THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY VOL. 287, NO. 15, pp. 11677–11688, April 6, 2012 Autophagy Promotes Intracellular Degradation of Type1 Collagen Induced by Transforming GrowthFactor(TGF)β1 オートファジーはTGF-β1に誘導されるⅠ型コラーゲンを分解する 2015.01.19 ゼミ M1 中山千華 腎線維症 ー慢性腎臓病の進行に伴う症状であり、腎臓における不可逆的な細胞外基質の蓄積 透析・臓器移植以外に現在有効な治療法はない TGF-β1(Transforming Growth Factor-β1) ー多様な働きを持つサイトカイン ・増殖や腫瘍形成に関わる Bierie, B., and Moses, H. L. (2006) Nat. Rev. Cancer 6 ・コラーゲンの合成を促進する Schmierer, B., and Hill, C. S. (2007)Nat. Rev. Molecular Cell Biology, 8 ・オートファジーを誘導する Ding, Y., et al.(2010)J. Biol. Chem. 285 Gregor M.Bran. et al. (2010)Anticancer Research 細胞内におけるタンパク質の分解 ①ユビキチンープロテアソーム経路 ユビキチン分子が複数結合した標的タンパク質をプロテアソームが認識して分解する ②オートファジー経路 Singh, R. (2011). Aging (Albany NY), 3(10), 934. 本実験の背景と目的 ●TGF-β1がコラーゲン産生を促進し、腎線維症を引き起こす Sharma,K.,andZiyadeh,F.N.(1995)Diabetes44 ●分子シャペロン欠損細胞ではⅠ型コラーゲンの立体構造の形成が不完全となり、 オートファジー経路を介した細胞内分解の標的となる Ishida, Y., et al.(2009)Mol.Biol.Cell20 ●TGF-β1がオートファジーを誘導する Ding, Y., et al.(2010) J. Biol. Chem. 285 ⇩ 筆者らは、腎線維症の治療法解明のためにⅠ型コラーゲン蓄積量の調節における オートファジーの役割を検証した。 Fig①beclin 1 +/-マウスではコラーゲンが蓄積される 腎臓組織切片を A マッソントリクローム法で染色 (筋線維=赤、コラーゲン=青、核=紫) B ウエスタンブロット 100 µm 100 µm Fig②培養細胞での確認 A MMCをTGF-β1(2 ng/mL)で刺激(0~24h)→ウエスタンブロット B siRNAによりノックダウン→TGF-β1(2 ng/mL)で刺激→ウエスタンブロット Fig③オートファジー経路の阻害によりコラーゲンの分解が抑制される TGF-β1(2 ng/mL), Baf A1(10 nM), MG132(10 µM) ↓24h A ウエスタンブロット B PCR BafA1(bafilomycin A1)：オートリソソーム形成阻害剤 MG132：ユビキチン‐プロテアソーム経路阻害剤 GFP-LC3トランスジェニックマウス由来MMCを播種 ↓24h TGF-β1(2 ng/mL), Baf A1(10 nM), MG132(10 µM) ↓24h 蛍光免疫染色 Fig④TGF-β1に誘導されるⅠ型コラーゲンはオートファジーの活性化によって減少する ＊TFP処理の条件検討 TFP 処理→A・Bウエスタンブロット TFP(20 μM) or/and TGF-β1(2 ng/mL) 24h処理→C 蛍光顕微鏡によりGFP-LC3を観察 TFP：オートファジー活性剤 Fig④TGF-β1に誘導されるⅠ型コラーゲンはオートファジーの活性化によって減少する ＊TFP処理により誘導されるオートファジーはⅠ型コラーゲンの分解を促進するか検討した TFP(20 μM) or/and TGF-β1(2 ng/mL) 24h処理→D：ウエスタンブロット、E ：PCR Fig⑤COはオートファジーを誘導する ウエスタンブロット A 大気 or CO(1・3d)に曝したマウスから単離した腎臓組織 B 大気 or CO(0 – 24h)に曝したMMC Fig⑥COに誘導されたオートファジーがⅠ型コラーゲンの蓄積に与える影響 ウエスタンブロット A CORM-2(0~20 µM) 24h処理 B CORM-2(10 µM)、TGF-β1(2 ng/mL) 24h処理 C CORM-2(10 µM)、BafA1 (10 nM) 24h処理 Fig⑦TGF-β1はTAK1－MKK3シグナル経路を介してオートファジーを誘導する A TGF-β1(2 ng/mL) 0-24 h処理→ウエスタンブロット B MKK3発現ベクター / TGF-β1(2 ng/mL) 24h処理→ウエスタンブロット C TGF-β1(2 ng/mL) 24 h処理→蛍光顕微鏡によりGFP-LC3を観察 Fig⑧オートファジーは凝集したコラーゲンを分解する A 野生型のマウス由来MMCをウエスタンブロット with or without DTT(100 mM) B ベクリン1欠損/野生型マウス由来MMCからタンパク質を抽出 →沈殿と上清に分けてウエスタンブロット 総括 ➣TGF-β1は相反する二つの性質をもつ ①Col-1合成促進 ②Col-1分解を誘導するオートファジー促進 ⇧ ・オートファジー阻害によるCol-1蓄積 （ベクリン1発現の抑制 / Baf A1処理） ・mRNA発現量に変化はない ⇩ ・オートファジー促進によるCol-1蓄積 （ TFP処理 / CO曝露） ▶TGF-βに誘導されるオートファジーのCol-1分解促進作用は、 腎線維症の治療に利用できる可能性がある
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