晶析性タグを用いた多段階高速化学プロセス

晶析性タグを用いた
多段階高速化学プロセス
東京農工大学
大学院連合農学研究科
応用生命科学専攻
教授
千葉一裕
化学合成操作の簡易化、自動化
平易な操作で生成物を反応溶液から分離できる。
反応毎のクロマト分離をできる限り行わない。
触媒、試薬溶液が再利用できる。
多段階反応に対応できる。
並列反応に対応できる。
高極性溶媒、高沸点溶媒の使用量をできる限り削減する。
ベンゼン、塩素系溶媒の使用量をできる限り削減する。
従来の反応条件（溶媒、試薬など）を大きく変えない。
特殊な溶媒を使用しない。
反応効率は従来法と同等、または優れている。
容積効率が高い。
相溶多相溶液の温度特性
monophasic
biphasic
cyclohexane etc.
PN (propionitrile)
0℃
DMAc (dimethylacetamide)
NE (nitroethane)
DMI (dimethylimidazolidinone)
MeOH or 95%EtOH
25℃
35℃
Cooling
25℃
40 ℃
DMF (dimethylformamide)
AN (acetonitrile)
NM (nitromethane)
80 ℃
K. Chiba, Y. Kono, S. Kim, K. Nishimoto, Y. Kitano, M. Tada, Chem. Commun., 2002, 1766-1767.
原料
（低極性）
／シクロヘキサン
生成物（疎水性）
／メチルシクロヘキサン
原料(高極性）
／ニトロアルカン
冷却
加温
不要物など
相溶二相系を用いた自動合成装置の基本概念
分析または
活性検定へ
生成物溶液
装置ニードル
分部
不要な薬品溶液
反応容器
原料
試薬の分注
加温
反応終了
反応開始
冷却
生成物相
の分離
晶析性タグの溶解度
O
OH
C17H35
O
O
O
O
O
O
C17H35
Solvent
O
O
C17H35
O CH
3
Solubility (mM)a
CH2Cl2
THF
cPen (sat.with DMF)
cHex (sat.with DMF)
MeOH
MeCN
aDetermined
O
199
166
321
167
1.6
2.0
by HPLC analysis.
cycloalkane
DMF
晶析性タグに結合した生成物のTLC追跡
OH
O
O
C17H35
O
O
O
O
O
C17H35
L-Pro-Fmoc
DIPCI, DMAP
O
O
O
C17H35
＞300 mM in cHex
cHex/DMF
O CH
3
O
O
Fmoc
N
晶析性タグに結合した生成物のTLC追跡
O
O
Fmoc
N
O
DBU
cHex/DMF
O
O
H
N
O
BzCl, Et3N
cHex/DMF
O
N
ペプチド合成例
C17H35OCO
O
C17H35OCO
C17H35OCO
O
O
O
＝
OH
OH
OMe
1) DIC, HOBt, Fmoc-AA-OH(1.2 eq)
OH
2) 5% DBU/DMF
R1
O
O
O
N
H
R3
H
N
R2
O
N
H
Entry
Product
Yield(%)
1
Phe-Pro-Ile-Fmoc
88
2
Phe-Ala-Ile-Fmoc
81
3
(3-Pyr-Gly)-(4-Cl-Phe)-(Naph-Gly)-Fmoc 75
4
Phe-Pro-Ile-Phe-Tyr-Fmoc
63
Fmoc
Partition ratio of hydrophobic oligosaccharide to
MCH/MeCN/EtCN 50/25/25 (v/v/v) in biphasic solution
TBDPSO
TBDPSO
HO
C17H35OCO
C17H35OCO
C17H35OCO
O
BzO
BzO
O
OMe
1
O
BzO
O
C17H35OCO
C17H35OCO
C17H35OCO
OMe
3a
aTag
BzO
BzO
TBDPSO
O
O
BzO
BzO
BzO
BzO
BzO
O
BzO
O
BzO
O
C17H35OCO
C17H35OCO
C17H35OCO
OMe
O
O
BzO
BzO
4a
Compound
Phase-tag
contenta
Partition
ratiob
1
3a
4a
5a
80.8%
47.0%
36.8%
30.2%
96%
98%
88%
71%
O
O
BzO
BzO
BzO
5a
content = phase-tag molecular weight/total molecular
weight ×100 (phase tag = 3 × C17H35CO). bDetermined by
HPLC analysis
O
O
BzO
O
C17H35OCO
C17H35OCO
C17H35OCO
OMe
両親媒性塩基の溶解度(25℃)
OC18H37
C18H37O
C18H37O
N
N
N
溶媒
溶解度(mM)
c-Hex
10.2
DMF
0.9
MeCN
0.4
c-Hex/DMF(10:1)
78.4
c-Hex/MeCN(10:1)
73.2
晶析性タグによる逆ミセル形成
ジケトピペラジン合成
O
O
O
O
N
Fmoc
NH
amphipathic base 3 mM
7 h, r.t.
NH
N
O
DKP
entry
solvent
conversion
(%)
1
DCM
72
2
c-Hex
69
3
DMF
69
4
MeCN
43
5
c-Hex/DMF
(10:1)
>99
6
c-Hex/MeOH
(10:1)
n.r.
7
c-Hex/MeCN
(10:1)
>99
逆ミセル反応場システム
O
O
O
O
高濃度高極性環境
O
O
相溶二相系マイクロウエーブ照射
5 nm
5 nm
極性溶媒使用量の削減
OC18H37
C18H37O
F
=
C18H37O
F
(HO)2B
Br
PdCl2(dppf)
O
O
O
K3PO4
DMF, cHex
O
convertion (%)
100
50
0/100 1/99
5/95
10/90
50/50 25/75
100/0
DMF/cHex
(v/v)
マイクロウェーブ照射反応への応用
F
Br
B(OH)2
Pd catalyst
RO
O
MCH/DMF (1/1,v/v)
microwave
F
R=3,4,5-tris-octadecyloxy benzyl
RO
O
Reaction time
16 h
conventional
heating
Recycle times
before
after
1
2
3
5 min
microwave
irradiation
Yield (%)
99
95
91
>99.92% of Pd was recovered from the DMF layer
by a single phase separation between cHex/DMF
C18H37O
C18H37O
OC18H37
C18H37O
a,b
O
O
OC18H37
O
C18H37O
NH
Fmoc
a
Entry
solvent
r.t.
1
DCM
85
88
40 ℃
O
a
NH
O
40 ℃ (MW)
2
cHex/DMF (10:1)
82
>99
82
3
cHex/MeCN (10:1)
86
84
87
4
cHex/DMF (100:1)
75
92
>99
5
cHex/MeCN (100:1)
91
96
91
83
>99
94
6
a
b
cHex
NH Fmoc
b
stirring 15 minutes
stirring 1 minutes
Reagents and conditions: (a) 5% DBU, cHex, r.t. stirring 1 h ; (b) Fmoc-Ile-OH 1.2 eq, HOBt 2 eq, DIPCI 5 eq,
MW irradiated at 40 ℃ for 15 min
マイクロウェーブ照射ペプチド合成
O
O
O
C17H35 O
O O
O
O
C17H35
O
O
O
O CH3
O
C17H35
O
N
O H
C17H35 O
Fmoc-Val-OH (1.2 eq.) O O
O O
WSCD/HCl (3.0 eq.)
HOBt (3.0 eq.)
C17H35
cHex/DMF (10:1)
Conventional heating: 40oC
Microwave heating:
O
O
O
O
O CH3
C17H35
30 min
50 min
84%
quant.
40oC < 1 min
(6W)
quant.
O
N
O HN Fmoc
従来法との比較
・固相合成法‥樹脂にアミノ酸を順次、結合させる方法
固相合成
分離精製
液相合成
○ （洗浄操作のみ）
× （要分離操作）
反応のモニタリング
△ （可能だがやや難）
○ （簡便である）
反応性
△ （悪い反応もある）
○ （良好）
△ （上げにくい）
○ （可能）
スケールの変化
反応
液相で行う
分離精製
洗浄操作のみ
｝
晶析
ペプチド合成法
after adsorption
before adsorption
溶媒組成
THF １ｍｌ
C18H37O
Added
acetonitrile
＝
溶媒組成
OC18H37
THF １ OC
ｍｌ18H37
acetonitrile ９ｍｌ
O
５ｍｇ
蛍光顕微鏡によるODSシリカの撮影写真
O
ロイシンエンケファリンの合成
固相吸着液相ペプチド合成法を用いて生理活性をもつペプチド
（ロイシンエンケファリン）を合成した
Deprotection step
R1
C CHN Fmoc
H
O
Condensation step
R1
C CH NH2
O
R1
C CH NH2
O
DBU (1.5%)
THF 5 ml
ODS silica
5 min
R1
R2
C CH N C CH N Fmoc
H O
H
O
Amino acid (2 eq.)
HBTU (2 eq.)
HOBt (2 eq.)
DIPEA (2 eq.)
THF 5 ml
ODS silica
Fmoc-Leu-OH (2 eq.)
DIPCI (3 eq.)
DMAP (0.1 eq)
CH2Cl2 r.t. 2h
1. deprotection
2. condensation
Fmoc-Gly-OH (2 eq.)
Leu NH Fmoc
Leu Phe Gly NH
2
1. deprotection
2. condensation
Fmoc-Phe-OH (2 eq.)
Fmoc
Leu Phe N
H
Fmoc
1
1. deprotection
2. condensation
Fmoc-Gly-OH (2 eq.)
Leu Phe Gly Gly NH Fmoc 1. deprotection
2. condensation
3
Boc-Tyr(Bzl)-OH (2 eq.)
Leu Phe Gly Gly Tyr(Bzl) N Boc
H
4
ロイシンエンケファリンの合成
Result of Leucine-enkepharine synthesis
Product
Reaction time [min]
Deprotection Condensation Conv.[%]
1
5
15
>99
2
5
15
>99
3
5
15
>99
4
5
15
>99
Recovery [%]
・全ての反応が短時間で終了
液相合成の長所を活用
・最終的な回収率が高い
固相合成法の簡便な分離精製が可能
92
晶析性タグの発色
C22H45O
OC22H45
・酸性条件で直ちに発色（紫色）
OH
検出濃度
1 μmol/ℓ
（1% TFA/DCM)
発色反応
C22H45O
OC22H45
acid
TLC/硫酸発色
C22H45O
H+
C22H45O
OC22H45
H+
OC22H45
OH
C22H45O
H+
C22H45O
+
OC22H45
MS calcd for C204H376O8
[M+H]+ 2955, found 2955
H
OC22H45
Calix[4]resorsinarene
最終産物の分離
化合物
化合
物
化
合
物
高速反応、高容積効率反応
低エネルギー反応
極性溶媒使用量の大幅削減
物
化合
疎水性
タグ
発色性
性
疎水
グ
タ
疎水
性
タグ
切断性
逆ミセル形成
疎
水
タ性
グ
化合物
疎水性
タグ
疎水性
タグ
化合物
標的物質の追跡
晶析性
分離、精製
順相ﾌﾗｯｼｭｸﾛﾏﾄの利用
TLC, TOF-MS
NMR分析
有機相溶二相
多様な溶媒環境を適用
従前の化学反応研究資産の利用
疎水性
タグ
化合物
溶液操作性
自動連続分離
ロボット合成
晶析出性タグの例
OH
OH
OH
OC22H45
C18H37O
OC18H37
OC18H37
OC22H45
C22H45O
O
OH
C17H35
O
O
O
O
O
C17H35
O
O
O
O
C17H35
O CH
3
OC22H45
ジペプチド自動合成への応用
OC22H45
C22H45O
O
O
R
H
N
H
想定される業界
• 想定されるユーザ
製薬メーカにおける薬剤の探索・合成研究
化学メーカにおける新規有機化合物の開発
バイオ産業におけるＤＮＡやポリペプチドの合成
• 想定される市場規模
合成プロセス市場
研究用合成試薬市場
5500億円
300億円
実用化に向けた課題
• 現在、10mer程度のペプチド合成について実証済
み。
• 今後、より高速、高純度、低コスト製造法について
実験データを取得し、化学プロセスに適用していく
場合の条件設定を行っていく。
本技術に関する知的財産権
• 発明の名称：晶析分離用担体及び化合物の分離方
法
• 出願番号：PCT/JP2006/306348
• 出願人：東京農工大学
• 発明者：千葉一裕
お問い合わせ先
東京農工大学
産官学連携コーディネーター保坂真一

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