GeXP/CEQ FA ver2.0-AD L-0013-A-0709 GeXP/CEQシリーズ フラグメント解析ソフトウエア クイックガイド Ver.2 フラグメント解析の準備 解析に使用する試薬 製品名 製品番号 サイズスタンダード - 400 608098 60～400bpまでのサイズマーカー サイズスタンダード - 600 608095 60～600bpまでのサイズマーカー サンプルローディングソリューション（SLS） 608082 泳動サンプル調製に使用します ---- サンプルの蒸発、酸化を防ぎます ミネラルオイル *1 *1 ミネラルオイルはサイズスタンダードに付属しています。 泳動に使用する消耗品 製品名 製品番号 キャピラリーアレイ 33-75B 608087 100ランもしくは常温で30日 10mLセパレーションゲル(シングルレール) 608010 12ラン、4℃保存 20mLセパレーションゲル(デュアルレール) 391438 24ラン、4℃保存 セパレーションバッファ 608012 泳動用バッファ、4℃保存 サンプル用マイクロタイタプレート 608001 サンプル用プレート 25枚入り バッファ用マイクロタイタプレート 608044 バッファ用プレート 100枚入り 蛍光プライマー 使用できる蛍光色素 z ベックマンダイD4 z ベックマンダイD3 z ベックマンダイD2 蛍光色素の蛍光強度について 蛍光強度は D4 が最も強く、次いで D3、D2 となりま す。1 色で使用される場合は蛍光強度の強い D4 の使 用を推奨いたします 蛍光プライマーのオーダー シグマ アルドリッチ ジャパン http://www.sigmaaldrich.com/japan/lifescience/custom-products.html 1 泳動の用意 泳動サンプルの調製 z フラグメント解析のサンプル調製方法は目的に応じ様々です。ここでは蛍光標識が終わ ったサンプルから泳動用サンプルへの調製方法をご説明いたします。 z 高い塩濃度*2は泳動結果に影響を及ぼし、データ取得を困難にする可能性があります。 ① ② 蛍光標識したサンプルを必要に応じて希釈します。 SLSとサイズスタンダード*3，4, 5のミックスを用時調製します。 SLS サイズスタンダード ③ ④ ⑤ 38.5µL 0.5µL 39µL/サンプル ②で調製したミックスをサンプルプレートへ分注します。 希釈したサンプルを1µL加えます。 ミネラルオイルを滴下します。 *2 サンプルの原液を使用する場合、使用量は2µL以内にしてください *3 使用前にボルテックスしてください。 *4 サンプルとのシグナルのバランスによって、使用する量を減らしてください。 *5 サイズスタンダード400bpと600bpは検出するフラグメントサイズに合わせて使い分けてください。 泳動のセットアップ ① バッファプレートにセパレーションバッファ*6を7-8分目入れます。 ② キャピラリ、ゲルが装着されていることを確認します。 ③ サンプルプレートとバッファプレートをロードします。 ④ マニフォールドパージ、キャピラリーフィル*7をマニュアルで行ってください。 ⑤ セットアップモジュールでサンプル名、泳動条件を入力、保存します。 ⑥ 泳動を開始します。 *6 *7 サンプルが入っている列のすべてのウエルにバッファを入れてください。 本体付属のチェックリストをご参照ください。詳細についてはクイックスタートガイド、チュートリアルマ ニュアルをご参照ください。 泳動条件 z 推奨の泳動メソッドはFrag-3、Frag-4です。 泳動条件 泳動温度 泳動電圧 泳動時間 サイズ Frag-1 35℃ 7.5kV 35min 400base Frag-2 35℃ 6.0kV 60min 600base Frag-3 50℃ 6.0kV 35min 400base Frag-4 50℃ 4.8kV 60min 600base 2 1．フラグメント解析ソフトウエアの起動 ① ② ソフトウエアを立ち上げます。 メインメニューからFragmentsモジュールを開きます。 Fragments をクリック 2．データの開き方 ① フラグメント解析モジュールを立ち上げると以下の画面が表示されます。 Raw Data Raw データから開いて解析を行います Analyzed Data 解析済みデータを開きます Open an existing Study 解析済みデータをまとめて管理している Study を開きます 選択して OK をクリックします。 3 ② ③ ①でRaw Dataにチェックすると以下の画面が表示されます。 データ名のリストから開く場合はList Viewのタブを選択して、 左側のAvailable画面からデータ を選択して右のSelectedの画面に移して Nextをクリックします。 ④ サンプルプレートイメージから開く場合はPlate Viewのタブを選択して、プルダウンメニューか ら目的のプレートを選択し、解析するデータをクリックしてNextをクリックします。 4 3．フラグメント解析パラメータの選択・編集・登録の方法とサイズ決定 検出されたピークのサイズをコールします。 サイズスタンダード‐400 400ベースまでのサンプル解析に使用します。 サイズスタンダード‐600 600ベースまでのサンプル解析に使用します。 サイズスタンダード‐80 SNP解析に使用します。SNP解析についてはSNP解析チ ュートリアルマニュアルをご参照ください。 ① ② DefaultFragmentAnalysisParametersを選択しEditをクリックします。 Generalのタブを選択します。 z Identify STR Alleles STR ローカスタグを使用して アリルを同定するときはチェ ックします z SNP Analysis SNP 解析をするときにチェッ クします Slope Threshold ピークのシャープさのパラメータです。値を下げると緩やかなピーク もデータとして検出します。 Relative peak height threshold 1 番シグナルが強いピークとの相対比です。値を下げるとより小さな ピークをデータとして検出します。 通常はデフォルトの値を使用します。 5 ③ Analysis Methodのタブを選択します。 使用したサイズスタンダードを選択し ます。 検量線の引き方を設定します サイズスタンダード-400 → Cubic サイズスタンダード-600 → Quartic サイズスタンダード-80 → Linear 各種サイズスタンダードのラダーは以下のとおりです。 D1（赤）にて標識されています。 サイズスタンダード-400 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 190, 200, 220, 240, 260, 280, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 420 サイズスタンダード－600 60, 70, 80, 90, 100, 120, 140, 160, 180, 190, 200, 220, 240, 260, 280, 300, 320, 340, 360, 380, 400, 420, 440, 460, 480, 500, 520, 540, 560, 580, 600, 620, 640 サイズスタンダード－80 13, 88 6 ④ Advancedのタブを選択します。 蛍光色素によって生じる移動度の相違を補正するパラメータを入力します。 z z PA ver.1 サイズスタンダード 400、600 のフラグメント解析の時 SNP Ver.2 SNP 解析の時 別名で保存します ⑤ ⑥ ⑦ Nextをクリックします。 Analyzeをクリックし、Finishをクリックします。 Result Set Viewに解析データのリストが表示されます。 7 4．解析データの表示 Result Set Viewからのデータ表示方法はSingle Result、Stack Graph、Overlayがあります。 Result Set Viewを表示します。 Single Resultの表示 ① 表示したいデータをハイライトします。 ② 右クリックでShow Single Resultを選択します。 個々のデータの 様々な情報を確認 することができま す。 Stacked Graphの表示 ① 表示したいデータをハイライトします。 ② 右クリックでShow Stacked Graphを選択します。 複数のデータを比 較することができ ます。 Overlay Graphの表示 検出されたピーク の再現性を確認す ることができま す。 8 Fragment Listではすべてのフラグメントデータを表示することができます。 Fragment Listを表示します。 9 5．Exclusion Filter Exclusion Filterを使うことで、たくさんのデータから必要なデータを抽出することができます。 Exclusion FilterはResult Set ViewとFragment List両方で設定することができます。 Exclusion Filterの種類は多数ありますがここではよく使用するFilterをご紹介します。その他の FilterについてはソフトウエアのHelpをご参照ください。 Result Set View, Fragment List の画 の両 面に Exclusion Filter 方の画面にそれぞれ Exclusion があります。 Filter Name, Operator, Value があります。Name, Operator, を入力してくだ Value を さい。 入力してください。 フィルターを削除する場合は、ハイ ライトし右クリックで Remove Filter を選択してください。 設定したフィルターを別名で保存する ことができます。保存したフィルター はプルダウンメニューから呼び出すこ とができます。 チェックを入れると Exclude されたデ ータを表示します。Exclude されたデー タはハイライトされています。 Result set viewのExclusion Filter Name Operator* Analysis outcome not=Pass Current noise(%) >2 Current Chng(%/min) <-0.2 Number pks D4 >, < Channel 1 overrange =yes Size cal corr coef <0.9 No. siz stds missed > Fragment ListのExclusion Filter Name Operator* Dye =D1 Not = D4 Est frag size (nt) >,< Allele ID =Blank Pk clstr ht ordr Not = 1 Pk height (rfu) < 結果 解析結果のStatusがPass 以外のデータを除外 電流値のノイズが大きいものを除外 電流値の下降率が大きいものを除外 D4のピーク数が推定より多い/少ないデータを除外 D1のシグナルが振り切っているデータを除外 サイズスタンダードのカーブフィットの低いデータを除外 検出されないサイズスタンダードが一定数より多いデータを除外 結果 D1のデータを除外 D4以外のデータを除外 目的のピークサイズより大きい/小さいピークのデータを除外 Allele IDがついていないピークを除外 クラスターを構成しているピークの中で1番高いピーク以外のデ ータを除外 ピークの高さ(rfu)で除外 *記載されている値は例です。 10 6．フラグメントデータの追加、除外 Single Result ViewまたはStacked Graphを開けて解析データを確認します。Exclusion Filterで除外でき なかったピークや、反対に必要なピークが除外されてしまった場合、マニュアルで個々のピークデータを 追加、除外することができます。 ① 目的のフラグメントピークをクリックします。クリックしたピークはボックスに囲まれます。ボッ クスで囲まれないピークはデータとして認識するための条件を満たしていないので、データとして 採用することはできません。 ② ボックスが選択されている状態で右クリックします。 Include チェックを入れると選択されているピークが データとして採用されます。はずすとデータ を除外します。 Edit Annotation Allele ID などマニュアルで入力します。 Copy フラグメント解析結果をコピーし、ワードな どに張り付けることができます。 11 7．Studyの保存、データの追加、削除 Studyは解析したデータをグループとして保存します。保存されたStudyはFile/ OpenのStudyのウインドウ に表示されます。データを蓄積して、一つのグループとして管理するのに便利です。 ツールバー/File Studyについて New Study Open Study Manage Study 新規Studyを作成します 既存のStudyを開きます StudyのRename、削除を行います データの追加 Add Raw Data to Study Add Result Data to Study Raw DataをStudyに解析後追加します 解析済みデータをStudyに追加します データの除外（Exclude）、削除（Remove） Result Set Viewから行います。ExcludeまたはRemoveしたいデータをハイライ トし、右クリックでExclude resultsまたはRemove from Studyを選択します。 z Exclude:除外はStudyのデータの一つとして存在しますが、データとして は使用しない状態です。 z Remove:削除はStudyのデータから完全に削除し、Studyの中に存在しない データとなります。 8．再解析 ① ② ③ Result Set View以外のウインドウを閉じます。 再解析したいデータをハイライトします。 右クリックしReanalyze Resultsを選択します。 再解析のオプション From Sample Data Raw Dataから解析を行い、既存のデータを再解析したデータへ置き換えます。 Using New Parameter 解析パラメータを変えて解析を行います。 Using Additional/Edited Locus Tags 解析のパラメータは変えませんが、選択したLocus TagのアリルIDを付加します。 12 9．解析パラメータの編集-STR/SNPアリル同定 STR解析やSNP解析で検出されたフラグメントのアリル同定、SNP判定を同時に解析することができます。 STR解析 ① GeneralのタブのIdentify STR Allelesにチェックをいれます ② STRのタブを選択します。 ③ Availableのボックスからローカスタグを選択し、Selectのボックスに移します。(ローカスタグの 作成方法は後述) ④ 別名で保存します。ローカスタグを組み込んだ解析パラメータを使用すると、サイズコールとアリ ル同定を同時に行います。 SNP解析 ① GeneralのタブのSNP Analysisにチェックをいれます ② SNPのタブを選択します。 ③ AvailableのボックスからSNPタグを選択し、Selectのボックスに移します。(SNPタグの作成方法は 後述) ④ 別名で保存します。SNPタグを組み込んだ解析パラメータを使用すると、サイズコールとSNP判定を 同時に行います。 13 10．STRローカスタグの作成： ビニング解析 ローカスタグはビニング解析の結果から作成します。ビニング解析を行うために同じSTRローカスのデータ を少なくとも事前に10個取得しておく必要があります。 ① ② ③ ④ メインメニューからFragmentsを開き、Raw Dataを選択します。 解析するデータを選択し、Selectedに移動しNextをクリックします。 解析パラメータを選択し、Nextをクリックします。 Finishをクリックすると、サイズコールされたデータのリストが表示されます。 ⑤ Study ExplorerのBinningをハイライト、右クリックしNewを選択し ます。 ⑥ ビニングのパラメータを入力しNextをクリックします。 Dye：使用している Dye を選択します。 Fragment Range From：検出されるフラグメントサイズ の範囲を入力します。 Maximum Bin Width：ビンの幅を設定します。最大 1 で す。 Repeat Unit Length：繰返配列ユニット数を入力します Allele Naming Convention：アリル ID の表示方法を選 択します Nominal size- フラグメントの正数値化した検出サイズ Alphabetic- 連続したアルファベット Nyumeric－ 連続した数字 14 Trace View：Bin View にあるシ グナルをクリックするとそのフ ラグメントデータが表示されま す。データを右クリックし Show result names を選択するとサン プル名が表示されます。 Phase Shift：マジョリティのピークが 作成したビンから外れている場合使用 します。+1 するとビンが 1 ベース大き いほうへ移動します。 ⑧ Show Phantom Bins：繰返し数計算され るビンの間にあるビンを表示します。 変異で生じるアリルを作成するのに有 用です。 必要がある場合Alleleを編集します。 アリルの追加 1) Show Phantom Bin にチェックをい れます 2) 目的のビンをクリックします。 3) 右クリックで、Create Allele を選 択します。 アリルの削除 1) 目的のアリルをハイライトしま す。 2) 右クリックで、Remove Allele を選択します。 アリルの追加 1) 加えたいアリルサイズの前後ど ちらかのアリルをハイライトし ます。 2) 右クリックで、Add Shorter/Longer Allele を選択 します。 ビンの中心サイズの変更：Apparent Size の中心サイズを編集します。 15 ⑨ Nextをクリックします。 ⑩ ⑪ Locus Tag とLocus Nameに同じ名称を入力します。 Locus Tag はAnalysis parameterから編集することができます。 STRプライマーセットを使用した解析についてはGenomeLab Human STR Primer Setを使用してのジェノタイ プサマリーの作成をご参照ください。 16 1１．SNP Locusの作成 SNPのLocus Tagを作成します。 ① 解析パラメータを開き、SNP Locus Tagsを選択します。 New Locus 新しい Locus を作成 Edit Locus 既存の Locus を編集 ② New Locusをクリックします。 Locus Tag SNP Locus の名称を入力。解析パラメータの SNP Locus Tags に表示されます。 Locus Name Locus Tag と同じく入力します。 Apparent Fragment Size 検出されるフラグメントサイズを入力します。 検出が予測されている SNP 以外は Delete で 削除します。 SNP解析の詳細についてはSNP解析チュートリアルマニュアルをご覧下さい。 17 12．AFLP解析-フラグメントデータのバイナリー表示 ① Study ExplorerのAFLPsをハイライト/右クリックでNewを選択します。 Dye デフォルトのパラメータを 使用します。 使用していない蛍光色素の チェックをはずします。 Maximum Bin Width：設定値は最大 1 です。 Y Threshold：値を上げるとピークハイトの低いデータを除外します。 Exclude Fully Populated Peak：すべてのサンプルにピークが存在するビンを除外します。 Exclude Sample w/o Qualifying Peaks：解析パラメータに合致しないピークが存在するサン プルを除外します。 ② サンプルごとにピークの有無が表示されます。 Sample Axis AFLP テーブルの表示方 向を変更します。 Fragment Count Bin に存在するピークの数を表示 Binary Presence Bin にピークが存在するか 0/1 で表 示 Fragment(s) Max Y Bin に存在するピークの高さを表示 Y Threshold ピークの高さの Threshold を設定し ます。数値を上げると高さが低いピ ークは除外されます。 18 ③ AFLPバイナリー表示データをエクスポートします。 File/Export AFLPを選択します。 Text File (*.csv)： Excelで開くことができます。 NTSYSpc（*.nts）： NTSYSpcソフトウエア(3rd party software)に直接インポートできます。 13．データのエクスポート/インポート CEQファイルフォーマット：サンプルに関するすべてのデータが含まれます。 ① ツールバーからFile/Export Resultsを選択します。 ② Exportするファイルを選択し、Selectedのボックスに移しNextをクリックします。 ③ Save asをクリックし、ファイルフォーマットからCEQを選択します。 ④ Remove CEQ Tracking SuffixとResolve Filename ConflictのチェックをはずしますFinishを クリックします。 ⑤ サンプルごと独立したファイルがエクスポートされます。 テキストファイルフォーマット：フラグメントリストがエクスポートされます。 ① ツールバーからFile/Export Resultsを選択します。 ② Exportするファイルを選択し、Selectedのボックスに移しNextをクリックします。 ③ Save asをクリックし、ファイルフォーマットからを選択します。 ④ Remove CEQ Tracking SuffixとResolve Filename ConflictのチェックをはずしFinishをクリ ックします。 ⑤ サンプルごと独立したファイルがエクスポートされます。 CSVファイルフォーマット：Studyにあるすべてのフラグメントリストが1つのファイルでエクスポー トされます。 ① ツールバーからFile/ Export Fragments/Genotypes…を選択します。 ② ファイルフォーマットからCSVを選択し,Filenameを入力して保存します。 CEQファイルフォーマットのインポート ① データベースを開き、インポートしたいデータベースのプロジェクト（Defaultなど）を選択 します。 ② 右クリックでImportを選択し、インポートするファイルを選びます。 19 14．データベース Working Database すべてのデータはWorking Databaseに保存されます。ワーキングデータベースを変更する場合はす べてのモジュールを閉じてください。 Working Databaseの変更 ① データベースを開きます。 ② Working Databaseにしたいデータベースをハイライトし右クリックします。 ③ Set as Working Databaseを選択します。 新しいデータベースの作成 ① ツールバーのTools/ New databaseを選択します。 ② データベースの名称を入力し、Set as Working databaseを選択します。 データベースの削除 ① 削除したいデータベースをハイライトします。 ② ツールバーのTools/ Delete databaseを選択します。 Project データベースの中でデータを振り分けて保存することができます。 ① ワーキングデータベースをハイライトします。 ② 右クリックし、New Projectを選択します。 Set Upの保存時、泳動開始時の2か所でProjectを選択するPull Downメニューがあります。 20 L-0013-A-0709
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