Agilent 1290 Infinity Ⅱ LC システムを用いた全自動プレカラム誘導体

Agilent 1290 Infinity Ⅱ LC システムを用いた
全自動プレカラム誘導体法によるアミノ酸の
キラル分離
<要旨>
アミノ酸を発蛍光性のジアステレオマーに誘導することで、D 体と L
体を分離しました。蛍光性のジアステレオマーへの誘導体化は、オート
サンプラのインジェクタプログラム機能を使うことで全自動化することが
でき、コアシェル充塡剤の使用により良好な分離が得られました。
この手法を食品中のアミノ酸の光学分割に適用し、アミノ酸のキラル
分離を簡便かつ高感度に行えることがわかりました。
Key Words: アミノ酸、キラル分離、プレカラム誘導体化、食品
***************************
1. はじめに
D-アミノ酸は、その生理機能や食品における呈味成
分などとして注目されています
1)。HPLC
によるアミノ
酸のキラル分離は、主にキラル固定相を用いる方法と、
アミノ酸のジアステレオマーを生成させそれを逆相分
離する方法により行われていますが
2), 3)、多種類のア
2) 分析条件
カラム：Poroshell HPH-C18, 3.0 x 150 mm, 2.7 m
（693975-502）
移動相：A; 50mM 酢酸ナトリウム (pH 6)
B; アセトニトリル/メタノール/水＝5/5/1
ミノ酸を同時に光学分割するには、ジアステレオマー
流量：0.7 mL/min
を逆相分離する方法が有利です。最近では UHPLC
グラジエント： 4% B(0 min) → 4%B(2 min)
やコアシェル型充塡剤の利用により、多成分を精度良
→ 10 %B（4 min) → 20%B(15 min)
く短時間で分析することが可能となっています。
→ 35%B(27 min) → 50%B(35 min)
本アプリケーションノートでは、コアシェル型充塡剤
→ 100%B(37 min)
による分離能と分析速度の向上、およびオートサンプ
カラム温度：30 ℃
ラを用いたジアステレオマー形成‐蛍光誘導体化の自
検出：FLD, Ex.; 230 nm、Em:460 nm
動化を検討し、食品中のアミノ酸のキラル分離に適用
サンプル注入：インジェクタプログラム（表 1 参照）
した結果をご紹介します。
誘導体化試薬：260 mM N -isobutyryl-L-cysteine
+ 170 mM OPA / ホウ酸緩衝液 (pH 10, 5061-
2. 実験条件
3339)。誘導体化の反応式を図 4 に示します
1) 装置：Agilent 1290 Infinity Ⅱ LC
G7120A（ハイスピードポンプ）
G7167B（マルチサンプラ）
3. 結果および考察
10 pmol/L 標準溶液と食酢のクロマトグラムを、そ
G7116B （カラムコンパートメント）
れぞれ図 1-3 に示します。食酢は精製水で 100 倍
G1321B（3D 蛍光検出器）
希釈し 0.22 m のメンブレンフィルターでろ過し、サン
OpenLAB CDS ChemStation（データ処理）
プルとしました。
2.5
0
0
5
10
15
20
20
25
25
図 3 バルサミコ酢（100 倍希釈）のクロマトグラム
30
30
D-Leu
L-Lys
15
D-Leu
D-Ile
L-Ile
D-Met
L-Met
D-Tyr
L-Tyr
L-Lys
L-Trp
L-Phe
D-Ala
L-Leu
L-Val
L-Ala
25
L-Leu
D-Ile
10
L-Arg
L-Lys
D-Lys
D-Ile
D-Leu
L-Leu
D-Val
D-Met
L-Trp
L-Ile
L-Phe
D-Phe
L-Val
L-Met
D-Tyr
L-Tyr
D-Ala
L-Glu
L-Asn D-Glu
D-Asn L-Ser
D-Ser
L-Gln
D-Gln
L-His
L-Thr
D-His
Gly
D-Thr
L-Arg
D-Arg
L-Ala
L-Asp
D-Asp
D-Trp
4
L-Ile
L-Phe
5
20
L-Val
L-Met
5
Gly
12.5
L-Tyr
D-Tyr
10
L-Arg
0
15
D-Ala
7.5
L-Ala
0
10
L-His L-Thr
D-His
7.5
L-Ser
5
D-Asn
D-Ser
L-Gln
L-Glu
0
D-Glu
L-Asn
10
L-Asp
2
D-Arg
2.5
D-Asp
3
L-Glu
D-Glu
L-Asn
L-Ser
D-Asn
D-Ser
D-Gln
L-His
L-Thr
Gly
L-Asp
D-Asp
LU
5
1
0
30
min
図 1 標準溶液（10 pmol/L）のクロマトグラム
LU
20
17.5
15
min
図 2 黒酢（100 倍希釈）のクロマトグラム
LU
20
17.5
15
12.5
5
min
4. まとめ
表 1 インジェクタプログラム
1
ニードルをウォッシュポートで洗浄
1290 Infinity Ⅱ LC システムを用いて、アミノ酸を
2
ホウ酸緩衝液（pH 10）を 2.5 L 吸引
蛍光検出可能なジアステレオマーに誘導体化しアミノ
3
サンプルを 0.5 L 吸引
酸のキラル分離を行いました。
4
ニードルをウォッシュポートで洗浄
5
混合（3.0 L x10 回）
オマー形成と蛍光誘導体化を同時に全自動で簡便に
6
0.5 分待機
精度良く行うことができました。また、コアシェル型充塡
7
誘導体化試薬を 0.25 L 吸引
剤の Poroshell HPH カラムの採用により、多数のピ
8
混合（3.25 L x 20 回）
ークを短時間で良好に分離することができました。
9
0.5 分待機
インジェクタプログラムの利用によって、ジアステレ
10
0.1%酢酸を 15.0 L 吸引
参考
11
混合（20.0 L x 10 回）
1.Y. Inoue, Y. Okabe, R. Suzuki, T. Onaka, T. Kida,
12
0.1 分待機
13
注入
14
0.5 分待機
15
インジェクタバルブをバイパス
Trace Nutrients Research, 31, 59 (2013).
2. I. Ilisz, A. Aranyi, Z. Pataj, A. Péter,, J. Pharm.
Biomed. Anal., 69, 28 (2012).
3.H. Brickner , M. Langer, M. Lfipke, T.
Westhauser, H. Godel, J. Chromatogra. A, 697,
229 (1995).
COOH
O
CHO
+
CHO
H3 C
SH
NH
H3C
H
R
C
COOH
NH 2
COOH
(H 3 C) 2COCHN
(H 3 C) 2COCHN
H
C
S
COOH
CH 2
N
COOH
C
R
H
H
C
S
CH 2
N
H
C
COOH
R
図 4 ジアステレオマー形成と OPA 誘導体化
【LC-201607KG-001】
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