COBAS® TaqMan® HBV Test
For Use With The High Pure System
IN-VITRO-DIAGNOSTIKUM.
COBAS® TaqMan® HBV Test
High Pure System Viral Nucleic Acid Kit
HBV HPS
48 Tests
48 Tests
P/N: 03500756 190
P/N: 03502295 001
VERWENDUNG
Der COBAS® TaqMan® HBV-Test zur Verwendung mit dem High Pure System (HPS) ist ein in-vitroNukleinsäure-Amplifikationstest zur quantitativen Bestimmung der DNA des Hepatitis-B-Virus (HBV) in
Humanserum oder -plasma unter Verwendung des High Pure System Viral Nucleic Acid Kit zur manuellen
Probenaufarbeitung und des COBAS® TaqMan® 48 Analyzers zur automatischen Amplifikation und
Detektion.
Der COBAS® TaqMan® HBV-Test ist nicht zur Verwendung als HBV-Screeningtest für Blut oder
Blutprodukte oder als Diagnosetest zur Bestätigung einer HBV-Infektion vorgesehen.
ZUSAMMENFASSUNG UND ERKLÄRUNG DES TESTS
Der Hepatitis-B-Virus (HBV) ist einer von vielen Viren, die bekanntermaßen virale Hepatitis verursachen.
Weltweit sind mehr als 2 Milliarden Menschen mit HBV infiziert, darunter über 350 Millionen chronisch
infizierte Träger des Virus1. Für chronische Träger ist das Risiko langfristiger Infektionsbeschwerden wie
chronische Hepatitis, Leberzirrhose und hepatozelluläres Karzinom2,3,4 besonders hoch. Serologische
Marker werden üblicherweise als Diagnose- und/oder Prognoseindikatoren für akute oder chronische HBVInfektion verwendet. Der häufigste HBV-Infektionsmarker ist das Vorhandensein des HBV-Oberflächenantigens (HBsAg). Obwohl manche Träger HBsAg-frei sein können und HBsAg-Antikörper entwickeln,
besteht doch eine Gefahr späterer schwerer Leberkrankheiten5,6. Das HBV e Antigen (HBeAg) wird oft als
sekundärer Marker angewendet, um eine mit fortschreitender Leberkrankheit zusammenhängende aktive
HBV-Replikation nachzuweisen. Bei fehlender HBeAg-Clearance scheint sich das Risiko einer terminalen
Leberkrankheit zu erhöhen7,8. Variante HBV-Stämme können entweder im Serum nicht nachweisbare
HBeAg produzieren, oder der Stamm kann die Fähigkeit zur Herstellung von HBeAg selbst bei Vorliegen
einer aktiven Infektion verlieren9. Dieser Marker ist daher zur Überwachung des Krankheitsverlaufs
möglicherweise von begrenztem Nutzen10. Es liegen Berichte darüber vor, dass die Möglichkeit des
Nachweises von HBV-DNA im Serum von prognostischem Wert für den Verlauf akuter und chronischer
HBV-Infektionen ist11,12,13,14. Die Methode ermöglicht den Nachweis von HBV-DNA nach HBsAgClearance15 bzw. den Nachweis von HBV ohne serologische Marker16. Es wurde jedoch bisher kein
Zusammenhang zwischen serologischen Markern und dem HBV-DNA-Spiegel aufgestellt. Die Wirksamkeit
antiviraler Therapie zur Behandlung von Patienten mit HBV-Infektion kann ferner durch serologische Marker
oder durch Bestimmung der Leberenzymfunktion beurteilt werden. Als direktestes und zuverlässigstes
Verfahren zur Messung der Virusreplikation gilt jedoch die quantitative Bestimmung von viraler HBV-DNA
im Serum oder im Plasma13,17,18,19. Ein rasches, anhaltendes Absinken der HBV-DNA-Spiegel bei mit
Alpha-Inferon, Lamivudin oder Ganciclovir behandelten Patienten hat sich als prädiktiver Faktor für ein
günstiges Behandlungsergebnis erwiesen10,20,21,22,23,24. Durch Überwachung des HBV-DNA-Spiegels
kann die Entwicklung einer Resistenz gegen Lamivudin vorausgesagt werden25. Ein quantitativer Test zur
Messung der HBV-DNA ist daher ein wertvolles Hilfsmittel, das in Verbindung mit anderen serologischen
Markern beim Management einer HBV-Infektion eingesetzt werden kann.
TESTPRINZIPIEN
Der COBAS® TaqMan® HBV-Test beruht im Wesentlichen auf zwei Schritten: (1) manuelle Probenaufarbeitung zur Gewinnung von HBV-DNA; (2) automatisierte PCR-Amplifikation der Ziel-DNA unter
Verwendung HBV-spezifischer komplementärer Primer, und Detektion der getrennten, mit zwei Fluoreszenzfarbstoffen markierten Oligonukleotid-Detektionssonden, die eine quantitative Bestimmung des amplifizierten
HBV-Zielprodukts (des so genannten Amplifikats) und der DNA des HBV-Quantifizierungsstandards
ermöglichen, der gleichzeitig mit der Probe verarbeitet, amplifiziert und analysiert wird.
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Doc Rev. 14.0
Der Master-Mix enthält Primerpaare und Sonden, die sowohl für die HBV-DNA als auch für die HBVQuantifizierungsstandard-DNA spezifisch sind. Das Master-Mix wurde so entwickelt, dass er eine äquivalente
Quantifizierung der HBV-Genotypen A bis G gewährleistet. Die Detektion der amplifizierten DNA wird mit
Hilfe von zweifach markierten, zielsequenzspezifischen und quantifizierungsstandardspezifischen
Oligonukleotidsonden durchgeführt, die eine unabhängige Identifizierung des HBV-Amplifikats und des HBVQuantifizierungsstandard-Amplifikats ermöglichen.
Die quantitative Bestimmung der viralen HBV-DNA erfolgt mit Hilfe des HBV-Quantifizierungsstandards.
Der HBV-Quantifizierungsstandard ist ein nicht-infektiöses Armored-DNA-Konstrukt, das der HBV-DNAZielsequenz identische Primer-Bindungsstellen und eine eindeutige Sonden-Bindungsregion enthält,
wodurch das HBV-Quantifizierungsstandard-Amplifikat vom HBV-Zielamplifikat unterschieden werden
kann. Der HBV-Quantifizierungsstandard wird mit einer bekannten Anzahl Kopien in jede einzelne Probe
und Kontrolle eingebracht und mit der HBV-Zielsequenz durch die Schritte der Probenaufarbeitung, PCRAmplifikation und Detektion mitgeführt. Der COBAS® TaqMan® 48 Analyzer berechnet den HBV-Titer in
den zu untersuchenden Proben durch Vergleich des HBV-Signals mit dem Signal des HBVQuantifizierungsstandards der jeweiligen Probe und Kontrolle. Der HBV-Quantifizierungsstandard dient
zur Kompensation von Hemmeffekten und zur Kontrolle des Aufarbeitungs- und Amplifikationsprozesses.
Dadurch wird eine korrekte quantitative Bestimmung der HBV-DNA in jeder Probe ermöglicht.
Probenaufarbeitung
Der COBAS® TaqMan® HBV-Test verarbeitet Plasma- und Serumproben und isoliert HBV-DNA anhand einer
generischen manuellen Probenaufarbeitung, die auf der Nukleinsäurebindung an Glasfasern beruht. Die
HBV-Viruspartikel werden durch Inkubation bei hoher Temperatur mit Protease und chaotropem Lyse-/
Bindepuffer lysiert, der Nukleinsäuren freisetzt und die freigesetzte HBV-DNA vor den im Plasma und im
Serum enthaltenen DNasen schützt. Zusammen mit dem Lysereagenz wird eine bekannte Anzahl HBVQuantifizierungsstandard-DNA-Moleküle in jede Probe eingebracht. Anschließend wird Isopropanol der
Lysemischung zugegeben, die dann durch eine Säule mit einem Glasfaser-Filtereinsatz zentrifugiert wird.
Beim Zentrifugieren werden HBV-DNA und HBV-Quantifizierungsstandard-DNA an der Oberfläche des
Glasfaserfilters gebunden. Ungebundene Substanzen, wie Salze, Proteine und andere Zellverunreinigungen,
werden durch das Zentrifugieren entfernt. Die adsorbierten Nukleinsäuren werden mit wässriger Lösung
gewaschen und eluiert. Es sind ausreichend Materialien zur parallelen Bearbeitung von 12 Proben oder
einem Mehrfachen davon vorhanden. Das verarbeitete Probenmaterial, das HBV-DNA und HBVQuantifizierungsstandard-DNA enthält, wird dem Amplifikations-/Detektionsgemisch zugegeben. Die HBVZiel-DNA und die HBV-Quantifizierungsstandard-DNA werden dann unter Verwendung der im Test-Kit
enthaltenden Amplifikations- und Detektionsreagenzien auf dem COBAS® TaqMan® 48 Analyzer amplifiziert
und detektiert.
PCR-Amplifikation
Wahl der Zielsequenz
Die Auswahl der DNA-Zielsequenz bei HBV hängt von der Identifikation von Regionen im HBV Genom
ab, die bei den verschiedenen HBV-Genotypen maximale Sequenzkonservierung aufweisen. Daher ist es
von höchster Wichtigkeit, geeignete Primer und Sonden zu wählen, um alle klinisch bedeutsamen HBV
Genotypen zu ermitteln. Es wurde gezeigt, dass eine Region der teilweise einsträngigen zirkulären DNA
des HBV-Genoms unter den verschiedenen Genotypen maximale Konservierung aufweist. Der COBAS®
TaqMan® HBV-Test verwendet für die PCR-Amplifikation bestimmte Primer, die für eine Sequenz innerhalb
der hochkonservierten Pre-Core/Core-Region des HBV-Genoms kodieren.
Amplifikation der Zielsequenz
Die bearbeiteten Proben werden dem Amplifikationsgemisch in Amplifikationsröhrchen (K-Röhrchen)
beigegeben, in denen die PCR-Amplifikation stattfindet. Der Thermozykler des COBAS® TaqMan® 48
Analyzers erhitzt das Reaktionsgemisch, um die doppelsträngige DNA zu denaturieren und die
spezifischen Zielsequenzen für die Primer auf dem zirkulären HBV-DNA-Genoms und der HBVQuantifizierungsstandard-DNA freizulegen. Beim Abkühlendes Gemischs lagern sich die Primer an die
Ziel-DNA an. Die thermostabile Thermus specie-DNA-Polymerase (Z05) verlängert in Gegenwart von Mn2+
und überschüssigen Desoxynukleotidtriphosphaten (dNTPs) - Desoxyadenosin, Desoxyguanosin,
Desoxycytidin und Desoxyuridin (anstelle von Thymidin) - die angelagerten Primer entlang des ZielTemplate, wodurch ein doppelsträngiges DNA-Molekül gebildet wird, das so genannte Amplifikat. Dieser
Vorgang wird vom COBAS® TaqMan® 48 automatisch bis zur Erreichung einer festgelegten Anzahl von
Zyklen wiederholt, wobei mit jedem Zyklus die Menge an DNA-Amplifikaten verdoppelt werden soll. Die
erforderliche Anzahl der Zyklen wird im COBAS® TaqMan® 48 Analyzer vorprogrammiert. Die
Amplifikation erfolgt nur in der Region des HBV-Genoms zwischen den Primern; es wird nicht das
gesamte HBV-Genom amplifiziert.
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Selektive Amplifikation
Die selektive Amplifikation der Ziel-Nukleinsäure aus der klinische Probe wird beim COBAS® TaqMan®
HBV-Test durch Verwendung des Enzyms AmpErase (Uracil-N-Glykosylase) und Desoxyuridin-Triphosphat
(dUTP) erreicht. Das Enzym AmpErase erkennt desoxyuridin-haltige26 - nicht aber desoxythymidinhaltige - DNA-Stränge und katalysiert deren Zerstörung. Desoxyuridin ist in natürlich vorkommender DNA
nicht vorhanden, ist aber im Amplifikat aufgrund der Verwendung von Desoxyuridin-Triphosphat als eines
der dNTPs im Master-Mix immer vorhanden. Deshalb enthält nur Amplifikat Desoxyuridin. Desoxyuridin
macht kontaminierendes Amplifikat vor der Amplifikation der Ziel-DNA anfällig für die Zerstörung durch
das Enzym AmpErase. Auch alle nach der ersten Aktivierung des Master-Mix durch Mangan gebildeten
nichtspezifischen Produkte werden von dem Enzym AmpErase zerstört, wodurch die Sensitivität und
Spezifität erhöht werden. Das im Master-Mix enthaltene Enzym AmpErase katalysiert die Spaltung von
desoxyuridin-haltiger DNA an den Desoxyuridin-Resten durch Öffnen der Desoxyribose-Kette an der C1Position. Während der Erwärmung im ersten thermozyklischen Schritt bricht die DNA-Kette des
Amplifikats an der Desoxyuridin-Position, sodass die DNA nicht weiter amplifiziert werden kann. Das
Enzym AmpErase bleibt bei Temperaturen über 55 °C, d. h. während der gesamten Thermozyklierung,
inaktiv und zerstört deshalb kein Zielamplifikat, das bei der Amplifikation gebildet wurde.
Nachweis von PCR-Produkten in einem COBAS® TaqMan® Test
Der COBAS® TaqMan® HBV-Test verwendet Real-Time-PCR-Technologie.27,28 Die Verwendung von
zweifach markierten Fluoreszenzsonden ermöglicht die Real-Time-Detektion der Ansammlung von PCRProdukten durch Überwachung der Emissionsintensität der fluoreszierenden Reporterfarbstoffe, die beim
Amplifikationsvorgang freigesetzt werden. Die Sonden bestehen aus für HBV bzw. HBVQuantifizierungsstandard spezifischen Oligonukleotiden, die mit einem Reporterfarbstoff und einem
Quencherfarbstoff markiert sind. Die HBV- und die HBV-Quantifizierungsstandard-Sonde werden beim
COBAS® TaqMan® HBV-Test mit unterschiedlichen fluoreszierenden Reporterfarbstoffen markiert. Wenn
die zweifach mit Farbstoff markierten Sonden intakt sind, wird die Reporterfluoreszenz durch die Nähe
des Quencherfarbstoffs aufgrund von Energieübertragungseffekten nach dem Förster-Mechanismus
unterdrückt. Während der PCR hybridisiert die Sonde mit einer Zielsequenz und wird von der 5'→3'Nukleaseaktivität der thermostabilen Z05-DNA-Polymerase gespalten. Nachdem die Reporter- und
Quencherfarbstoffe freigesetzt und getrennt wurden, erfolgt keine Unterdrückung (Quenching) mehr, und
die Fluoreszenzaktivität des Reporterfarbstoffs verstärkt sich. Die Amplifikationen der HBV-DNA und HBVQuantifizierungsstandard-DNA werden unabhängig voneinander bei unterschiedlichen Wellenlängen
gemessen. Dieser Vorgang wird bis zur Erreichung einer festgelegten Anzahl von Zyklen wiederholt, wobei
die Emissionsintensität der einzelnen Reporterfarbstoffe in jedem Zyklus effektiv verstärkt wird, was eine
unabhängige Identifizierung der HBV-DNA und der HBV-Quantifizierungsstandard-DNA ermöglicht. Die
Signalintensität hängt von der Menge des Ausgangsmaterials zu Beginn der PCR ab.
Grundlagen der quantitativen Bestimmung mit dem COBAS® TaqMan® HBV-Test
Der COBAS® TaqMan® HBV-Test liefert genaue quantitative Ergebnisse für ein breites dynamisches
Spektrum, da die Überwachung des Amplifikats während der exponentiellen Amplifikationsphase erfolgt.
Je höher der HBV-Titer einer Probe, desto eher steigt die Fluoreszenz des Reporterfarbstoffs der HBVSonde über das Basislinien-Fluoreszenzniveau an (siehe Abbildung 1). Da die Menge der DNA des HBVQuantifizierungsstandards (QS) in allen Proben konstant ist, muss die Fluoreszenz des Reporterfarbstoffs
der HBV-QS-Sonde bei allen Proben im gleichen Zyklus erscheinen (siehe Abbildung 2). In Fällen, bei
denen die QS-Fluoreszenz durch Hemmung oder schlechte Probenwiederfindung beeinträchtigt wird,
verzögert sich das Erscheinen der Fluoreszenz, was eine entsprechende Korrektur des berechneten Titers
der HBV-Zielsequenz-DNA ermöglicht. Das Erscheinen des spezifischen Fluoreszenzsignals wird als
kritischer Schwellenwert (Ct) angegeben. Der Ct-Wert wird definiert als die Zyklenbruchzahl, bei der die
Fluoreszenz des Reporterfarbstoffs einen vorbestimmten Schwellenwert (den zugewiesene
Fluoreszenzpegel) übersteigt und eine exponentielle Wachstumsphase dieses Signals beginnt (siehe
Abbildung 3). Ein höherer Ct-Wert zeigt einen niedrigeren Titer der anfänglichen HBV-Ziel-DNA an. Ein
zweifacher Titeranstieg korreliert mit einer Abnahme der Ziel-HBV-DNA um einen 1 Ct, während ein
zehnfacher Titeranstieg mit einer Abnahme um 3,3 Ct korreliert.
Abbildung 1 zeigt die Ziel-Wachstumskurven für eine Virus-Verdünnungsreihe, die sich über einen Bereich
von 5-log10 erstreckt. Mit steigender Viruskonzentration verschieben sich die Wachstumskurven in
Richtung früherer Zyklen. Deshalb entspricht die Wachstumskurve ganz links dem höchsten Virustiterwert,
während die Wachstumskurve ganz rechts dem niedrigsten Virustiterwert entspricht.
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Abbildung 1
Abbildung 2 zeigt die Quantifizierungsstandard-Wachstumskurven einer Virus-Verdünnungsreihe, die sich über
einen Bereich von 5-log10 erstreckt. Bei jeder Reaktion wird allen Proben dieselbe Menge
Quantifizierungsstandard hinzugefügt. Der Ct-Wert des Quantifizierungsstandards ist unabhängig vom
Virustiter etwa derselbe.
Abbildung 2
Abbildung 3 zeigt ein Beispiel für die Normalisierung der Fluoreszenzwerte bei jedem Zyklus für jede
Wachstumskurve. Die Zyklusbruchzahl (Ct) wird berechnet, wenn das Fluoreszenzsignal den zugewiesenen
Fluoreszenzpegel überschreitet.
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Abbildung 3
Quantitative Bestimmung der HBV-DNA
Die quantitative Bestimmung der viralen HBV-DNA erfolgt beim COBAS® TaqMan® HBV-Test durch
Verwendung einer zweiten Zielsequenz (HBV-Quantifizierungsstandard), die jeder Testprobe in einer
bestimmten Konzentration zugegeben wird. Der HBV-Quantifizierungsstandard ist ein nicht-infektiöses
linearisiertes Plasmid-DNA-Konstrukt, das Fragmente der HBV-Sequenzen mit Primerbindungsregionen
enthält, die mit denen der HBV-Zielsequenz identisch sind. Der HBV-Quantifizierungsstandard erzeugt
ebenfalls ein Amplifikationsprodukt, dessen Länge und Basenzusammensetzung der HBV-Ziel-DNA
gleicht. Die Detektionssonden-Bindungsregion des HBV-Quantifizierungsstandards wurde so geändert,
dass das HBV-Quantifizierungsstandard-Amplifikat vom HBV-Zielamplifikat unterschieden werden kann.
Während der Annealing-Phase der PCR mit dem COBAS® TaqMan® 48 Analyzer werden die Proben mit
Licht einer bestimmten Wellenlänge bestrahlt und angeregt. Für jede Probe werden Daten über die gefilterte
Emissionsfluoreszenz gesammelt. Die Werte für die einzelnen Proben werden dann um die gerätebedingte
Schwankungen korrigiert. Diese Fluoreszenzwerte werden vom Gerät an die AMPLILINK Software gesendet
und in der Datenbank gespeichert. Mit Hilfe von Vorprüfungen wird festgestellt, ob die Daten für die HBVDNA und HBV-Quantifizierungsstandard-DNA gültige Sätze repräsentieren. Wenn die Daten außerhalb der
voreingestellten Grenzwerte liegen, werden Alarmhinweise, so genannte Flags generiert. Nach erfolgreichem Abschluss aller Vorprüfungen werden die Fluoreszenzwerte verarbeitet, um Ct-Werte für die HBVDNA und die HBV-Quantifizierungsstandard-DNA zu generieren. Unter Verwendung der beim COBAS®
TaqMan® HBV-Test mitgelieferten chargenspezifischen Kalibrationskonstanten werden die Titerwerte für
die Proben und Kontrollen anhand der Ct-Werte für die HBV-DNA und HBV-Quantifizierungsstandard-DNA
berechnet. Der COBAS® TaqMan® HBV-Test entspricht dem internationalen WHO-Standard für HBV für
NAT Tests 97/74629, und Titerwerte werden in internationalen Einheiten angegeben (IE/ml).
REAGENZIEN
High Pure System Viral Nucleic Acid Kit
Virusnukleinsäure-Kit für das High Pure System
(P/N: 03502295 001)
48 Tests
LYS
(Lyse/Bindepuffer)
2 x 25 ml
Tris
50 % (Gew.-%) Guanidin-HCl
< 1 % Harnstoff
19 % (Gew.-%) Triton X-100
CAR
(RNA, lyophilisiert)
2 x 2 mg
PK
(Proteinase K, lyophilisiert)
2 x 100 mg
≥ 64 % (Gew.-%) Proteinase K, lyophilisiert
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IRB
(Inhibitor-Entfernungspuffer)
1 x 33 ml
Tris
65 % Guanidin-HCl
(20 ml Ethanol zugeben)
WASH
(Waschpuffer)
1 x 20 ml
Tris
NaCl
(80 ml Ethanol zugeben)
ELB
(Elutionspuffer)
1 x 30 ml
RS
(Virusnukleinsäure-Rack-Set für das High Pure System)
4 x Stück
Lyse-Rack
Filterröhrchen-Rack mit daran befestigtem Abfall-Rack
Elutions-Rack
Verschluss-Rack
WR
(Virusnukleinsäure-Abfall-Rack für das High Pure System)
COBAS® TaqMan® HBV Test
(P/N: 03500756 190)
8 x Stück
HBV HPS
48 Tests
Reagenzien für die Probenaufarbeitung und Kontrolle
HBV QS
(COBAS® TaqMan® HBV-Quantifizierungsstandard)
Tris-HCl-Puffer
EDTA
< 0,001 % linearisierte, doppelsträngige Plasmid-DNA mit einem Insert.
Das DNA-Insert enthält HBV-Primer-Bindungssequenzen und
eine eindeutige Sonden-Bindungsregion.
Amaranth-Farbstoff
< 0,005 % Poly-rA-RNA (synthetisch)
0,05 % Natriumazid
2 x 1,0 ml
HBV H(+)C
[HBV-Positivkontrolle, hoch positiv]
< 0,001 % linearisierte, doppelsträngige Plasmid-DNA
mit HBV-Sequenzen
Negatives Humanplasma, in von der US-Arzneimittelbehörde FDA lizenzierten
Tests nicht reaktiv auf HCV-Antikörper, HIV-1/2-Antikörper, HIV-p24-Antigen
und HBsAg; HIV-1-RNA, HCV-RNA und HBV-DNA durch PCR-Methoden
nicht nachweisbar.
0,1 % ProClin® 300 als Konservierungsmittel
2 x 1,0 ml
HBV L(+)C
[HBV Positivkontrolle, schwach positiv]
2 x 1,0 ml
< 0,001 % linearisierte, doppelsträngige Plasmid-DNA
mit HBV-Sequenzen
Negatives Humanplasma, in von der US-Arzneimittelbehörde FDA lizenzierten
Tests nicht reaktiv auf HCV-Antikörper, HIV-1/2-Antikörper, HIV-p24-Antigen
und HBsAg; HIV-1-RNA, HCV-RNA und HBV-DNA durch PCR-Methoden
nicht nachweisbar.
0,1 % ProClin® 300 als Konservierungsmittel
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CTM (–) C
[COBAS® TaqMan® Negativkontrolle (Humanplasma)]
Negatives Humanplasma, in von der US-Arzneimittelbehörde FDA lizenzierten
Tests nicht reaktiv auf HCV-Antikörper, HIV-1/2-Antikörper, HIV-p24-Antigen
und HBsAg; HIV-1-RNA, HCV-RNA und HBV-DNA durch PCR-Methoden
nicht nachweisbar.
0,1 % ProClin® 300 als Konservierungsmittel
Reagenzien für die Amplifikation und Detektion
HBV MMX
(COBAS® TaqMan® HBV-Master-Mix)
Tricinpuffer
Kaliumhydroxid
Kaliumazetat
Glyzerin
< 0,001 % dATP, dCTP, dGTP, dUTP
< 0,001 % Upstream- und Downstream-Primer für die
Pre-Core/Core-Region von HBV
< 0,001 % Fluoreszenz-markierte Oligonukleotidsonden,
für HBV und den HBV-Quantifizierungsstandard spezifisch
< 0,001 % Oligonukleotid-Aptamer
< 0,05 % Z05-DNA-Polymerase (mikrobiell)
< 0,1 % Enzym AmpErase (Uracil-N-Glycosylase, mikrobiell)
0,09 % Natriumazid
CTM Mn2+
(COBAS® TaqMan® Manganlösung)
< 1,2 % Manganazetat
Eisessig
0,09 % Natriumazid
4 x 1,0 ml
2 x 24 Tests
2 x 1,4 ml
2 x 24 Tests
2 x 1,0 ml
WARNHINWEISE UND VORSICHTMASSNAHMEN
A.
B.
IN-VITRO-DIAGNOSTIKUM.
Dieser Test ist nur für Humanserum oder -plasma geeignet, das mit den Antikoagulans EDTA
gewonnen wurde.
C.
Nicht mit dem Mund pipettieren.
D.
In den Arbeitsbereichen des Labors nicht essen, trinken oder rauchen. Beim Umgang mit Proben
und Testreagenzien Einmalhandschuhe, Laborkittel und Schutzbrille tragen. Nach Gebrauch der
Proben und Testreagenzien gründlich die Hände waschen.
E.
Bei der Entnahme von Aliquots aus den Reagenzflaschen Kontamination durch Mikroorganismen und Ribonuklease vermeiden.
F.
Es wird empfohlen, sterile Einwegpipetten und DNase-freie Pipettenspitzen zu verwenden.
G.
Reagenzien verschiedener Chargen oder verschiedener Flaschen derselben Charge nicht
miteinander vermischen.
H.
Keine Reagenzien aus verschiedenen Kits miteinander mischen.
I.
Nicht verbrauchte Reagenzien und Abfall gemäß örtlichen Bestimmungen entsorgen.
J.
Testsatz nach dem Verfallsdatum nicht mehr verwenden.
K.
Sicherheitsdatenblätter (Safety Data Sheets, SDS) sind auf Anfrage bei der zuständigen RocheVertretung erhältlich.
L.
Probenpräparate sind als infektiös und unter Verwendung sicherer Laborverfahren gemäß Biosafety
in Microbiological and Biomedical Laboratories30 und dem CLSI-Dokument M29-A331 zu
behandeln. Alle Arbeitsflächen gründlich mit einer frisch zubereiteten Lösung aus 0,5%igem
Natriumhypochlorit in deionisiertem oder destilliertem Wasser reinigen und desinfizieren.
HINWEIS: Handelsübliche flüssige Haushaltsbleiche enthält in der Regel Natriumhypochlorit in
einer Konzentration von 5,25 %. Durch Verdünnung im Verhältnis 1:10 erhält man eine
0,5%ige Natriumhypochloritlösung.
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M.
N.
O.
VORSICHT: CTM (–) C, HBV L(+)C und HBV H(+)C enthalten aus Humanblut gewonnenes
Humanplasma. Das Ausgangsmaterial wurde mit von der amerikanischen Arzneimittelbehörde FDA
zugelassenen Methoden getestet und für nicht reaktiv bezüglich Hepatitis-B-Oberflächenantigen
(HBsAg), Antikörper gegen HIV-1/2 und HCV sowie HIV-p24-Antigen befunden. Der Test des
negativen Humanplasmas nach PCR-Methoden ergab keine nachweisbare HIV-1-RNA, HCV-RNA
oder HBV-DNA. Für keine der bekannten Testmethoden kann mit Sicherheit garantiert werden, dass
die aus humanem Blut gewonnenen Produkte keine Infektionserreger übertragen. Aus diesem
Grund sind alle humanen Ausgangsmaterialien als potenziell infektiös zu betrachten. CTM (–) C,
HBV L(+)C und HBV H(+)C sind als infektiös und unter Verwendung sicherer Laborverfahren gemäß
Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories30 und dem CLSI-Dokument M29-A331 zu
behandeln. Alle Arbeitsflächen gründlich mit einer frisch zubereiteten Lösung aus 0,5%igem
Natriumhypochlorit in deionisiertem oder destilliertem Wasser reinigen und desinfizieren.
HBV MMX, HBV QS und CTM Mn2+ enthalten Natriumazid. Natriumazid kann mit Blei- und
Kupferrohren reagieren und hochexplosive Metallazide bilden. Beim Ausgießen von Natriumazid
enthaltenden Lösungen in Laborwaschbecken zur Vermeidung einer Azidansammlung mit reichlich
Wasser nachspülen.
Im Umgang mit Reagenzien immer Augenschutz, Laborkittel und Einweghandschuhe tragen. Diese
Materialien dürfen nie mit Haut, Augen oder Schleimhäuten in Berührung geraten. Falls es zu einem
Kontakt gekommen ist, sofort mit reichlich Wasser abspülen. Unbehandelt können Verätzungen
entstehen. Falls Reagenzien verschüttet werden, vor dem Trockenwischen immer erst mit Wasser
verdünnen.
LAGERUNG UND HANDHABUNG
Reagenzien für die Probenaufarbeitung
A.
Die Virusnukleinsäurereagenzien für das High Pure System sind sofort nach Empfang bei 15-25 ºC zu
lagern.
B.
Eluitionspuffer (ELB) und Lyse-/Bindungspuffer (LYS) bei 15-25ºC zu lagern. Nach dem Öffnen sind
ELB und LYS bei 15-25 ºC zu lagern. Nach dem Öffnen sind ELB und LYS innerhalb von 30 Tagen
bzw. maximal bis zum Verfallsdatum zu verbrauchen.
C.
Nach der Zugabe von Elutionspuffer (ELB) zur Rekonstitution der Träger-RNA und Proteinase K
sind nicht verwendete rekonstituierte Träger-RNA (CAR) und nicht verwendete rekonstituierte
Proteinase K (PK) bei -15 bis -25 ºC zu lagern. Nach der Rekonstitution müssen Träger-RNA und
Proteinase K innerhalb von 30 Tagen bzw. maximal bis zum Verfallsdatum verbraucht werden.
D.
Nach Zugabe von Ethanol den Inhibitor-Entfernungspuffer (IRB) und Waschpuffer (WASH) bei
15-25 ºC lagern. Diese Gebrauchslösungen sind 30 Tage bzw. maximal bis zum Verfallsdatum stabil.
E.
Die Gebrauchs-Lyse/Bindelösung [Lyse-/Bindepuffer mit Träger-RNA, Proteinase K und HBV QS]
muss sofort nach der Zubereitung verwendet werden. Überschüssiges Material muss entsorgt
werden.
Reagenzien für die Amplifikation und Detektion
A.
Reagenzien oder Kontrollpräparate nicht einfrieren.
B.
HBV MMX, CTM (–) C, HBV L(+)C, HBV H(+)C, HBV QS und CTM Mn2+ bei 2-8 ºC lagern.
Ungeöffnet bleiben diese Reagenzien bis zum Verfallsdatum stabil. Nach dem Öffnen, um ein
Aliquot für 12 Proben zu entfernen, ist der Rest an HBV MMX, HBV L(+)C, HBV H(+)C, HBV QS
und CTM Mn2+ bei 2-8 ºC zu lagern. Nach dem Öffnen sind HBV MMX, HBV L(+)C, HBV H(+)C,
HBV QS und CTM Mn2+ bei 2-8 ºC 30 Tage lang bzw. maximal bis zum Verfallsdatum stabil. Nach
dem Öffnen müssen nicht verbrauchte Reste an CTM (–) C entsorgt werden.
C.
Der Gebrauchs-Master-Mix (durch Beigabe von CTM Mn2+ zu HBV MMX) ist bei 2-8 ºC dunkel zu
lagern. Die aufgearbeiteten Proben und Kontrollen müssen innerhalb von 2 Stunden nach
Zubereitung des Gebrauchs-Master-Mix zugegeben werden.
D.
Die aufgearbeiteten Proben und Kontrollen sind bei 20-30 ºC bis zu 3 Stunden, bei 2-8 ºC bis zu
24 Stunden und gefroren bei -20 ºC bis zu 1 Woche stabil.
E.
Die Amplifikation muss innerhalb von 3 Stunden nach Zugabe der aufgearbeiteten Proben und
Kontrollen zum Gebrauchs-Master-Mix begonnen werden.
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MITGELIEFERTES MATERIAL
Reagenzien für die Probenaufarbeitung
A.
High Pure System Viral Nucleic Acid Kit
Virusnukleinsäure-Kit für das High Pure System
(P/N: 03502295 001)
LYS
(Lyse/Bindungs-Puffer)
CAR
(Träger-RNA)
PK
(Proteinase K)
IRB
(Inhibitor-Entfernungspuffer)
WASH
(Waschpuffer)
ELB
(Elutionspuffer)
RS
(Virusnukleinsäure-Rack-Set für das High Pure System)
WR
(Virusnukleinsäure-Abfall-Rack für das High Pure System)
Reagenzien für die Amplifikation und Detektion
B.
COBAS® TaqMan® HBV Test
(P/N: 03500756 190)
HBV HPS
HBV QS
(COBAS® TaqMan® HBV-Quantifizierungsstandard)
HBV H(+)C
[HBV Positivkontrolle, hoch positiv]
HBV L(+)C
[HBV Positivkontrolle, schwach positiv]
CTM (–) C
[COBAS® TaqMan® Negativkontrolle (Humanplasma)]
HBV MMX
(COBAS® TaqMan® HBV Master Mix)
CTM Mn2+
(COBAS® TaqMan® Manganlösung)
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ZUSÄTZLICH BENÖTIGTES MATERIAL
Geräte und Software
• COBAS® TaqMan® 48 Analyzer
• AMPLILINK Software, Version 3.3 oder Version 3.4
• Control Unit für die AMPLILINK Software
• Geräte- und Anwendungshandbücher:
-
-
Gerätehandbuch für den COBAS® TaqMan® 48 Analyzer zur Verwendung mit der AMPLILINK
Software, Version 3.3 und 3.4
Anwendungshandbuch für die AMPLILINK Software, Version 3.3 zur Verwendung mit dem
COBAS® AmpliPrep Instrument, COBAS® TaqMan® Analyzer, COBAS® TaqMan® 48
Analyzer, COBAS® AMPLICOR® Analyzer und dem cobas p 630 instrument
oder
Anwendungshandbuch für die AMPLILINK Software, Version 3.4
•
Testdefinitionsdatei (TDF). Name und Version der TDF finden Sie auf der dem Kit beiliegenden
Produktinformationskarte.
• K-Röhrchen-Verschließwerkzeug (P/N: 03516539001)
• K-Tray-Capper (P/N: 03339904001)
• K-Carrier für COBAS® TaqMan® 48 (P/N: 28150397001)
• K-Tray-Carrier (P/N: 03341488001)
• K-Carrier-Halter (P/N: 03287696001)
• K-Carrier-Transporter (P/N: 03517519001)
Einwegartikel
• K-Tubes, Packung mit 12 x 96 (P/N: 03137082001)
• K-Trays, Packung mit 24 (P/N: 03343146001)
Zentrifugenmaterial
• Sigma 4-15C Tischzentrifuge oder gleichwertige Mikrotiterplattenzentrifuge mit einer
Zentrifugalkraft von 4600 x g
• Sigma Zentrifugen-Ausschwingrotor P/N: 11118 (inkl. 2 Becher P/N: 13218 und 2 Plattenhalter
P/N: 17978) oder gleichwertig
WEITERES ZUSÄTZLICH BENÖTIGTES MATERIAL
• Isopropanol (> 99 %) - mindestens entsprechend ACS-Spezifikation
• Ethanol (96-100 %) - mindestens entsprechend ACS-Spezifikation
• Verstellbare Pipettoren*: (Kapazität 250 µl und 1000 µl) mit DNase-freien Aerosolfilter- oder
Kolbenhub-Pipettenspitzen
• Pipettierhilfe: Drummond (P/N: 4-000-100) oder gleichwertig
• Wasserbad, auf 50ºC (± 2 °C) eingestellt
• Blockthermostat, auf 70ºC (± 2 °C) eingestellt
• Sterile, serologische Einwegpipetten: 5, 10 und 25 ml
• Sterile konische Polypropylenröhrchen; 15 ml und 50 ml: Corning (P/N: 430052 und P/N: 430290)
oder gleichwertig
• Sterile Mikrozentrifugenröhrchen, 2,0 ml: Sarstedt (P/N: 72.693.005) oder gleichwertig
• Vortexer
• Röhrchenständer
• Einmalhandschuhe, puderfrei
• Kalibrierte Thermometer für Wasserbad und Blockthermostat
*
Die Genauigkeit der Pipettoren sollte ± 3 % des Nennvolumens betragen. Wo angegeben, müssen DNase-freie Aerosolfilter- oder
Kolbenhub-Pipettenspitzen verwendet werden, um eine Kreuzkontamination von Proben und Amplifikat auszuschließen.
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ENTNAHME, TRANSPORT UND LAGERUNG VON PROBEN
HINWEIS:
A.
Alle Proben und Kontrollen wie potenzielle Überträger von Infektionserregern behandeln.
Probenentnahme
Der COBAS® TaqMan® HBV-Test ist nur zur Bestimmung von Serum- oder Plasmaproben bestimmt. Das
Blut sollte in BD SST Serum-Trennröhrchen oder in sterilen Röhrchen mit EDTA als Antikoagulans gesammelt
werden.
Vollblut nicht länger als 1 Tag bei 2-25 °C lagern. Die Verwendung von EDTA-Plasma oder Serum ergibt
ungefähr gleichwertige Testergebnisse. Abbildung 4 zeigt den Einfluss des Template-Typs auf HBV-DNAErgebnisse für Patientenproben.
Abbildung 4
Vergleich zwischen EDTA-Plasma- und Serum-Proben
12,00
8,00
6,00
y = 1,0139x - 0,0703
2
R = 0,9984
10
Plasmaproben - durchschnittliches Ergebnis
(Log HBV DNA IE/ml, n=2)
10,00
4,00
2,00
0,00
0,00
2,00
4,00
6,00
8,00
10,00
12,00
Serumproben
durchschnittliches Ergebnis (Log HBV DNA IE/ml, n = 2)
10
Serum oder Plasma soll innerhalb 1 Tages nach Entnahme durch Zentrifugieren bei 800-1600 x g 20 Minuten
lang bei Raumtemperatur getrennt werden. Serum oder Plasma in ein steriles Polypropylenröhrchen geben.
Abbildung 5 zeigt die Daten von diesen Probenentnahmestudien.
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Abbildung 5
Stabilität von HBV in Vollblut mit EDTA als Antikoagulans oder in Serum-Trennröhrchen vor der
Trennung zu Plasma oder Serum
< 1 Stunde 25-30C
4,0
6 Stunden 25-30C
24 Stunden 25-30C
48 Stunden 25-30C
3,5
72 Stunden 25-30C
< 1 Stunde 2-8C
3,0
6 Stunden 2-8C
24 Stunden 2-8C
10
Durchschnittliches HBV DNA Ergebnis
(Log HBV DNA IE/mL, n=2)
4,5
48 Stunden 2-8C
2,5
72 Stunden 2-8C
2,0
Plasma-1
Plasma-2
Plasma-3
Plasma-4
Plasma-5
Serum-1
Serum-2
Proben-Identifikationsnummer
B.
Probentransport
Beim Transport von Vollblut, Serum oder Plasma sind die geltenden Vorschriften für den Transport
ätiologischer Substanzen zu beachten32. Vollblut muss bei 2-25 °C transportiert und innerhalb 1 Tages nach
der Entnahme verarbeitet werden. Plasma oder Serum kann bei 2-8 °C oder gefroren bei -20 °C bis -80 °C
transportiert werden.
C.
Probenlagerung
Serum- oder Plasmaproben können bei Raumtemperatur maximal 3 Tage gelagert werden, bei 2-8 °C bis
zu 7 Tage und bei -20 bis -80 °C gefroren mindestens sechs Wochen. Es wird empfohlen, Proben in
Aliquots von 800-900 µl in sterilen 2,0-ml-Polypropylenröhrchen mit Schraubdeckel (z.B. Sarstedt
P/N: 72.694.006) aufzubewahren. Abbildung 6 zeigt die Daten von Studien zur Probenaufbewahrung.
Durchschnittliches HBV DNA Ergebnis
(Log 10 HBV DNA IE/mL, n=2)
Abbildung 6
Stabilität von HBV in EDTA-Plasma oder Serum
4,5
Time 0
1 Tag RT
4,0
3 Tage RT
5 Tage RT
3,5
7 Tage RT
1 Tag 2-8C
3,0
3 Tage 2-8C
5 Tage 2-8C
2,5
2,0
7 Tage 2-8C
6 Wochen -80C
Plasma-1
Plasma-2
Plasma-3
Plasma-4
Plasma-5
Serum-1
Serum-2
Proben-Identifikationsnummer
Serum- und Plasmaproben können ohne HBV-DNA-Verlust bis zu fünfmal eingefroren und wieder aufgetaut
werden. Abbildung 7 zeigt die Daten dieser Einfrier- und Auftaustudien.
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Abbildung 7
HBV-Ergebnisse nach bis zu fünf Einfrier- und Auftauzyklen
E-A
E-A
E-A
E-A
E-A
GEBRAUCHSANLEITUNG
HINWEIS: Ausführliche Informationen zur Bedienung, zum Ausdrucken von Ergebnissen und zur
Interpretation von Flags, Anmerkungen und Fehlermeldungen finden Sie (1) im
Gerätehandbuch für den COBAS® TaqMan® 48 Analyzer zur Verwendung mit der
AMPLILINK Software, Version 3.3 und 3.4; (2) im Anwendungshandbuch für die
AMPLILINK Software, Version 3.3 zur Verwendung mit dem COBAS® AmpliPrep
Instrument, COBAS® TaqMan® Analyzer, COBAS® TaqMan® 48 Analyzer, COBAS®
AMPLICOR® Analyzer und cobas p 630 instrument oder (3) im Anwendungshandbuch
für die AMPLILINK Software, Version 3.4.
HINWEIS: Alle Amplifikations- und Detektionsreagenzien müssen vor der Verwendung auf
Raumtemperatur gebracht werden; sie sind mindestens 30 Minuten vor der Verwendung
aus dem Kühlfach bei 2-8 °C zu nehmen.
HINWEIS: Die Serum- und Plasmaproben müssen vor der Verwendung 15-30 Minuten lang bei
Raumtemperatur äquilibriert werden.
HINWEIS: Wo angegeben, Pipettoren mit Aerosolfilter- oder b-Pipettenspitzen verwenden. Zur
Verhütung einer Kontamination ist äußerste Sorgfalt erforderlich.
Umfang eines Laufs:
Jedes Kit enthält ausreichend Reagenzien für vier Läufe mit je 12 Proben, die einzeln oder gleichzeitig
durchgeführt werden können. In jedem Lauf mit bis zu 24 Proben und Kontrollen muss mindestens je ein
Exemplar der Kontrollen CTM (–) C, HBV L(+)C und HBV H(+)C mitgeführt werden (siehe Abschnitt „Qualitätskontrolle”). Die Amplifikations- und Detektionsreagenzien sind in 24-Test-Zweiwegflaschen verpackt. Um die
Reagenzien möglichst wirtschaftlich einzusetzen, sollten die Proben und Kontrollen jeweils in Partien von 12
oder einem Mehrfachen von 12 verarbeitet werden.
Aufarbeitung der Proben und Kontrollen
HINWEIS: Wenn gefrorene Serum- oder Plasmaproben verwendet werden, die Proben bei
Raumtemperatur vollständig auftauen lassen und vor Gebrauch 5-10 Sekunden lang im
Vortexer mischen.
HINWEIS: Die Reagenzien müssen vor Gebrauch Raumtemperatur erreichen. Vor Beginn der
Reinigungsreaktionen die Blockthermostaten auf 70 °C (± 2 °C) und das Wasserbad auf
50 °C (± 2 °C) vorwärmen.
A.
Vorbereitung der Reagenzien
HINWEIS: Die Gebrauchs-Lyse-/Bindelösung erst zubereiten, nachdem alle Proben und
Kontrollen 15-30 Minuten bei Raumtemperatur äquilibriert wurden.
1.
Zur Vorbereitung des Inhibitor-Entfernungspuffers 20 ml 96-100%iges Ethanol in den InhibitorEntfernungspuffer (IRB) pipettieren. Durch 5-10-maliges Umkippen mischen. Diese Menge
rekonstituierter Inhibitor-Entfernungspuffer reicht für 48 Tests.
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2.
Zur Vorbereitung des Waschpuffers 80 ml 96-100%iges Ethanol in den Waschpuffer (WASH)
pipettieren. Durch 5-10-maliges Umkippen mischen. Diese Menge rekonstituierter Waschpuffer reicht
für 48 Tests.
3.
Den Elutionspuffer (ELB) bei 70 °C (± 2 °C) in einem 2,0-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit Schraubdeckel vorwärmen. Es können mehrere Röhrchen benutzt werden. Das Elutionsvolumen pro Probe
beträgt 75 µl. Das in der folgenden Tabelle angegebene Volumen entsprechend der Anzahl der Tests
vorwärmen.
Anzahl der Replikate
4.
Reagenz
12
24
Elutionspuffer (ml)
2,0
4,0
Das in der folgenden Tabelle angegebene Isopropanolvolumen entsprechend der Anzahl der Tests
in ein sauberes steriles Röhrchen pipettieren.
Anzahl der Replikate
Reagenz
12
24
Isopropanol (ml)
5,0
10,0
5.
0,5 ml des Elutionspuffers (ELB) in die Träger-RNA (CAR) pipettieren. Das Röhrchen schließen und
umkippen, dann im Vortexer mischen, bis alle Träger-RNA in Lösung gegangen ist. Die
rekonstituierte Träger-RNA reicht für 24 Tests. Nicht verbrauchte rekonstituierte Träger-RNA kann
bei -15 bis -25 °C bis zu 30 Tage bzw. maximal bis zum Verfallsdatum gelagert werden.
6.
5,0 ml des Elutionspuffers (ELB) in die Proteinase K (PK) pipettieren. Das Röhrchen schließen und
umkippen, dann im Vortexer mischen, bis alle Proteinase K in Lösung gegangen ist. Die
rekonstituierte Proteinase K reicht für 24 Tests. Nicht verbrauchte rekonstituierte Proteinase K kann
bei -15 bis -25 °C bis zu 30 Tage bzw. maximal bis zum Verfallsdatum gelagert werden.
7.
Zur Zubereitung der Gebrauchs-Lyse-/Bindelösung die unten angegebenen Mengen entsprechend
der Zahl der zu verarbeitenden Proben und Kontrollen in ein Röhrchen pipettieren:
Anzahl der Replikate
HINWEIS:
Reagenzien
12
24
Lyse-/Bindepuffer (ml)
7,0
14,0
Träger-RNA (µl)
140
280
HBV-QS (µl)
39
78
Proteinase K (ml)
1,4
2,8
Das HBV QS-Volumen ist für den COBAS® TaqMan® HBV-Test spezifisch.
HINWEIS: Wenn gefrorene rekonstituierte Träger-RNA oder Proteinase K benutzt werden soll,
diese bei Raumtemperatur auftauen lassen und vor Gebrauch mehrmals umkippen
•
Die angegebene Menge an Lyse/Bindungs-Puffer in ein sauberes, steriles 50-ml-Röhrchen geben.
•
Die angegebene Menge rekonstituierte Träger-RNA in das Röhrchen mit Lyse-/Bindepuffer geben.
•
HBV QS 3-5 Sekunden lang im Vortexter mischen und die angegebene Menge HBV QS in das
Röhrchen mit Lyse-/Bindepuffer und rekonstituierter Träger-RNA geben.
•
Das Röhrchen verschließen und durch 10-15-maliges Umkippen mischen. Nicht im Vortexer
mischen - dies würde Luftbläschen in der Lösung erzeugen.
•
Die angegebene Menge an rekonstituierter Proteinase K in das Röhrchen mit Lyse-/Bindepuffer geben.
•
Das Röhrchen verschließen und durch 10-15-maliges Umkippen mischen. Nicht im Vortexer
mischen - dies würde Luftbläschen in der Lösung erzeugen. Die Gebrauchs-Lyse/Bindelösung
sofort nach Hinzufügen der Proteinase K und Mischen mit dem Lyse-/Bindepuffer abfüllen.
Nicht verbrauchter Lyse-/Bindepuffer (LYS) kann bei 15-25 °C bis zu 30 Tage bzw. maximal bis zum
Verfallsdatum gelagert werden. Nicht verbrauchte Gebrauchs-Lyse/Bindelösung muss verworfen
werden.
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B.
Aufarbeitung der Proben und Kontrollen
HINWEIS: Für diesen Vorgang werden verstellbare Pipettoren mit Aerosol-undurchlässigen
Spitzen empfohlen.
HINWEIS: Für die Schritte 1, 14, 16, 19 und 22 kann eine Repetierpipette mit sterilen Kombispitzen in
passenden Größen verwendet werden. Dabei muss allerdings zur Vermeidung von
Reagenzienspritzern und Kreuzkontaminationen sehr vorsichtig gearbeitet werden.
HINWEIS: Während des gesamten Vorgangs vermeiden, dass Lyse-/Bindungs-Gebrauchslösung,
Proben- bzw. Kontrollmaterial oder Isopropanol auf den Rand der Kavität und somit beim
Verschließen zwischen Kavität und Deckel gelangt.
HINWEIS: Gut sitzende Handschuhe in geeigneter Größe tragen. Handschuhe regelmäßig wechseln, vor
allem nach dem Umgang mit Positivkontrollen und nach dem Öffnen voller Röhrchen aus dem
Lyse-Rack. Auf keinen Fall die Unterseite der Deckel berühren, auch nicht beim Öffnen oder
Schließen.
HINWEIS: Beim Umgang mit Kontrollen aus dem Kit und klinischen Proben die Negativkontrolle stets
vor den Positivkontrollen aus dem Kit laden.
1.
625 µl Lyse-/Bindungs-Gebrauchslösung in jede Kavität des Lyse-Racks (I, durchsichtig) pipettieren.
Dabei darauf achten, dass keine Flüssigkeit auf den Rand der Kavität und somit beim Verschließen
zwischen Kavität und Deckel gelangt. Die Deckel vorsichtig in die Abdeckposition herunterklappen.
Den Schnappmechanismus nicht einrasten lassen.
2.
Die Kavitäten einzeln öffnen und 500 µl der Probe oder Kontrolle vorsichtig in die entsprechende
Kavität pipettieren. Dabei darauf achten, dass keine Flüssigkeit auf den Rand der Kavität und somit
beim Verschließen zwischen Kavität und Deckel gelangt. Nach Zugabe jeder Probe oder Kontrolle
den Deckel vorsichtig am Gelenk beginnend herunterdrücken und dann leichten Druck auf die Mitte
des Deckels ausüben, bis der Schnappverschluss einrastet und die Kavität fest verschlossen ist.
3.
Nach Zugabe aller Proben und Kontrollen das gefüllte Lyse-Rack ca. 10 Sekunden lang im Vortexer
mischen. Nicht zu kräftig mischen. Überprüfen, ob alle Kavitäten gründlich gemischt werden.
4.
Das Lyse-Rack vorsichtig in ein auf 50 °C (± 2 °C) vorgewärmtes Wasserbad stellen. Dabei darauf
achten, dass keine Flüssigkeit verspritzt wird. Das Lyse-Rack 10 Minuten lang inkubieren. Während
der Inkubation sollte das Lyse-Rack zwar im Wasser stehen, es darf aber nicht schwimmen.
Sicherstellen, dass der Bereich auf der Oberseite des Lyse-Racks zwischen den Kavitäten während
der Inkubation trocken bleibt. Ober- und Unterseite des Lyse-Racks nach der Entnahme aus dem
Wasserbad vorsichtig abtrocknen.
5.
Das Lyse-Rack 10-20 Sekunden in der Mikrotiterplattenzentrifuge mit einer eingestellten Drehzahl von
4600 x g zentrifugieren. Die Zentrifuge erreicht die eingestellte Drehzahl evtl. nicht. Die Füllstände der
Kavitäten überprüfen, um sicherzustellen, dass keine Flüssigkeit ausgelaufen ist. Ist Flüssigkeit
ausgelaufen, den Vorgang hier abbrechen.
6.
Die Kavitäten nacheinander öffnen. Dazu leichten Druck auf das Verschlussteil ausüben, um den
Schnappmechanismus zu lösen und den Deckel der Kavität zu öffnen. Dann 250 µl Isopropanol in jede
Kavität pipettieren. Nach jeder Zugabe den Deckel vorsichtig am Gelenk herunterdrücken, weiterhin
leichten Druck auf die Mitte des Deckels ausüben, bis der Schnappverschluss einrastet und die Kavität
fest verschlossen ist.
HINWEIS: Die Isopropanolmenge ist für jeden COBAS® TaqMan®-Test spezifisch.
7.
Überprüfen, ob alle Racks fest verschlossen sind. Die Proben durch dreimaliges Umschwenken
des Racks mischen und das Rack anschließend etwa 10 Sekunden lang im Vortexer mischen. Nicht
zu kräftig mischen. Überprüfen, ob alle Kavitäten gründlich gemischt werden.
8.
Das Lyse-Rack 10-20 Sekunden in der Mikrotiterplattenzentrifuge mit einer eingestellten Drehzahl
von 4600 x g zentrifugieren. Die Zentrifuge erreicht die eingestellte Drehzahl evtl. nicht. Die
Füllstände der Kavitäten überprüfen, um sicherzustellen, dass keine Flüssigkeit ausgelaufen ist.
Ist Flüssigkeit ausgelaufen, den Vorgang hier abbrechen.
9.
Die Kavitäten nacheinander öffnen. Dazu leichten Druck auf das Verschlussteil ausüben, um den
Schnappmechanismus zu lösen und den Deckel der Kavität zu öffnen. Dann 750 µl des Proben- oder
Kontrollgemischs in die entsprechenden Kavitäten im Filterröhrchen-Rack (II, gelb) mit daran
befestigtem Abfall-Rack (weiß) überführen. Nach Zugabe jedes Proben- oder Kontrollgemischs den
Deckel vorsichtig am Gelenk beginnend herunterdrücken und dann leichten Druck auf die Mitte des
Deckels ausüben, bis der Schnappverschluss einrastet und die Kavität fest verschlossen ist.
10.
Nach Zugabe aller Proben und Kontrollen das zusammengesetzte Filterröhrchen-Rack 2 Minuten
bei 4600 x g in der Mikrotiterplattenzentrifuge zentrifugieren. Die Füllstände der Kavitäten
überprüfen, um sicherzustellen, dass keine Flüssigkeit ausgelaufen ist. Ist Flüssigkeit ausgelaufen,
den Vorgang hier abbrechen.
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11.
Die Kavitäten nacheinander öffnen. Dazu leichten Druck auf das Verschlussteil ausüben, um den
Schnappmechanismus zu lösen und den Deckel der Kavität zu öffnen. Dann das restliche Probenoder Kontrollgemisch in die entsprechenden Kavitäten im Filterröhrchen-Rack überführen. Nach
Zugabe jedes Proben- oder Kontrollgemischs den Deckel der Kavität vorsichtig am Gelenk beginnend
herunterdrücken und dann leichten Druck auf die Mitte des Deckels ausüben, bis der Schnappverschluss einrastet und die Kavität fest verschlossen ist. Das Lyse-Rack sachgemäß entsorgen.
12.
Das zusammengesetzte Filterröhrchen-Rack 2 Minuten bei 4600 x g in der Mikrotiterplattenzentrifuge
zentrifugieren. Die Füllstände der Kavitäten überprüfen, um sicherzustellen, dass keine Flüssigkeit
ausgelaufen ist. Ist Flüssigkeit ausgelaufen, den Vorgang hier abbrechen.
13.
Das Filterröhrchen-Rack durch Drücken der beiden Schnappverschlüsse an der Oberseite des
Racks vom Abfall-Rack lösen. Das Abfall-Rack entsorgen. Das Filterröhrchen-Rack auf ein neues
Abfall-Rack aufsetzen.
14.
Alle Deckel des Filterröhrchen-Racks öffnen und 400 µl Inhibitor Removal-Puffer (IRB) seitlich in die
Kavitäten pipettieren. Die Wände der Kavitäten dabei nicht berühren. Nach Zugabe des Inhibitor
Removal-Puffers in alle Kavitäten den Deckel vorsichtig am Gelenk beginnend herunterdrücken und
dann leichten Druck auf die Mitte des Deckels ausüben, bis der Schnappverschluss einrastet und die
Kavitäten fest verschlossen sind.
15.
Das zusammengesetzte Filterröhrchen-Rack 2 Minuten bei 4600 x g in der Mikrotiterplattenzentrifuge
zentrifugieren. Die Füllstände der Kavitäten überprüfen, um sicherzustellen, dass keine Flüssigkeit
ausgelaufen ist. Ist Flüssigkeit ausgelaufen, den Vorgang hier abbrechen.
16.
Alle Deckel des Filterröhrchen-Racks öffnen und 700 µl Waschpuffer (WASH) seitlich in die Kavitäten
pipettieren. Die Wände der Kavitäten dabei nicht berühren. Nach Zugabe des Waschpuffers in alle
Kavitäten den Deckel vorsichtig am Gelenk beginnend herunterdrücken und dann leichten Druck auf die
Mitte des Deckels ausüben, bis der Schnappverschluss einrastet und die Kavitäten fest verschlossen
sind.
17.
Das zusammengesetzte Filterröhrchen-Rack 2 Minuten bei 4600 x g in der Mikrotiterplattenzentrifuge
zentrifugieren. Die Füllstände der Kavitäten überprüfen, um sicherzustellen, dass keine Flüssigkeit
ausgelaufen ist. Ist Flüssigkeit ausgelaufen, den Vorgang hier abbrechen.
18.
Das Filterröhrchen-Rack durch Drücken der beiden Schnappverschlüsse an der Oberseite des
Racks vom Abfall-Rack lösen. Das Abfall-Rack entsorgen. Das Filterröhrchen-Rack auf ein neues
Abfall-Rack aufsetzen.
19.
Alle Deckel des Filterröhrchen-Racks öffnen und 700 µl Waschpuffer seitlich in die Kavitäten
pipettieren. Die Wände der Kavitäten dabei nicht berühren. Nach Zugabe des Waschpuffers in alle
Kavitäten den Deckel vorsichtig am Gelenk beginnend herunterdrücken und dann leichten Druck auf
die Mitte des Deckels ausüben, bis der Schnappverschluss einrastet und die Kavitäten fest
verschlossen sind.
20.
Das zusammengesetzte Filterröhrchen-Rack 3 Minuten bei 4600 x g in der Mikrotiterplattenzentrifuge
zentrifugieren. Die Füllstände der Kavitäten überprüfen, um sicherzustellen, dass keine Flüssigkeit
ausgelaufen ist. Ist Flüssigkeit ausgelaufen, den Vorgang hier abbrechen.
21.
Das Filterröhrchen-Rack durch Drücken der beiden Schnappverschlüsse an der Oberseite des
Racks vom Abfall-Rack lösen. Das Filterröhrchen-Rack auf das Elutions-Rack (IIIA, blau) aufsetzen
und einrasten lassen. Das Abfall-Rack sachgemäß entsorgen.
22.
Alle Deckel des Filterröhrchen-Racks öffnen und 75 µl des vorgewärmten Elutionspuffers (ELB) in
die Mitte jedes Filters pipettieren, ohne den Filter dabei zu berühren.
HINWEIS: Elutionspuffer darf nicht seitlich in die Kavitäten pipettiert werden.
Nach Zugabe des Elutionspuffers in alle Kavitäten den Deckel vorsichtig am Gelenk beginnend
herunterdrücken und dann leichten Druck auf die Mitte des Deckels ausüben, bis der Schnappverschluss einrastet und die Kavitäten fest verschlossen sind.
23.
Nach Zugabe des Elutionspuffers in die letzte Kavität das Elutions-Rack bei Raumtemperatur
mindestens 3 Minuten lang inkubieren; den Deckel vorsichtig am Gelenk beginnend herunterdrücken und dann leichten Druck auf die Mitte des Deckels ausüben, bis der Schnappverschluss
einrastet und die Kavitäten fest verschlossen sind.
24.
Das zusammengesetzte Filterröhrchen-Rack 3 Minuten bei 4600 x g in der Mikrotiterplattenzentrifuge
zentrifugieren. Die Füllstände der Kavitäten überprüfen, um sicherzustellen, dass keine Flüssigkeit
ausgelaufen ist. Ist Flüssigkeit ausgelaufen, den Vorgang hier abbrechen.
25.
Das Filterröhrchen-Rack durch Drücken der beiden Schnappverschlüsse an der Oberseite des
Racks vom Elutions-Rack lösen. Das Filterröhrchen-Rack sachgemäß entsorgen.
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26.
27.
Das Verschluss-Rack (IIIB, blau) auf das Elutions-Rack (IIIA, blau) aufsetzen. Fest nach unten
drücken, bis die Schnappverschlüsse im Elutions-Rack einrasten. Den Deckel vorsichtig am Gelenk
beginnend herunterdrücken und dann leichten Druck auf die Mitte des Deckels ausüben, bis der
Schnappverschluss einrastet und alle Kavitäten fest verschlossen sind.
Die aufgearbeiteten Proben und Kontrollen werden direkt für die PCR verwendet. 50 µl der
aufgearbeiteten Proben und Kontrollen für die Amplifikation verwenden. Die aufgearbeiteten Proben
und Kontrollen innerhalb von 3 Stunden nach Abschluss der Aufarbeitung zum Gebrauchs-MasterMix hinzugeben. Falls die aufgearbeiteten Proben und Kontrollen nicht innerhalb von 3 Stunden
nach der Aufarbeitung verwendet werden können, können sie bei 2-8 °C bis zu 24 Stunden im
zugedeckten Elutions-Rack oder tiefgefroren bei -20 °C bis zu 1 Woche in sterilen 2,0-mlPolypropylenröhrchen mit Schraubverschluss (z. B. Sarstedt P/N: 72.694.006) gelagert werden.
Die aufgearbeiteten Proben und Kontrollen innerhalb von 3 Stunden nach ihrer Zugabe zum
Gebrauchs-Master-Mix amplifizieren.
Amplifikation und Detektion
HINWEIS: K-Carrier/K-Tray-Carrier und K-Carrier-Halter/K-Tray-Carrier-Halter müssen mit einem
fusselfreien Tuch abgewischt werden, das mit einer 70-prozentigen Isopropanol-Lösung
angefeuchtet wurde.
C.
Vorbereitung der Reagenzien
HINWEIS: COBAS® TaqMan® HBV-Master-Mix (HBV MMX), „Gebrauchs-Master-Mix“ (GebrauchsMMX) und Gebrauchs-MMX mit aufgearbeiteten Proben und Kontrollen sind
lichtempfindlich. Diese Reagenzien vor Licht schützen.
HINWEIS: COBAS® TaqMan® HBV-Master-Mix (HBV MMX) und COBAS® TaqMan® Manganlösung
(CTM Mn2+) müssen vor der Zubereitung des Gebrauchs-Master-Mix mindestens
30 Minuten bei Raumtemperatur äquilibriert werden.
HINWEIS: Gebrauchs-MMX erst zubereiten, wenn die Aufarbeitung der Proben und Kontrollen
abgeschlossen ist.
HINWEIS: Der Gebrauchs-MMX muss innerhalb von 2 Stunden nach seiner Zubereitung verwendet
werden.
HINWEIS: Nach der Zugabe der aufgearbeiteten Proben und Kontrollen zum Gebrauchs-MasterMix muss innerhalb von 3 Stunden mit der Amplifikation begonnen werden.
1.
Ein Fläschchen HBV MMX und ein Fläschchen CTM Mn2+ mindestens 30 Minuten bei Raumtemperatur äquilibrieren.
2.
Einen K-Carrier/K-Tray-Carrier in einen K-Carrier-Halter/K-Tray-Carrier-Halter setzen.
3.
Neue K-Tubes oder ein neues K-Tray in den K-Carrier/K-Tray-Carrier setzen, ohne dabei die Wände
der K-Tubes zu berühren.
HINWEIS: Werden in einem Lauf weniger als 24 Röhrchen analysiert, müssen die Positionen 1, 2,
5, 20, 23 und 24 belegt sein, um den K-Carrier im Thermozykler auszubalancieren. Bei
Verwendung eines K-Trays muss der Thermozykler nicht ausbalanciert werden.
4.
Die Verschlüsse der K-Tubes ggf. mit dem K-Tube-Capper entfernen. Die Verschlüsse im
Parkpositionshalter für K-Tubes ablegen.
5.
Den Gebrauchs-MMX wie folgt herstellen:
Für 24 Tests 191 µl CTM Mn2+ in ein Fläschchen HBV MMX geben. Das Fläschchen verschließen und
durch 10-maliges Umschwenken gründlich mischen. Den Gebrauchs-MMX nicht im Vortexer mischen.
Den Gebrauchs-MMX vor Licht schützen und innerhalb von 2 Stunden verwenden.
Für 12 Tests 660 µl HBV MMX in ein 2-ml-Röhrchen geben. 90 µl CTM Mn2+ in das 2-ml-Röhrchen
mit HBV MMX geben, das Röhrchen verschließen und durch 10-maliges Umschwenken gründlich
mischen. Den Gebrauchs-MMX vor Licht schützen und innerhalb von 2 Stunden verwenden. Nicht
verbrauchten HBV MMX und CTM Mn2+ in den Originalfläschchen bei 2-8 °C lagern. Nach dem
Öffnen sind HBV MMX und CTM Mn2+ bei 2-8 °C 30 Tage lang bzw. maximal bis zum
Verfallsdatum stabil.
HINWEIS: Die Menge an CTM Mn2+ ist für den COBAS® TaqMan® HBV-Test spezifisch.
6.
50 µl Gebrauchs-MMX in jedes K-Tube oder in jede Kavität des K-Trays pipettieren.
HINWEIS: Falls die aufgearbeiteten Proben und Kontrollen vor der Amplifikation eingefroren
gelagert wurden, bei Raumtemperatur auftauen lassen. Erst dann mit Schritt 7 fortfahren.
7.
Mit einer Mikropipette mit Aerosolfilter- oder b-Pipettenspitze 50 µl jeder aufgearbeiteten Probe bzw.
Kontrolle in das entsprechende K-Tube bzw. in die Kavitäten des K-Trays mit Gebrauchs-MMX
pipettieren. Jede Probe bzw. Kontrolle vorsichtig durch dreimaliges Auf- und Abpipettieren mischen,
ohne Blasen zu erzeugen.
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Doc Rev. 14.0
8.
Schritt 7 für alle aufgearbeiteten Proben und Kontrollen wiederholen, bis alle in K-Tubes oder K-TrayKavitäten überführt worden sind. Dabei für jede Probe bzw. Kontrolle eine neue Spitze verwenden. Mittels
Sichtprüfung auf Blasen prüfen und diese ggf. entfernen. Die K-Tubes bzw. das K-Tray mit dem K-TubeCapper/K-Tray-Capper verschließen. Mittels Sichtprüfung sicherstellen, dass die korrekten Volumina
zugegeben wurden.
9.
Mit der Amplifikation muss innerhalb von 3 Stunden nach der Zugabe der aufgearbeiteten Proben
und Kontrollen in die K-Tubes bzw. in das K-Tray mit dem Gebrauchs-MMX begonnen werden.
D.
1.
Laden und Bedienung des COBAS® TaqMan® 48 Analyzers
Den Workstation-Computer einschalten und mit der entsprechenden Benutzer-ID und dem
zugehörigen Kennwort unter beim Betriebssystem Microsoft Windows anmelden.
2.
Den COBAS® TaqMan® 48 einschalten. Sicherstellen, dass das Gerät initialisiert wird und
betriebsbereit ist. Wenn sich noch K-Carrier oder K-Tray-Carrier aus vorhergehenden Läufen in
einem der Thermozykler befinden, diese mit Hilfe des K-Carrier-Transporters entfernen.
3.
Die AMPLILINK Software auf dem Computer starten. Mit der entsprechenden Benutzer-ID und dem
zugehörigen Kennwort anmelden.
4.
Um K-Carrier- oder K-Tray-Carrier-Anforderungen für die zu analysierenden Proben zu erstellen,
auf das Symbol Orders klicken. Die Registerkarte Sample auswählen, auf die Schaltfläche New
klicken und die Anforderungsnummer für eine Probe über das Tastenfeld oder mit dem
Barcodescanner eingeben. Die Testdefinitionsdatei für den COBAS® TaqMan® HBV-Test
auswählen. Namen und Versionsnummern der Testdefinitionsdateien finden Sie auf der dem Kit
beiliegenden Produktinformationskarte. Für alle Proben wiederholen. Auf die Schaltfläche Save
klicken.
HINWEIS: Werden in einem Lauf weniger als 24 Röhrchen analysiert, müssen die Positionen 1, 2,
5, 20, 23 und 24 belegt sein, um den K-Carrier im Thermozykler auszubalancieren.
5.
Auf der Registerkarte Quality Control im Fenster Orders Daten zur Qualitätskontrolle eingeben.
Auf die Schaltfläche New klicken und über das Tastenfeld oder den Barcodescanner die Daten von
der im Kit mitgelieferten Controls Value Card für den COBAS® TaqMan® HBV-Test eingeben.
Die Chargennummer, das Verfallsdatum, die Bereiche für die schwach positive und die hoch
positive Kontrolle sowie die chargenspezifischen Kalibrationskoeffizienten des COBAS® TaqMan®
HBV-Tests in die vorgesehenen Felder eingeben. Auf OK klicken.
6.
Auf der Registerkarte K-Carrier im Fenster Orders dem Lauf eine K-Carrier-/K-Tray-Nummer
zuweisen. Im Fenster K-Carrier auf New klicken. In der Zelle rechts neben K-Carrier ID mit dem
Tastenfeld oder dem Barcode-Scanner die K-Carrier-/K-Tray-Nummer aus dem Barcode des
K-Carriers/K-Trays eingeben. Bei Verwendung eines K-Trays die Option K-Tray unter K-Carrier ID
aktivieren. Im Testbereich in der unteren Fensterhälfte die Testdefinitionsdatei für den COBAS®
TaqMan® HBV-Test auswählen. Namen und Versionsnummern der Testdefinitionsdateien finden
Sie auf der dem Kit beiliegenden Produktinformationskarte.
HINWEIS: Hierbei müssen die Ergebnisse eines früheren Laufs mit derselben K-Carrier-ID
akzeptiert werden.
7.
Unter Worklist die erste Zeile der Spalte Type (T) auswählen. Dieses Feld markieren, um das
Listenfeld zu öffnen und dort die gewünschte Art von Kontrolle auszuwählen. Nun auf das Feld mit
der Proben-ID für dieselbe Reihe doppelklicken. Das Fenster LookUp Control wird eingeblendet;
hier werden alle verfügbaren Kontrollen angezeigt. Nach Auswahl der Kontrolle werden die
zugehörigen Kalibrations- und Kontrollwerte im Informationsbereich unten rechts angezeigt. Diesen
Vorgang für alle benötigten Kontrollen wiederholen.
8.
Um Proben zur Worklist hinzuzufügen, auf die erste Position (Reihe) für den Probeneintrag
doppelklicken. Hierdurch wird das Fenster Lookup Sample mit den zugewiesenen Probenanforderungen aufgerufen. Mit Umschalttaste + Pfeiltaste können mehrere Anforderungsnummern
gleichzeitig markiert werden. Sicherstellen, dass allen Anforderungen die Testdefinitionsdatei für
den COBAS® TaqMan® HBV-Test zugewiesen wurde. Namen und Versionsnummern der
Testdefinitionsdateien finden Sie auf der dem Kit beiliegenden Produktinformationskarte.
9.
Auf Save klicken, um die K-Carrier-/K-Tray-Carrier-Anforderungszuweisung zu speichern.
HINWEIS: Werden in einem Lauf weniger als 24 Röhrchen analysiert, müssen die Positionen 1, 2, 5, 20,
23 und 24 belegt sein, um den K-Carrier im Thermozykler auszubalancieren. Bei Verwendung
eines K-Trays muss der Thermozykler nicht ausbalanciert werden.
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E.
Amplifikation und Detektion
1.
Auf der Registerkarte System auf das Symbol Systems klicken. Anschließend auf Open klicken,
um den Thermozykler zu öffnen. Wenn die Abdeckung des Thermozyklers vollständig geöffnet
wurde und im Fenster Systems die Meldung Ready to Load angezeigt wird, den Deckel des
Thermozyklers anheben und in der geöffneten Stellung halten. Mit Hilfe des K-Carrier-/K-TrayCarrier-Transporters den beladenen K-Carrier/K-Tray-Carrier mit den verschlossenen K-Tubes
bzw. dem verschlossenen K-Tray, in denen/dem sich Gebrauchs-Master-Mix und Proben bzw.
Kontrollen befinden, in den Thermozykler laden. Den Deckel schließen.
Im Fenster Systems unter dem Thermozyklersymbol auf Start klicken, um die Thermozyklerabdeckung zu schließen und den Lauf zu starten.
Die Amplifikation und Detektion werden automatisch vom COBAS® TaqMan® 48 Analyzer
ausgeführt.
2.
3.
ERGEBNISSE
Berechung der Ergebnisse
Der COBAS® TaqMan® 48 Analyzer ermittelt automatisch den HBV-DNA-Titer für die Probe oder die
Kontrolle. Der HBV-DNA-Titer wird in internationalen Einheiten (IE)/ml angegeben. Der Umrechnungsfaktor zwischen HBV Kopien/ml und HBV internationalen Einheiten/ml beträgt 5,82 Kopien/IE gemäß dem
internationalen WHO-Standard für HBV für NAT-Tests 97/74629.
Der COBAS® TaqMan® 48 Analyzer:
• Bestimmt den Zyklusschwellenwert (Ct) für die HBV-DNA und die DNA des HBVQuantifizierungsstandards.
• Bestimmt den HBV-DNA-Titer anhand des Ct-Werts für die HBV-DNA und die DNA des HBVQuantifizierungsstandards und der chargenspezifischen Kalibrationskoeffizienten.
• Bestimmt, ob die berechneten IE/ml-Titer für HBV L(+)C und HBV H(+)C in die Sollbereiche fallen.
Validierung eines Laufs – AMPLILINK Software, Version 3.3 und Version 3.4
Das AMPLILINK-Ergebnisfenster oder der Ergebnisausdruck sind auf Alarmhinweise und Meldungen
zu überprüfen, um sicherzustellen, dass der jeweilige Testlauf gültig ist.
Der Lauf ist gültig, wenn keine Alarmhinweise für die COBAS® TaqMan® HBV-Kontrollen
ausgegeben werden.
Der Lauf ist ungültig, wenn bei den COBAS® TaqMan® HBV-Kontrollen einer der folgenden
Alarmhinweise angezeigt wird:
Negativkontrolle:
Flag (Alarmhinweis)
NC_INVALID
Ergebnis
Interpretation
Invalid
Ungültiges Ergebnis oder „gültiges“
Ergebnis, das für das HBV-Ziel
nicht negativ war
Schwach positive HBV-Kontrolle:
Flag (Alarmhinweis)
LPCINVALID
Ergebnis
Interpretation
Invalid
Ungültiges Ergebnis oder Kontrolle
außerhalb des Sollbereichs
Hoch positive HBV-Kontrolle:
Flag (Alarmhinweis)
HPCINVALID
Ergebnis
Interpretation
Invalid
Ungültiges Ergebnis oder Kontrolle
außerhalb des Sollbereichs
Falls der Lauf ungültig ist, das gesamte Testverfahren (Aufarbeitung der Proben und Kontrollen,
Amplifikation und Detektion) wiederholen.
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Doc Rev. 14.0
Interpretation der Ergebnisse:
Bei einem gültigen Lauf ist der Ergebnisausdruck auf Alarmhinweise und Meldungen für jede einzelne Probe
zu kontrollieren. Die Ergebnisse sind wie folgt zu interpretieren:
⇒
Ein gültiger Lauf kann sowohl gültige als auch ungültige Probenergebnisse beinhalten, je nachdem ob
Alarmhinweise und/oder Meldungen für die einzelnen Proben erscheinen.
Probenergebnisse werden folgendermaßen interpretiert:
Titerergebnis
Ursache
Target Not Detected
Der HBV-Ct-Wert liegt oberhalb der Testgrenze oder es wurde kein HBVCt-Wert erhalten. Als Ergebnis angeben „HBV DNA nicht auffindbar“.
< 6.00E+00 IU/mL
Errechnete IE/ml liegen unterhalb der Testgrenze. Als Ergebnis angeben
„HBV DNA nachgewiesen, weniger als 6 HBV DNA IE/ml“.
≥ 6.00E+00 IU/mL und
< 2.90E+01 IU/mL
≥ 2.90E+01 IU/mL und
≤ 1.10E+08 IU/mL
> 1.10E+08 IU/mL
Die errechneten Ergebnisse in IE/ml liegen unter dem unteren Grenzwert
des linearen Bereichs für diesen Test. Diese Ergebnisse unterliegen
starken Schwankungen und können nicht als korrekt betrachtet werden.
Sie sind daher mit Vorsicht zu interpretieren.
Errechnete Ergebnisse, die größer oder gleich 29 IE/ml und kleiner oder
gleich 1,10E+08 IE/ml sind, liegen innerhalb des linearen Bereichs des
Assays.
Errechnete IE/ml liegen oberhalb der Testgrenze. Als Ergebnis angeben
„über 1,10E+08 HBV DNA IE/ml“. Falls quantitative Ergebnisse erfordert
werden, die ursprüngliche Probe mit HBV-negativem Human Plasma oder
Serum verdünnen, je nach Matrize der ursprüngliche Probe, und den Test
wiederholen. Das Ergebnis mit dem Verdünnungsfaktor multiplizieren.
HINWEIS: Proben oberhalb des Testbereichs, die das Ergebnis Invalid (Ungültig) mit dem Alarmhinweis „QS_INVALID“ liefern, sollten nicht als > 1.10E+08 IE/mL angegeben werden.
Wenn quantitative Ergebnisse gewünscht werden, ist die ursprüngliche Probe je nach
Matrix der ursprünglichen Probe mit HBV-negativem humanem EDTA-Plasma oder
Serum zu verdünnen und der Test zu wiederholen. Das Ergebnis mit dem Verdünnungsfaktor multiplizieren.
QUALITÄTSKONTROLLE
In jedem Lauf mit bis zu 24 Proben und Kontrollen ist je eine der Kontrollen CTM (–) C, HBV L(+)C und
HBV H(+)C mitzuführen. Wie bei allen neuen Laborverfahren sollten neue Bediener die Verwendung
zusätzlicher Kontrollen bei jeder Testdurchführung solange in Betracht ziehen, bis ein hohes Vertrauen in die
Fähigkeit zur korrekten Durchführung des Tests gegeben ist. Die Kontrollen können an jeder beliebigen
Position im K-Carrier bzw. K-Tray mitgeführt werden. Der Ergebnisausdruck des Laufs ist auf Alarmhinweise
(so genannte „Flags“) und Meldungen zu überprüfen, um sicherzustellen, dass der Lauf gültig ist.
Negativkontrolle
Die Negativkontrolle CTM (–) C muss Target Not Detected als Ergebnis liefern, d. h. der Ct-Wert für HBVDNA lag über dem Grenzwert für das Assay oder es wurde kein Ct-Wert für HBV-DNA ermittelt, während ein
gültiger Ct-Wert für die HBV-Quantifizierungsstandard-DNA gemessen wurde. Wenn die CTM (–) C dieses
Kriterium nicht erfüllt, ist der gesamte Lauf ungültig. Den gesamten Vorgang (Aufarbeitung der Proben und
Kontrollen, Amplifikation und Detektion) wiederholen. Wenn CTM (–) C ständig ungültig ist, bitten Sie bei der
lokalen Roche-Vertretung um technische Unterstützung.
Positivkontrollen
Die Sollbereiche für HBV L(+)C und HBV H(+)C sind für jede Kontrollcharge spezifisch und auf der im Kit
mitgelieferten Controls Value Card für den COBAS® TaqMan® HBV-Test angegeben. Diese Bereiche werden
in die Control Unit für die AMPLILINK Software eingegeben.
Die HBV-DNA-IE/ml-Werte für sowohl HBV L(+)C als auch HBV H(+)C müssen im Bereich liegen, der auf der
im Kit mitgelieferten Controls Value Card für den COBAS® TaqMan® HBV-Test angegeben ist. Wenn eine
oder beide Positivkontrollen dieses Kriterium nicht erfüllen, ist der gesamte Lauf ungültig. Den gesamten
Vorgang (Aufarbeitung der Proben und Kontrollen, Amplifikation und Detektion) wiederholen. Wenn der
berechnete HBV-DNA-Titer einer oder beider Positivkontrollen ständig außerhalb des Sollbereichs liegt, bitten
Sie bei der lokalen Roche-Vertretung um technische Unterstützung.
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Doc Rev. 14.0
VORSICHTMASSNAHMEN
1.
Wie bei jedem Testverfahren sind gute Labortechniken unerlässliche Voraussetzung für die richtige
Leistung dieses Assays. Aufgrund der hohen analytischen Sensitivität dieses Tests ist äußerst
vorsichtig vorzugehen, um die Reinheit der Kit-Reagenzien oder Amplifikationsansätze zu erhalten.
Alle Reagenzien sind genau auf Reinheit zu überprüfen. Alle verdächtigen Reagenzien sind zu
verwerfen.
VERFAHRENSEINSCHRÄNKUNGEN
1.
Dieser Test wurde für die Bestimmung von Humanserum oder -plasma, das in EDTA oder ACD als
Antikoagulanzien gesammelt wurde, validiert. Das Testen anderer Arten von Proben kann zu falschnegativen oder falsch-positiven Ergebnissen führen.
2.
Zuverlässige Testergebnisse sind nur bei Anwendung sachgemäßer Verfahren für Entnahme,
Transport, Lagerung und Verarbeitung der Proben gewährleistet.
3.
Das Vorliegen des AmpErase-Enzyms im COBAS® TaqMan® HBV-Master-Mix verringert die Gefahr
einer Kontamination durch Amplifikate. Eine Kontamination durch HBV-positive Kontrollen und
klinische Proben lässt sich jedoch nur durch Gute Laborpraxis (GLP) und sorgfältige Einhaltung der
in dieser Packungsbeilage beschriebenen Vorgehensweisen vermeiden.
4.
Dieses Produkt darf nur von in der PCR-Technik geschultem Personal angewendet werden.
5.
Dieses Produkt kann nur in Verbindung mit dem COBAS® TaqMan® 48 Analyzer verwendet werden.
6.
Die Detektion von HBV-DNA hängt von der Anzahl der in der Probe enthaltenen Virenpartikel ab
und kann durch das Probenentnahmeverfahren sowie durch patientenbezogene Faktoren (Alter,
Vorhandensein von Symptomen und/oder Infektionsstadium) beeinflusst werden.
7.
Mutationen in der hochkonservierten Region des viralen Genoms, die durch die Primer bzw.
Sonden des Tests abgedeckt sind, treten zwar selten auf, können jedoch zu fälschlicherweise
niedrigen Werten bei der quantitativen Bestimmung oder zur Nichterkennung des Virus führen.
8.
Bevor Benutzer zwischen verschiedenen Verfahren wechseln, sollten sie aufgrund der inhärenten
Unterschiede zwischen den Verfahren in ihrem Labor Studien zur Korrelation der Methoden
durchführen, um die Unterschiede der Verfahren zu ermitteln.
03584933001-16DE
21
Doc Rev. 14.0
STÖRSUBSTANZEN
Erhöhte Lipid-, Bilirubin-, Albumin- und Hämoglobinkonzentrationen in Proben haben nachweislich keinen
störenden Einfluss auf die quantitative Bestimmung der HBV-DNA mit diesem Test.
Die folgenden Präparate haben ebenfalls nachweislich keinen störenden Einfluss auf die quantitative
Bestimmung der HBV-DNA mit diesem Test.
Nukleotid-DNA-Polymerase-Inhibitor
Adefovir dipivoxil
Tenofovir disoproxil fumarate
Nucleosid-Reverse-Transkriptaseund DNA-Polymerase-Inhibitoren
Lamivudin
Zidovudin
Zalcitabin
Stavudin
Abacavir
HIV-Protease-Inhibitoren
Indinavir
Ritonavir
Nelfinavir
Saquinavir
Amprenavir
Lopinavir/Ritonavir
Nicht-Nucleosid-HIV-ReverseTranskriptase-Inhibitoren
Nevirapin
Efavirenz
Immunmodulatoren
Interferon alpha-2a
Interferon alpha-2b
HIV Fusion Inhibitor
Enfuvirtide
CMV Behandlungspräparate
Ganciclovir
Valganciclovir hydrochloride
Acyclovir
Valacyclovir hydrochloride
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22
Doc Rev. 14.0
NICHT-KLINISCHE LEISTUNGSMERKMALE
Beschreibung der Studie
Die Nachweisempfindlichkeit des COBAS® TaqMan® HBV-Tests wurde durch die Analyse einer Reihe von
Verdünnungen klinischer HBV-Proben (Genotypen A und D) in HBV-negativem Human-EDTA-Plasma und
-Serum bestimmt. Die Genauigkeit und Linearität des COBAS® TaqMan® HBV-Tests wurde durch die
Analyse einer Reihe von Verdünnungen klinischer HBV-Proben (Genotypen A und D) nur in HBV-negativem
Human-EDTA-Plasma bestimmt. Die HBV-Konzentration der klinischen Proben, in Kopien/ml ausgedrückt,
wurde durch den COBAS® AMPLICOR® HBV MONITOR-Test für Verdünnungen innerhalb der Grenzwerte
bestimmt, und dann mit dem Verdünnungsfaktor multipliziert. Die Umsetzung der Verdünnungskonzentrationen in IE/ml erfolgte anhand des Umrechnungsfaktors zwischen internationalen WHO HBVDNA Einheiten/ml und Kopien/ml mit Hilfe des COBAS® AMPLICOR® HBV MONITOR-Tests und des
COBAS® TaqMan® HBV-Tests.
A.
Nachweisgrenze
Die unten aufgeführten Studien haben gezeigt, dass die kleinsten, vom COBAS® TaqMan® HBV-Test
nachweisbaren HBV-DNA-Konzentrationen in EDTA-Plasma und Serum 5,9 IE/ml betragen, dabei liegt die
Positivitätsquote über 95 %. Die kleinsten, bei einer Positivitätsquote von über 95 %, durch ProbitAnalyse nachweisbaren HBV-DNA-Konzentrationen in EDTA-Plasma und -Serum betragen 4,8 IE/ml, bzw.
6,7 IE/ml.
Tabelle 1
Nachweisempfindlichkeit in EDTA-Plasma des COBAS® TaqMan® HBV-Tests
Nennwert
(HBV DNA IE/ml)
Anz. Replikate
Anz. Positive
Positivitätsquote
12,9
120
120
100 %
8,6
120
118
98 %
6,0
120
119
99 %
3,4
120
105
88 %
1,7
120
99
83 %
0,9
120
67
56 %
0,4
120
57
48 %
Probit 95 % Trefferquote
4,8 IE/ml [95 % Vertrauensgrenzen von 3,1 - 9,9 IE/ml]
Tabelle 2
Nachweisempfindlichkeit in Serum durch den COBAS® TaqMan® HBV-Test
Nennwert
(HBV DNA IE/ml)
Anz. Replikate
Anz. Positive
Positivitätsquote
12,9
120
120
100 %
8,6
117
110
94 %
6,0
114
111
97 %
3,4
120
103
86 %
1,7
114
73
64 %
0,9
120
47
39 %
0,4
120
28
23 %
Probit 95 % Trefferquote
03584933001-16DE
6,7 IE/ml [95 % Vertrauensgrenzen von 4,7 - 11,1 IE/ml]
23
Doc Rev. 14.0
B.
Präzision
Die Präzision innerhalb eines Laufs, zwischen Läufen und die Gesamtpräzision wurden nach CLSI-Richtlinie
EP5-A, „Evaluation of Precision Performance of Clinical Chemistry Devices“33, bestimmt. Dieser Vorgang
ergibt die Präzision innerhalb eines Laufs und die Gesamtpräzision, durch eine einzige Studie über mehrere
Tage und mit mehreren Bedienern. Ein Lauf, mit 3 Replikaten jeder Probe, wurde 15 Tage lang täglich
durchgeführt. Jede Probe wurde durch den gesamten COBAS® TaqMan® HBV-Testvorgang bearbeitet,
d. h. Probenaufarbeitung, Amplifikation und Detektion. Die hier angegebene Präzision spiegelt daher alle
Aspekte des Testverfahrens wider. Die Studie wurde für drei verschiedene Reagenzienchargen des
COBAS® TaqMan® HBV-Tests durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 (HBV-DNA IE/ml) und in
Tabelle 4 (HBV-DNA log10 IE/ml) zusammengefasst.
Tabelle 3
Präzision des COBAS® TaqMan® HBV-Tests (in IE/ml)
Probe
1
2
3
4
5
6
Durchschnittlicher 1,07E8 5,33E7 1,04E7 8,52E5 9,28E4 1,21E4
HBV-DNA-Titer (IE/ml)
7
8
9
10
1200
111
49
14
VK innerhalb
eines Laufs
19 %
10 %
12 %
7%
14 %
16 %
14 %
22 %
27 %
50 %
VK zwischen
Läufen
11 %
14 %
12 %
14 %
16 %
18 %
18 %
26 %
17 %
22 %
Gesamt-VK
23 %
17 %
17 %
16 %
22 %
24 %
22 %
34 %
32 %
54 %
Gesamtzahl der
Replikate
132
134
134
135
135
134
135
135
135
135
Tabelle 4
Präzision des COBAS® TaqMan® HBV-Tests (in log10 IE/ml)
Probe
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Durchschnittlicher
HBV-DNA-Titer
(Log10 IE/ml)
8,02
7,72
7,01
5,92
4,94
4,06
3,07
2,03
1,67
1,05
0,07
0,04
0,05
0,03
0,21
0,18
0,06
0,09
0,11
0,59
0,05
0,06
0,05
0,06
0,07
0,07
0,08
0,10
0,07
0,00
Gesamt-Standardabweichung
0,08
0,07
0,07
0,07
0,22
0,19
0,10
0,13
0,13
0,59
Standardabweichung
innerhalb eines
Laufs
Standardabweichung
zwischen Läufen
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24
Doc Rev. 14.0
C.
Linearer Bereich
Wie in Abbildung 8 dargestellt, ist die COBAS® TaqMan® HBV-Testreaktion zwischen 29 (Log10 = 1,46)
HBV-DNA IE/ml und mindestens 1,10E8 (Log10 = 8,04) HBV-DNA IE/ml linear. Diese Studie wurde mit drei
verschiedenen Reagenzienchargen des COBAS® TaqMan® HBV-Tests durchgeführt, mit 131-135
Replikaten pro Stufe.
Abbildung 8
Linearität des COBAS® TaqMan® HBV-Tests
COBAS® TaqMan® HBV Test Ergebnis
Log10 (HBV DNA IE/ml)
9,00
8,00
7,00
6,00
5,00
y = 1,0124x - 0,2358
2
R = 0,9989
Fehlerstriche = 1 Standardabweichung
4,00
3,00
2,00
1,00
0,00
-1,00
0,00
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
6,00
7,00
8,00
9,00
Nennkonzentration
Log10 (HBV DNA IE/ml)
D.
Inklusivität
Aufgrund einer mehr als 8%igen Divergenz der Nukleotide des HBV-Genoms sind bisher sieben HBVGenotypen postuliert worden34,35. Die Bezeichnung dieser Genotypen erfolgt mit Großbuchstaben von A
bis G. Die HBV-Genotypen weisen eine charakteristische geographische Verteilung auf36.
Die Leistungsmerkmale des COBAS® TaqMan® HBV-Tests bezüglich der HBV-Genotypen wurde durch
Analyse von 22 gereinigten, linearisierten und quantifizierten Plasmid-DNAs beurteilt, die Inserts mit
repräsentativen Sequenzen der HBV-Genotypen A bis G enthielten (siehe Tabelle 5). Darüber hinaus wurde
ein Plasmid mit der häufigen Pre-Core-Mutation G:A an der Nukleotidposition 1896 getestet. Jede
Plasmid-DNA wurde zu Konzentrationen von 15, 1500, 1,5E5 und 1,5E8 Kopien/PCR verdünnt. Jede
Verdünnung wurde mit QS-DNA ko-amplifiziert und dreifach mit dem COBAS® TaqMan® HBV-Test
analysiert. Die Titer aller Plasmide wurden mit denen der Kontrollplasmid-DNAs (pc) verglichen.
Der COBAS® TaqMan® HBV-Test lieferte für alle 23 Plasmid-DNAs äquivalente Ergebnisse (siehe
Abbildung 9). Die Kopiezahlen für alle Genotypen und für die Pre-Core-Mutation stimmten miteinander
und mit der Kontrollplasmid-DNA überein.
03584933001-16DE
25
Doc Rev. 14.0
Tabelle 5
COBAS® TaqMan® HBV-Test
Inklusionstest - Plasmidtyp DNA getestet
Plasmidbezeichnung
03584933001-16DE
Genotyp
Probenherkunft
p8423-c1
A
Indien
p1115-c1
A
Burundi
p3952-c1
A
Kamerun
p4199-c2
A
Norwegen
p1764-c1
B
China
p1767-c1
B
China
p3958-c1
B
Ostasien
p830-c1
B
Gesellschaftsinseln
p3982-c1
B
Vietnam
p1786-c1
C
China
p11549-1
C
Bangladesch
p3872-c1
D
Iran
p1103-c1
D
Tunesien
p3953-c2
D
Nordafrika
p18-c1
D
Schweden
p30893-5
D
Schweden
p4244-c1
D
Dänemark
p3217-c1
E
Senegal
p3963-c2
E
Nigeria
p9203-c1
F
Kolumbien
p479-c1
F
Venezuela
p1009-c1
F
Spanien
p00042975-4
G
USA
pIT1896
Pre-Core
Italien
26
Doc Rev. 14.0
Durchschnittliche Log 10 HBV-DNA
Kopien/PCR (n=3)
Abbildung 9
Leistung des COBAS® TaqMan® HBV-Tests mit
HBV-Genotypen A bis G und dem Pre-Core-Mutant
9,0
8,0
7,0
6,0
5,0
4,0
3,0
2,0
1,0
0,0
A
B
C
D
Plasmid
E.
E
F
Kontrolle
G
Pre-Core-Mutant
Klinische Spezifität
Die klinische Spezifität des COBAS® TaqMan® HBV-Tests wurde durch Analyse von HBV-negativem Serum
und EDTA-Plasma von Blutspendern bestimmt. Insgesamt wurden 220 Proben (110 einzelne EDTA-Plasmaund 110 Serumproben), die für HBsAg und anti-HBc nicht reaktiv waren, getestet. Alle Proben erwiesen
sich als negativ für HBV-DNA. Auf der Grundlage dieser Ergebnisse beträgt die klinische Spezifität des
COBAS® TaqMan® HBV-Tests 100 %.
F.
Analytische Spezifität
Die analytische Spezifität des COBAS® TaqMan® HBV-Tests wurde durch Zugabe von gezüchtetem Virus
zu HBV-negativem humanem EDTA-Plasma oder durch Analyse von Proben von infizierten Patienten
beurteilt (siehe Liste in Tabelle 6). Keines der getesteten Nicht-HBV-DNA- oder RNA-Viren war positiv
bezüglich HBV-DNA.
Tabelle 6
Proben für die Ermittlung der analytischen Spezifität
Ins Plasma gegebener Virus
Proben infizierter Patienten (n)
Adenovirus Typ 7
Cytomegalovirus infizierter Patienten (2)
Cytomegalovirus AD-169
Epstein-Barr-Virus infizierter Patienten (2)
Epstein-Barr-Virus
(RAJI Burkitt's Lymphoma Zellen)
Hepatitis-A-Virus infizierter Patienten (2)
Hepatitis-A-Virus PA 21
Hepatitis-C-Virus infizierter Patienten Genotyp 4 (1)
Herpes simplex Typ 1, MacIntyre
Hepatitis-C-Virus infizierter Patienten Genotyp 6a (1)
Herpes simplex Typ 2, MS
HIV-1 infizierter Patienten (2)
HTLV-1 Zellen
Influenza-A-Virus A/Hongkong/8/68
Influenza-B-Virus B/R75
Varicella-Zoster Ellen
West Nile Virus
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G.
Leistungsvergleich mit COBAS® AMPLICOR® HBV MONITOR-Test
Die Leistung des COBAS® TaqMan® HBV-Tests wurde durch Analyse von Serumproben und EDTAPlasmaproben von HBV-infizierten Patienten mit der des COBAS® AMPLICOR® HBV MONITOR-Tests
verglichen. Die Proben stammten von Teragenix (Fort Lauderdale, Florida) und von Serologicals
Corporation (Norcross, Georgia). Insgesamt wurden 65 Proben in beiden Tests zweifach analysiert, und
die durchschnittlichen Ergebnisse verglichen. Proben, deren Ergebnisse oberhalb der Lineargrenze lagen,
wurden zuerst verdünnt, und die Ergebnisse wurden nach der Analyse mit dem Verdünnungsfaktor
multipliziert, um den Titer der ursprünglichen Probe zu erhalten. Mit dem COBAS® TaqMan® HBV-Test
in IE/ml erhaltene Titer wurden durch Multiplikation mit dem Umrechnungsfaktor 5,82 HBV-DNA Kopien/IE
in Kopien/ml umgewandelt. Eine lineare Regressionsanalyse wurde anhand jener Proben, die in beiden
Tests mindestens 500 Kopien/ml enthielten, durchgeführt. Zwischen den mit dem COBAS® TaqMan®
HBV-Tests und dem COBAS® AMPLICOR® HBV MONITOR-Test erzielten Ergebnissen bestand eine hohe
Korrelation, wie in Abbildung 10 dargestellt.
Abbildung 10
Korrelation zwischen COBAS® TaqMan® HBV-Test
und COBAS® AMPLICOR® HBV MONITOR-Test für Plasmaund Serumproben HBV-infizierter Patienten
durchschnittliche Log10 HBV DNA Kopien/ml
High Pure System für Virus-Nukleinsäure Kit
COBAS® TaqMan® HBV Test
10,0
9,0
y = 0,9327x + 0,4855
2
R = 0,977
8,0
7,0
6,0
5,0
4,0
3,0
2,0
1,0
0,0
0,0
2,0
4,0
6,0
8,0
10,0
COBAS® AMPLICOR® HBV MONITOR Test
durchschnittliche Log10 HBV DNA Kopien/ml
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06/2015
Die Informationen zu den AMPLILINK Versionen, zu den Handbüchern, die
entsprechende Terminologie und die Angabe zum Betriebssystem wurden
aktualisiert.
Bei Fragen wenden Sie sich bitte an Ihre Roche-Vertretung vor Ort.
Doc Rev. 14.0
12/2015
Der Abschnitt ENTNAHME, TRANSPORT UND LAGERUNG VON PROBEN wurde
aktualisiert und ungenaue Informationen zu den Blutentnahmeröhrchen wurden
entfernt.
Die Symbolbezeichnungen am Ende der Packungsbeilage wurden im Zuge der
Harmonisierung aktualisiert.
Bei Fragen wenden Sie sich bitte an Ihre Roche-Vertretung vor Ort
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"
High Pure System Viral Nucleic Acid Kit hergestellt für:
Roche Molecular Systems, Inc.
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Branchburg, NJ 08876 USA
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Roche Molecular Systems, Inc.
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Branchburg, NJ 08876 USA
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E-08174 Sant Cugat del Vallès
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H7V 4A2 Laval, Québec, Canada
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Pour toute assistance technique,
appeler le: 1-877-273-3433)
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2720-413 Amadora, Portugal
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05321-010 São Paulo, SP Brazil
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