蛍光センサ
発蛍光
消光
 新技術：自己組織化型蛍光センサ
標的物質
結合
蛍光センサ
自己組織化
発蛍光
ポリアニオンセンシングに極めて有用
14
グリコサミノグリカン(GAGs)の蛍光センシング 15
 蛍光センサ
G1
G2
 天然由来アニオン性多糖類：グリコサミノグリカン (GAGs)
ヘパリン (HEP)
(4−)
抗血液凝固
コンドロイチン硫酸 (ChS)
(2−)
ヒアルロン酸 (HA)
(1−)
ガン細胞・悪性腫瘍で過剰に産生 → 腫瘍マーカー
G1センサ → HEP選択性
HEP (4−)
400
16
HA (1−)
ChS (2−)
HEP
λex = 400 nm, λem = 602 nm
ChS
FL int. / a.u.
300
HA
200
no guest
HEP
ChS
HA
[HEP] = 6.25 ppm, [ChS] = 8.50 ppm, [HA] = 11.5 ppm
100
選択性：
0
0
2
4
6
8
[GAGs] / ppm
10
12
HEP > ChS > HA
ポリアニオン(PA)センシングのメカニズム
17
 [G1]: varied, [PA]: fixed
協同的
自己組織化
PA
FL int.
蛍光センサ
LogKa = 8.65
1 equiv.
[G1]
1 equiv.
[PA]
 [G1]: fixed, [PA]: varied (PA sensing)
Ka
Ka
FL int.
PA
蛍光センサ
見かけ上1:1結合 → 蛍光強度の直線的増加
G2センサ → HA選択性
HEP (4−)
18
HA (1−)
ChS (2−)
800
λex = 388 nm, λem = 518 nm
HA
FL int. / a.u.
600
ChS
400
no guest
HEP
ChS
HA
[HEP] = 2.50 ppm, [ChS] = 5.50 ppm, [HA] = 8.50 ppm
200
HEP
選択性：
0
0
2
4
6
8
[GAGs] / ppm
10
12
HEP < ChS < HA
選択性の逆転
なぜHA選択性を示すのか？
19
積層様式に基づく選択性
電荷密度が小さいものほど強発光性のJ-会合を誘起
HEP (4−)
HA (1−)
H-会合体→弱蛍光発光
J-会合体→強蛍光発光
T. Noguchi, et al., Angew. Chem. Int. Ed. 2016, 55, 5708.
ChS選択性の発現
HEP (4−)
20
HA (1−)
ChS (2−)
400
λex = 388 nm, λem = 518 nm
FL int. / a.u.
300
200
no guest
100
HEP
ChS
HA
[HEP] = 2.50 ppm, [ChS] = 5.50 ppm, [HA] = 8.50 ppm
[G2] = 10 μM, pH 1.5, 25 oC
0
no guest
HEP
ChS
HA
従来技術との比較―ポリアニオンセンシング
従来型： Lock-and-Key 結合
新技術：自己組織化型蛍光センサ
ポリアニオン
ポリアニオン
結合
自己組織化
発蛍光
消光
その他
• 電位差滴定（コロイド滴定）
• 濁度測定
• 蛍光標識 → HPLC分析
ポリアニオンの蛍光センシングが可能
簡便・高感度な定量法を確立
グリコサミノグリカンセンシング
グリコサミノグリカンセンシング
結合の強さに基づく選択性
積層様式に基づく選択性
（従来型）
新たな分子認識パラダイム
HEP
(4−)
負電荷密度の最も大きいHEPに対する選択性
21
HEP
HA
従来法では困難であったChS, HA選択性を達成
22
新技術の特徴・従来技術との比較
• ポリアニオンの蛍光センシング
• 標的物質との自己組織化による直接検出・
高選択的・高S/N比センシング
• 分析手順の簡略化 → 迅速・簡便・高感度セ
ンシング
23
想定される用途
• 臨床化学検査、多検体一斉評価
（疾患診断、スクリーニング検査、薬効評価等）
• バイオアッセイ
（生細胞、代謝活性、免疫応答、染色、標識等）
• 環境分析（水質検査等）
24
企業への期待
• バイオマーカー等の分離技術を有する企業と
の共同研究を希望。
• また、蛍光法による測定・検査システム開発
を考えている企業には、本技術の導入が有効
と思われる。
25
本技術に関する知的財産権
発明の名称：発蛍光性化合物又はその
塩、イオン性化合物の検
出剤及びイオン性化合物
の検出方法
出願番号：特願2016-024189
出願人：九州大学
発明者：野口誉夫、新海征治
26
お問い合わせ先
九州大学学術研究・産学官連携本部
知的財産グループ
ＴＥＬ 092-832-2128
ＦＡＸ 092-832-2147
e-mail [email protected]

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