組織球肉腫罹患犬における免疫チェックポイント解析

（
）
【研究紹介】
組織球肉腫罹患犬における免疫チェックポイント解析
田川
道人）
）帯広畜産大学動物医療センター（〒
‐
高木
哲）
帯広市稲田町西
）北海道大学大学院獣医学研究科先端獣医療学教室（〒
‐
線
番地）
札幌市北区北
条西
）
路も CTLA-4 同様 T 細胞を抑制する（図
はじめに
［］。
）
腫瘍が発生した場合、生体内の免疫機構は腫瘍抗原を
犬の組織球肉腫はマクロファージおよび間質の樹状細
認識して腫瘍を攻撃し、アポトーシスを誘導する。この
胞を由来とする悪性腫瘍であり、極めて悪性度の高い腫
過程の中で腫瘍細胞は様々な機構により免疫を回避し、
瘍とされる。バーニーズマウンテンドッグやフラット
増大していくとされ、近年の研究により免疫チェックポ
コーテッドレトリーバー、ゴールデンレトリーバーが好
イント分子が腫瘍の免疫回避に重要な役割を果たすこと
発犬種とされ、我が国ではウェルシュコーギーペンブ
が明らかとなった。つまり、腫瘍細胞が CTLA-4 および
ロークでの好発が知られている［］。治療は腫瘍が局所
PD-1 のリガンドである CD80／86 および PD-L1 を過剰に
病変の場合は積極的な外科的切除が推奨されるが、多く
発現することで宿主の腫瘍免疫を抑制（疲弊化）してい
は肺やリンパ節、腹腔内臓器への転移が急速に進行し、
る［］。それらの結合をブロックすることで生体が本来
抗がん剤を用いた全身療法が必須となる。これまでいく
有している腫瘍への免疫応答を賦活化させる点に着目し
つかの抗がん剤治療が本疾患に行われてきたが、いずれ
た免疫チェックポイント阻害剤が開発され、根治切除不
も十分な効果は得られておらず、ロムスチン（CCNU）
能な悪性黒色腫や非小細胞肺癌、尿路系の癌などで臨床
を用いた場合の生存期間中央値は
試験が行われており、有望な結果が得られている［］。
∼
日程度とされ、
現時点で有効性の高い治療法は確立されていない［］。
このような背景から、免疫チェックポイント阻害剤は
免疫チェックポイントとは、主にリンパ球上に発現し
免疫を正または負の方向に制御する分子であり、近年ヒ
ト医療において極めて高い注目を集めている。CD28、
CTLA-4（Cytotoxic T-lymphocyte antigen 4）および PD
-1（Programmed cell death 1）はリンパ球表面に発現
するレセプターであり、抗原提示細胞側に発現するリガ
ンドと結合することで T 細胞の活性化を制御する免疫
チェックポイント分子である。CD28 は T 細胞に恒常的
に発現しており、抗原提示細胞が発現する CD80 もしく
は CD86 と結合することで、T 細胞に活性化のシグナル
を伝達する。一方、CTLA-4 は CD28 と同じ CD80／86 を
リガンドとし、T 細胞を抑制する。CTLA-4 は CD80／86
に対し CD28 の数十∼数百倍高い結合性を有しており、
CTLA-4 が発現した場合 T 細胞は優先的に抑制されるこ
ととなる。また PD-1 とそのリガンドである PD-L1 の経
連絡責任者：田川
〒
道人
‐
TEL：
北
獣
会
誌
（
帯広畜産大学動物医療センター
帯広市稲田町西
−
）
−
線
番地
E-mail : [email protected]
図
．免疫チェックポイントによる T 細胞の活性化制御
機構。T cell 側の上向き矢印は活性化、下向き矢
印は抑制を示しており、どの分子が発現するかで
T 細胞の活性化は正または負に制御されている。
（文献より引用改変）
（
）
獣医領域においても有効性の高い治療選択になり得る可
れを打開する可能性を有した画期的な治療薬といえる。
能性を有しており、さらにマクロファージおよび樹状細
．犬組織球肉腫における研究について
胞という抗原提示細胞が由来である組織球肉腫において
は宿主の腫瘍免疫に対し免疫チェックポイント分子が何
らかの影響を与えている可能性がある。過去の報告［
］
犬組織球肉腫では CRP やフィブリノーゲン等の炎症
マーカーの上昇が知られており［
］、腫瘍局所において
で、CD28 および CTLA-4 のリガンドである CD86 の
強い炎症反応が誘起されているものと思われる。免疫
mRNA が組織球肉腫の腫瘍組織中において高発現であ
チェックポイントである CTLA-4 や PD-1 は腫瘍性疾患
ることが明らかとなっていることからも、組織球肉腫罹
の他、炎症性疾患においても発現が増加することが知ら
患犬における免疫状態を免疫チェックポイントに着目し
れている。つまり組織球肉腫が引き起こす炎症反応が免
て評価する必要があると考えた。そこで本稿では、ヒト
疫チェックポイントに影響し、宿主の抗腫瘍免疫の低下
での免疫チェックポイント研究を簡略に解説するととも
を引き起こしている可能性があり、とくに組織球肉腫自
に、筆者が北海道大学獣医学部先端獣医療学教室に所属
体が CD28 および CTLA-4 の共通リガンドである CD86
していた時に行った研究について紹介する。
を強く発現していることからも免疫チェックポイントの
解析はそれら阻害剤の使用の是非を決定する上で重要な
．免疫チェックポイント研究の動向
ファクターになるものと思われる。そこで著者らは組織
免疫チェックポイントの概要については前述のとおり
であるが、CTLA-4 と PD-1 および宿主免疫との関係性
球肉腫罹患犬の末梢血中免疫状態を評価することを目的
とし、以下の検討を行った。
について、ヒトで様々な研究が行われている。CTLA-4
．．材料と方法
に関して、非小細胞肺癌や喉頭の
平成
平上皮癌患者の末梢
年
月
年
月に北海道大学動物医療セン
血中 CD4 および CD8 陽性リンパ球において CTLA-4 の
ターに来院した組織球肉腫罹患犬
発現増加が認められている［
肉腫以外の腫瘍罹患犬
の
、］
。また、乳癌および喉頭
平上皮癌患者では末梢血中の CTLA-4 遺伝子発現が
増加しており、とくに喉頭の
平上皮癌では病期の進行
頭（HS 群）、組織球
頭（other tumor 群）
、健常犬
頭
（control 群）を対象とした。HS 群および other tumor
群については全症例で外科的切除もしくは生検により組
と発現増加に関連がみられている［、］。PD-1 に関しても、
織学的に確定された。また、control 群については健康
末梢血中 CD4 陽性 PD-1 陽性率の高い非小細胞肺癌や前
診断等で来院し臨床的に異常のみられない犬より許可を
立腺癌患者で生存期間の短縮がみられており［
得て採材を行った。その他の腫瘍群は全て治療前に採材
、］、ま
た、いくつかの血液腫瘍患者では病期と PD-1 陽性率に
を行っているが、HS 群については
関連がみられている［
チンによる治療が行われていた。
］
。このように様々な固形癌や血
例ですでにロムス
液腫瘍において上記免疫チェックポイントは末梢血液中
全症例より末梢血液を採取し、末梢血単核球（PBMC）
で発現が亢進しており、進行度、予後との関連が示唆さ
を比重遠心法にて分離した。分離した PBMC は抗 CD4／
れている。また、それら免疫チェックポイント経路を阻
CD8 抗体（YKIX302.9／YCATE55.9, AbD Serotec）とと
害する抗体薬はすでに臨床応用されており、抗 CTLA-4
もに抗 CD28（5B8, Affymetrix）
、CTLA-4（ANC152.2,
Ⓡ
抗体である Ipilimumab（ヤーボイ、小野薬品）は悪性
Ancell Corporation）
、PD-1（BAF1086, R&D Systems）
黒色腫、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、前立腺癌
抗体にて染色、フローサイトメトリーにて各免疫チェッ
Ⓡ
に対して、抗 PD-1 抗体である Nivolumab（オプジーボ、
クポイント分子の発現率を解析した。また、全血から血
小野薬品）は悪性黒色腫、非小細胞性肺癌、腎細胞癌に
清を分離し、血清中 IFN-γ 濃度を ELISA 法（Canine IFN
対して適応もしくは臨床試験中である。両薬剤ともに悪
-γ immunoassay kit，R＆D Systems）にて測定した。
性黒色腫に対する臨床研究が盛んであり、単剤投与、標
統計解析には
準化学療法との併用等が検討され、いずれにおいても生
には Kruskal-Wallis 検定および Steel-Dwass 検定を用い
存期間の延長をもたらす場合が多く、良好な結果が得ら
た。
群間には Mann-Whitney U 検定、
れている［］。免疫チェックポイント阻害剤は腫瘍に対
．．結果
する免疫の疲弊化を解除するという特異的な作用機序か
各群の年齢中央値は HS 群．歳（
歳（
−
−
群間
歳）
、other tu-
ら今後も様々な腫瘍性疾患に応用されるものと思われ、
mor 群
歳）、control 群．歳（
既存の治療では治癒の見込めない進行状態であってもそ
であり、群間に有意差は認められなかった。また性差も
北
獣
会
誌
−
（
歳）
）
（
群間で差はみられなかった。HS 群は
）。
頭が局所性、
IFN-γ については、HS 群
（
頭が播種性であり、other tumor 群には悪性黒色腫、
平上皮癌、肺腺癌、血管肉腫、骨肉腫、移行上皮癌、軟
部組織肉腫、肛門嚢腺癌が含まれた（表
tumor 群において
）。なお、other
tumor 群（
． ±
． ±
． pg／m ）、control 群（
4、CD8 ともに群間で有意差は認められなかった。一方、
HS 群（．％± ．％）の CD4 陽性細胞における CTLA
-4 陽性率は、control 群（．％± ．％；＝．
）
．各群の臨床情報
群（n）
犬種（n）
HS
WC（）
（）
FCR（）
発現率を各群間で比較したところ、CD28 については CD
年齢＊（範囲）性別（n）
オス（）（、脳：、肺；、皮膚）
播種性 HS（）
Other tumor BMD（）（ − ）メス（）移行上皮癌（、膀胱）
（）
MD（）
オス（）メラノーマ（、下顎）
その他（）
平上皮癌（、下顎）
肺腺癌（、肺）
おいても HS 群（．％± ．％）は other tumor 群
（．％± ．％；＝．
血管肉腫（、脾臓）
）、control 群（．％±
骨肉腫（、下顎）
）と比較し有意に高い CTLA-4 陽性
軟部組織肉腫（、皮下）
肛門嚢腺癌（、肛門嚢）
率であった。PD-1 については、CD8 陽性細胞において
．％±
あった（図
．％）は control 群（
．％±
Control
Beagle（）．（ − ）メス（）
（）
BMD（）
）と比較し有意に高い PD-1 陽性率で
）
。
少数例ずつではあるが、HS 群を局所性と播種性、other
診断（n、部位）
．（ − ）メス（）局所性 HS（）
その他（）
と比較し有意に増加していた。さらに CD8 陽性細胞に
．％；＝．
． ±
． pg／m ）間で有意な差は認められなかった。
表
CD4 および CD8 陽性細胞中の CD28、CTLA-4、PD-1
HS 群（
． pg／m ）
、other
頭が採材時に肺、リンパ節、腹腔内
臓器などに転移がみられた。
．％；＝．
）
オス（）
その他（）
HS；組織球肉腫、WC；ウェルシュコーギーペンブローク、
FCR；フラットコーテッドレトリーバー、BMD；バーニーズマ
ウンテンドッグ、MD；ミニチュアダックスフント、＊；中央値
tumor 群を転移の有無で分け、それぞれ各発現率を比較
したところ、有意差は認められないものの播種性（
±
．％）は局所性（
．±
．％；＝．
．
）と比
較し CD4 陽性 PD-1 陽性率が高い傾向にあった（表
）。
一方、other tumor 群では転移のあるもの（．± ．％）
がないもの（．± ．％；＝．
）と比較し、有意
に高い CD8 陽性 CTLA-4 陽性率であり、CD4 陽性細胞
表
．局所性および播種性組織球肉腫（HS）における
免疫チェックポイント発現率の比較
免疫チェック
ポイント
CD28
CTLA-4
においても転移のあるもの（．± ．％vs ．± ．％；
＝．）で CTLA-4 陽性率が高い傾向にあった（表
PD-1
リンパ球
サブセット
局所性 HS
（n＝）
CD4+
．± ．
．± ．
．
．± ．
．±
．
CD4+
．± ．
．± ．
．
CD8+
．± ．
．± ．
．
CD4+
．±
．
．±
．
．
CD8+
．± ．
．±
．
．
A；CD28、B；CTLA-4、C；PD-1、HS；組織球肉腫
獣
会
誌
（
）
値
CD8+
図．CD4 陽性および CD8 陽性細胞における免疫チェックポイント発現率
北
播種性 HS
（n＝）
．
（
）
表．Other tumor 群における転移の有無による免疫
チェックポイント発現率の比較
免疫チェック
ポイント
リンパ球
サブセット
CD28
CTLA-4
PD-1
ものの、組織球肉腫罹患犬はその他の腫瘍群と比較し低
値であり健常犬と同等であった。
において、
転移あり
（n＝）
転移なし
（n＝）
CD4+
．± ．
．± ．
．
細胞では IFN-γ の産生が低下することが報告されてい
CD8+
．±
．±
．
る［
CD4+
．± ．
．± ．
．
IFN-γ の産生低下をもたらした可能性が考えられた。
CD8+
．± ．
．± ．
．
CD4+
．±
．
．±
．
．
CD8+
．±
．
．± ．
．
．
．
値
CTLA-4 の阻害は IFN-γ の産生を亢進し、また PD-1 陽性
］。組織球肉腫における CTLA-4、PD-1 の高発現が
．まとめと今後の展望
本研究により、犬組織球肉腫の末梢血中リンパ球にお
．．考察
いて CTLA-4 および PD-1 の発現上昇が明らかとなった。
組織球肉腫罹患犬、組織球肉腫以外の腫瘍罹患犬、健
これは組織球肉腫罹患犬における抗腫瘍免疫の低下を示
常犬で末梢血中の免疫チェックポイント解析を行ったと
唆するものであり、今後それら免疫チェックポイントに
ころ、組織球肉腫罹患犬において CD4 陽性細胞、CD8
対する阻害薬を用いた新規治療法開発の足掛かりになる
陽性細胞ともに CTLA-4 陽性率の有意な上昇がみられた。
ものと思われる。ごく最近、抗炎症薬の使用が組織球肉
CTLA-4 は、CD28 と CD80／86 が結合し T 細胞が活性化
腫の発生リスクの低下と関連がみられることが報告され
した後に発現が増強する。また、感染症や自己免疫疾患
た［
等の炎症反応によってその発現が上昇することが知られ
引き起こされることがわかっており、炎症をどのよ
ている。過去の報告［
うに制御していくかが今後の課題であると思われる。
］
において、組織球肉腫罹患犬で
］。先に示したように、組織球肉腫では強い炎症が
は強い炎症反応が引き起こされていることが明らかと
疲弊化した腫瘍免疫の再活性化をコンセプトとしてい
なっており、CTLA-4 の発現率に影響を与えた可能性が
る免疫チェックポイント阻害療法は、多くの腫瘍で効果
ある。CTLA-4 は制御性 T 細胞（Treg）において恒常
を発揮しているが、いくつかの問題点も抱えている。ひ
的に発現、機能的に重要な役割を有している［］。組織
とつはその副作用であり、
球肉腫罹患犬における CTLA-4 の増加は Treg の増加と
示したことが報告されている［
関連している可能性があり、今後さらなる検討が必要で
除による自己免疫反応と考えられ、大腸炎、皮膚炎、肝
ある。また、局所性および播種性組織球肉腫では CTLA
炎、甲状腺炎、下垂体炎、糖尿病などが発生する。他の
-4 の発現に明らかな差は認められなかった。組織球肉腫
問題点として薬剤自体の価格がある。抗体薬であること
は局所性、播種性に関わらず特異的に CTLA-4 の発現を
から開発、製造に多くの費用がかかり、現在のヒト医療
高めているとも考えられる。一方、組織球肉腫以外の腫
における薬価設定で獣医療に応用することは現実的では
瘍においては、CD8 陽性細胞での CTLA-4 の発現は転移
ない。また、人体薬を犬猫に直接用いることは異種蛋白
の有無と関連していた。これは転移症例における免疫の
に対する抗体産生を誘起し、効果の減弱のみならず自ら
疲弊化と関連しているものと思われ、CTLA-4 の発現は
の免疫チェックポイント分子に対する自己抗体が産生さ
様々な腫瘍での予後因子となり得る可能性を有しており、
れる可能性がある。現在、獣医療においても免疫チェッ
症例数を増やした更なる検討が必要である。
クポイント阻害剤の研究、開発が進められており、近い
PD-1 について、組織球肉腫罹患犬では CD8 陽性細胞
％前後の患者で高い毒性を
］。多くは免疫抑制の解
将来使用可能になるものと思われる。
において健常犬と比較し有意に高い PD-1 陽性率であっ
今回紹介させていただいた研究内容は、筆者が北海道
た。CD8 陽性細胞における PD-1 の発現は IL-10 や IL-6 と
大学獣医学部先端獣医療学教室に所属していた際に行っ
関連しているとされる［
］
。しかしながら、犬の組織球
たものです。多大なご指導を賜りました北海道大学獣医
肉腫を用いた検討ではそれらのサイトカインに有意な変
学部感染症学教室の今内覚准教授、前川直也先生に深謝
化はみられていない［
を申し上げます。また、ここまで読んでくださった皆様
］
。組織球肉腫罹患犬における PD
-1 発現の詳細な機序は不明であるが、組織球肉腫細胞株
にも感謝を申し上げます。
において PD-1 のリガンドである PD-L1 の高発現が認め
本研究は JSPS 科研費 JP
られており［
］
、PD-1／PD-L1 経路の阻害は犬組織球肉腫
の助成を受けたも
のです。
における新たな治療戦略となる可能性を有している。
IFN-γ については、各群間で有意な差を認めなかった
北
獣
会
誌
（
）
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