平成 25 年度新潟薬科大学薬学部卒業研究Ⅰ

平成 25 年度新潟薬科大学薬学部卒業研究Ⅰ
TPST-1 及び TPST-2 による CCR5 N 末端領域の
チロシン硫酸化に伴う個々のパターンならびに
時間的変化
Tyrosine sulfation of CCR5 N-terminal peptide by TPST 1 and 2 follows a discrete
pattern and temporal sequence
薬品製造学研究室
10P014
海沼
４年
将
（指導教員：浅田真一）
要
旨
チロシン残基の硫酸化は、分泌タンパク質及び多細胞真核生物の膜タンパク質の細胞
外領域に見いだされる翻訳後修飾である。チロシンを硫酸化する酵素として
Tyrosylproteinsulfotransferases (TPSTs) が知られている。TPSTs はトランスゴルジ
ネットワークに存在し、
TPST-1 と TPST-2 の 2 種類が報告されている。
これらの TPSTs
は金属イオンによる影響や至適 pH、発現部位及び発現量に違いが見られる。硫酸化チ
ロシンのタンパク質機能における役割の詳細は完全には解明されていないが、膜タンパ
ク質の一部の配列にチロシン残基の硫酸化が重要であることが報告されている。
Seibert らはマクロファージ指向性 HIV-1 株の主要なコレセプターであり、膜タンパク
質である CC-chemokine receptor 5 (CCR5) の N 末端領域 (2-18) に存在するチロシン
残基の TPSTs による硫酸化機構に着目して研究を行った。CCR5 について、その N 末
端領域 (2-18) にはチロシン残基が 4 つ存在し、このチロシン残基の硫酸化が CCR5 の
HIV-1 コレセプターとして欠かせないことが報告されているが、その詳細な硫酸化部位
や硫酸化パターンについてはわかっていない。そこで、CCR5(2-18)を基質とした in
vitro での TPSTs によるチロシン残基の詳細な硫酸化パターンの解明を試みた。
Fmoc 固相法により合成した CCR5 (2-18) を、リコンビナント TPST-1、TPST-2 又
は、それらを混合した TPSTs の 3 種の酵素を使用して CCR5 (2-18) のチロシン残基を
硫酸化した。反応生成物を RP-HPLC、プロテアーゼ処理及び Matrix Assisted Laser
Desorption / Ionization(MALDI-TOF MS)を組み合わせて解析を行った。その結果、
CCR5 (2-18) の 4 つの硫酸化チロシン残基が TPST-1、2、又はその両者によって硫酸
化されていることを確認した。CCR5 (2-18) の硫酸化は、1 つ、2 つ又は 3 つの硫酸化
中間体を経て、段階的に進行した。
これらの中間体の硫酸化パターンから、最初に Tyr-14
又は Tyr-15、続いて Tyr-10、最後に Tyr-3 が硫酸化されることが示唆された。また、
TPST-1 では最初に Tyr-14 続いて Tyr-15 が、TPST-2 では Tyr-15 続いて Tyr-14 が硫
酸化される違いが見られた。しかし、4 つのチロシン残基がすべて硫酸化されたペプチ
ドは、3 つのチロシン残基が硫酸化されたペプチドに比べて少量しか得られなかった。
生体内の CCR5 (2-18) において、4 つのチロシン残基すべてが硫酸化しているかは
不明であるが、Tyr-14 と Tyr-15 が TPST-1 及び 2 のどちらにおいても優先的に硫酸化
されることから、少なくともこの 2 つのチロシン残基は生体内でも硫酸化を受けている
のではないかと予測される。
これらは、TPSTs による CCR5 (2-18) におけるチロシン残基の硫酸化パターンの詳
細な分析結果を示しており、チロシン硫酸化による HIV-1 コレセプター活性の詳細な
解明につながるものと期待される。また、本実験法を用いることにより、TPSTs によ
り硫酸化を受ける生体内の多くのタンパク質の硫酸化機構解明の手がかりとなると思
われる。
キーワード
1.
硫酸化チロシン
6.
ケモカイン
2.
TPST-1
7.
HIV-1
3.
TPST-2
8.
CD4
12. Chymotrypsin
4.
PAPS
9.
RP-HPLC
13. Cayboxypeptidase Y
5.
CCR5
10. MALDI-TOF MS
略語
11. Endoproteinase
Asp-N
表
TPST
:
Tyrosylproteinsulfotransferase
PAPS
:
3’-phosphoadenosin 5’-phosphosulfate
CCR5
:
CC-chemokine receptor 5
CD4
:
Cluster of Differentiation 4
CXCR4
:
CXC-chemokine receptor 4
HIV-1
:
Human Immunodeficiency Virus-1
RP-HPLC
:
Reverse-phase High-performance Liquid
Chromatography
MALDI-TOF MS
:
Matrix Assisted Laser
Desorption/ionization-time-of-flight MS
目次
1. はじめに
1
1-1.TPST によるタンパク質硫酸化
1
1-2.ケモカイン
2
1-3. ケモカインレセプター
2
2. 硫酸化パターンの解明
3
2-1.TPSTs を用いた CCR5 (2-18) の硫酸化
3
2-2. MALDI-TOF MS を用いた CCR5 (2-18) の硫酸化数の特定
4
2-3.CCR5 (2-18) の硫酸化部位の特定
5
2-4. TPST-1 及び TPST-2 の硫酸化パターンの比較
7
2-5. TPSTs による CCR5 (2-18)の硫酸化プロセス
8
3. 結論
9
4. 謝辞
10
5. 引用文献
11
1.はじめに
1-1. TPST によるタンパク質硫酸化
Fig. 1 TPSTs による硫酸基転移反応 [1Fig. 1 より改変]
硫酸基供与体である PAPS からチロシン残基のフェノール性水酸基への硫酸基転
位を触媒し、硫酸化チロシンを生成する。
チロシン残基の硫酸化は、分泌タンパク質及び多細胞真核生物の膜タンパク質の細胞
外領域に見いだされる翻訳後修飾であり、チロシンを硫酸化する酵素として TPSTs が
知られている [1-3]。TPSTs はトランスゴルジネットワークに存在し、現在までに
TPST-1 及び TPST-2 の 2 種類が報告されている [4-5]。これらの TPSTs は金属イオン
による影響や至適 pH、発現部位及び発現量に違いが見られる [6]。
細胞が産生するタンパク質の 1％が TPSTs によりチロシン硫酸化を受けると示唆さ
れている [7]。硫酸化チロシンのタンパク質機能における役割の詳細は完全には解明さ
れていないが、膜タンパク質の一部の配列にチロシン残基の硫酸化が重要であるという
報告がある [2-3、8-9]。
1
1-2. ケモカイン
ケモカインは、白血球走化性に対する作用ケモタキシスを有するサイトカインの総称
で、92~99 個のアミノ酸で構成されている [10]。それぞれジスルフィド結合を形成す
る 4 つの Cys 残基が存在し、一次配列類似性を有している [10]。これらケモカインは、
N 末端側の 2 つの Cys 残基間にアミノ酸が存在しない CC サブファミリーと、アミノ
酸が 1 つ存在する CXC サブファミリーに分類される [10]。
1-3. ケモカインレセプター
Fig. 2 CCR5 の模式図 [11Fig. 1 より改変]
CCR5 の N 末端領域 (2-18) のアミノ酸残基を 1 文字コー
ドで示す。
赤：Tyr-3、Tyr-10、Tyr-14、Tyr-15 において硫酸化を受
ける可能性を持つチロシン残基
緑：酸性アミノ酸残基の Asp-2、Asp-11、Gul-18
ケモカインレセプターは 7 回膜貫通型 G タンパク質共役型受容体で、CC ケモカイン
に対するレセプター (CCR) や、CXC ケモカインに対するレセプター (CXCR) などが
知られている [10]。CCR5 の N 末端領域で、硫酸化チロシン残基と酸性アミノ酸残基
が豊富な領域は、HIV-1 コレセプターとして重要であることが知られている [4-5]。
HIV-1 のエンベロープ糖タンパク質 gp120 は T リンパ球の細胞表面に存在する CD4
を認識して結合する [12]。CD4 が結合すると gp120 の立体構造が変化し、CCR5 の N
末端領域との結合が可能になる [7]。gp120 が CCR5 との結合後、gp41 がより大きな
構造変化を起こし、ウイルス核が細胞内へ侵入する [7]。
CCR5 の N 末端領域にはチロシン残基が 4 つ存在し、このチロシン残基の硫酸化が
HIV-1 コレセプターとして欠かせないことが報告されているが [4-5、13-19]、その硫
酸化部位や硫酸化パターンについて詳しくわかっていない。そこで、in vitro での CCR5
を基質とした TPSTs によるチロシン残基の詳細な硫酸化パターンの解明を試みた。
2
2. 硫酸化パターンの解明
2-1. TPSTs を用いた CCR5 (2-18) の硫酸化
TPST-1、TPST-2 又は、両者の 1：1 混合物と PAPS を CCR5 (2-18) に添加し、16℃
でインキュベートを行い、生成した硫酸化体を RP-HPLC を用いて解析した (Fig. 3)。
A
Fig. 3 硫酸化された CCR5 (2-18)
の PR-HPLC による解析
[11 Fig. 2 より改変]
A;PAPS 存在下で TPST-1、TPST-2 を 1:1
で混合した溶液に CCR5 (2-18) のペプチド
を 16℃で 30 時間 (30h) 及び 100 時間
(100h) 反応物を RP-HPLC で解析した。
No TPST:PAPS のみを加えて 100 時間後に
解析したもの。No PAPS:TPST のみを加えて
B
100 時間後に解析したもの。
B;酵素として TSPT-1 又は TPST-2 のみを使
用して、100 時間反応物を RP-HPLC で解析
した。
TPST-1 及び TPST-2 の両者を 1:1 で 100 時間反応を行った結果、
6 種類の Major peak
(a-f) と 2 種類の Minor peak (c’、e) が検出された。逆相による分離であるため、最も
疎水性の高い peak a が基質である CCR5 (2-18、非硫酸化体) であり、peak b-f は非硫
酸化体よりも早く溶出されることから CCR5 (2-18) の硫酸基の数や部位が異なるもの
であることが示唆される。
TPST-1 及び TPST-2 を用いて反応を行った場合には、TPSTs と同様の peak パター
ンを示したが、各ピークの生成比は異なっていた (Fig. 3 B)。以上の結果は、TPST-1
及び TPST-2 の硫酸化の順番及び部位に差があることを示唆している。そこで、TPST
による違いを明らかにするため、生成物の硫酸数及び部位の特定を試みた。
3
2-2. MALDI-TOF MS を用いた CCR5 (2-18) の硫酸化数の特定
2-1 で示された各 peak fraction を分取し、MALDI-TOF MS で質量を測定すること
で、硫酸化数の特定を行った (Fig. 4)。
Fig. 4 MALDI-TOF MS による CCR5 (2-18) の硫酸化数の特定
[11 Fig. 3 より改変]
MALDI-TOF MS にて、negative ion mode で質量を測定した。Table 1 で示す通りに、推定される
硫酸化数を各 peak に記した。
Table1 MS による硫酸化ペプチドの硫酸化数
[11 Table 1 より改変]
質量分析の結果、peak a が非硫酸化体であることが確認できた。peak b、c は硫酸化
数が 1 つ、peak d は 2 つ、peak e は 3 つ、peak f は 4 つの硫酸化数であった。硫酸基
はレーザーのエネルギー励起により脱離しやすいため、peak d-f では硫酸基が外れたイ
オン種も観測された。また、peak d-f では Na が付加したイオンとして検出された
(Table 1)。
4
2-3. CCR5 (2-18) の硫酸化部位の特定
RP-HPLC では、シリカゲルとの親和性の違いにより硫酸化の有無またはその数を推
定することが可能である。そこで、RP-HPLC で分取した各 peak を
EndoproteinaseAspN、Chymotrypsin、Carboxypeptidase Y を用いて切断し、それら
を RP-HPLC により解析した。
A
B
C
Fig. 5 CCR5 (2–18) の酵素処理及び RP-HPLC を用いた硫酸化部位の特定
[11 Fig. 4 より改変]
TPST-1 及び TPST-2 を 1:1 で混合した TPSTs により硫酸化した CCR5 (2-18) を使用した。
A:CCR5 (2–10) (Ⅰ) と CCR5 (11–18) (Ⅱ) は、EndoproteinaseAsp-N によって CCR5 (2-18) より生成
した。CCR5 (4–10) (Ⅲ) は、Chymotrypsin によって (Ⅱ) から生成した。CCR5 (2–15) と CCR5 (2–
14) は、Carboxypeptidase Y によって CCR5 (2–18) から生成した。
B:(Ⅰ) と (Ⅱ) の各 peak a~f を RP-HPLC により解析した結果、(Ⅰ) の peak b と peak c は溶出時間
の違いから Tyr-14 又は Tyr-15 のどちらかであり、(Ⅱ) の prak e と peak f が Tyr-3 又は Tyr-10 のど
ちらかであることが予想される。
C:(Ⅲ) の peak a、peak e、を RP-HPLC により解析した結果、peak e で溶出時間に変化が出たことか
ら Tyr-10 であることが予想され、(Ⅱ) の peak f が peak e よりも早く溶出されたことより Tyr-3 が最
後に硫酸化されることが予想される。
CCR5 (2-18) の各 peak をプロテアーゼで切断後 (Fig. 5 A)、RP-HPLC を用いて解
析した (Fig. 5 B,C)。Peak b 及び Peak c を Endoproteinase A で切断して得られた
CCR5 (11-18) は、Peak a を切断して得られた CCR5 (11-18) よりも早く溶出されるこ
とから、Try-14 又は Try-15 が硫酸化を受けていることが示唆される。また、Peak d
から得られた CCR5 (11-18) 断片は、さらに早く溶出することより、Try-14、15 の両
方が硫酸化されていることが示される。同様に各断片の溶出時間を比較したところ、
peak e では Tyr-3 又は Try-10 が、peak f では Try-3 及び Tyr-10 が硫酸化されている
ことが示された (Fig. 5 B)。さらに CCR5 (2-10) 断片を Chymotrypsin で切断し、分
析した結果、peak e では Tyr-10 が、Peak f では Tyr-3 及び Tyr-10 が硫酸化されてい
5
ることが示された。Carboxypeptidase Y により C 末端を順に消化した CCR5 (2-15),
CCR5 (2-14) を比較した結果、peak b では Tyr-14 が、peak c では Try-15 が硫酸化さ
れていることが明らかとなった (Table 2)。
TPSTs によって生成した a~f の Major Component を解析する過程で、Minor peak
として、peak b、c、d 中に Minor Component が検出されたため、peak c’、e’と共に
同様の解析を行い、硫酸化部位を同定した (Table 2)。
Table 2 RP-HPLC による Fragment peak の解析
[11 Table 2 より改変]
6
2-4. TPST-1 及び TPST-2 の硫酸化パターンの比較
2-1,2,3 の結果を元に、TPST-1 及び TPST-2 の硫酸化パターンを比較したところ、
TPST-1、TPST-2 両者による酵素反応のメカニズムが以下のとおりであることが示され
た。①最初に、Tyr-14 又は Tyr-15 のいずれかが硫酸化を受け (それぞれ peak b 及び
peak c)、
②次に Tyr-14 または Tyr-15 のうち未硫酸化部位が硫酸化を受ける (peak d)。
③その後、Tyr-10、
が硫酸化を受け (peak e)、④最終的に Tyr-3 が硫酸化を受ける (peak
f)。
Fig. 6 TPST-1 及び TPST-2 の硫酸化パターン [11 Fig. 5 より改変]
Fig. 3 B の TPST-1 及び TPST-2 の反応時間 (100h) の経過をそれぞれ示してい
る。Fig. 3 B における Major Fragment の各ピーク面積より算出した。
TPST-1 及び TPST-2 の硫酸化パターンは共に同様であるが、硫酸化の速度と量は異
なっており、TPST-1 では、まず始めに peak b が peak c に比べ多く形成されたのに対
し、TPST-2 では peak c の方が多く検出されている (Fig. 6)。最終硫酸化体である peak
f も、TPST-1 よりも TPST-2 の方が多く生成されていた。これら硫酸化の総量や、各
硫酸基の付加速度は TPST-1 および TPST-2 でほぼ同一であった。
7
2-5. TPSTs による CCR5 (2-18) の硫酸化プロセス
Fig. 7 TPST-1 及び TPST-2 による CCR5 (2-18) の硫酸化プロセス
[11 Fig. 6 より改変]
TPST-1 及び TPST-2 は CCR5 (2-18) の硫酸化体の量比から太線で示した経路で進行すると考えら
れる。微量ながらも点線で示した経路も確認できた。
以上の結果から、
予想される TPST-1 及び TPST-2 の硫酸化プロセスを示す (Fig. 7)。
CCR5 (2-18) において、TPST-1 及び TPST-2 は、Tyr-14 又は 15 を最も硫酸化しやす
いことが示唆された。その後、Tyr-14、15 が硫酸化され、Tyr-10、Tyr-3 と続く。今回
の実験により、硫酸化パターンの主要経路を特定することができたが、副経路について
の解明には至らなかった。
8
3. 結論
CCR5 (2-18) の 4 つのチロシン残基が TPST-1、TPST-2、又はその両者によって硫
酸化を受けることを確認した。CCR5 (2-18) の硫酸化は、1 つ、2 つ又は 3 つの硫酸化
中間体を経て、段階的に進行した。
これらの中間体の硫酸化パターンから、最初に Tyr-14
又は Tyr-15、続いて Tyr-10、最後に Tyr-3 が硫酸化されることが示唆された。このと
き、TPST-1 では先に Tyr-14 の方が Tyr-15 よりも多く硫酸化を受けるが、TPST-2 で
は先に Tyr-15 の方が Tyr-14 よりも多く硫酸化されるという違いが見られた。しかし、
4 つのチロシン残基がすべて硫酸化されたペプチドは、3 つのチロシン残基が硫酸化さ
れたペプチドに比べて少量しか生成されなかった。
生体内の CCR5 (2-18) において、4 つのチロシン残基すべてが硫酸化しているかは
不明であるが、Tyr-14 と Tyr-15 が TPST-1 及び TPST-2 のどちらにおいても優先的に
硫酸化されることから、少なくともこの 2 つのチロシン残基は生体内でも硫酸化を受け
ていると予想される。
以上の結果は、TPSTs による CCR5 (2-18) に対するチロシン硫酸化の詳細なパター
ンを示しており、チロシン硫酸化による HIV-1 コレセプター活性の詳細な解明につな
がるものと期待される。また、本実験法を用いることにより、生体内の多くのタンパク
質の硫酸化機構解明の手がかりになると期待される。
9
4. 謝
辞
本卒業研究Ⅰを進めるにあたり、随時有益なご助言とご指導頂きました新潟薬科大学
薬学部薬品製造学研究室北川幸己教授に心から感謝致します。
本卒業研究Ⅰを進めるにあたり、直接のご指導とご鞭撻を賜りました新潟薬科大学薬
学部薬品製造学研究室浅田
真一助教に深く感謝致します。
本卒業研究Ⅰを進めるにあたり、直接のご指導とご鞭撻を賜りました新潟薬科大学薬
学部薬品製造学研究室吉原
博夢先輩に深く感謝致します。
本卒業研究Ⅰを進めるにあたり、直接のご指導とご鞭撻を賜りました新潟薬科大学薬
学部薬品製造学研究室頓所
さやか先輩に深く感謝致します。
最後に、薬品製造学研究室のみなさまに感謝致します。
10
5. 引
用文献
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