S1P

Sphingosine-1-phosphate Phosphatase 1 Regulates Keratinocyte Differentiation and
Epidermal Homeostasis
(2013)J.Biol.Chem.288,18381-18391
S1P ホスファターゼ1によりケラチノサイトの分化及び皮膚恒常性の制御
2015.10.29 M1 羅霄霖
スフィンゴシン-1-リン酸（S1P）
By medind.nic.in
スフィンゴシン-1-リン酸（S1P）
By jcs.biologists.org
ホスファターゼ
局在部位
S1P ホスファターゼ
SPPs
小胞体
脂質リン酸ホスファ
ターゼ
LPPs
形質膜
基質
S1P
ジヒドロ-S1P
フィト-S1P
S1P
セラミド-1-リン酸
リゾホスファチジン酸
ホスファチジン酸
SPP →SPP1 ①セラミドレベルを上昇させることにより、細胞アポートシス
②セラミドを小胞体膜からゴルジ体膜へ輸送の調節
③小胞体ストレスを誘導することにより、オートファジー
④S1Pレベルを上昇させることにより、動脈トーン
→SPP2 ①免疫応答により、増加
SPPs
?
生理機能
背景と目的
S1Pがケラチノサイトの細胞機能を調節するとのシグナル特性をもつことが報
告されている。
そこで本研究では、SPP1の遺伝子（sgpp1）の欠損により、S1Pのレベルが増
加することで、ケラチノサイトに与える影響の解明を目指した。
Sgpp1ノックアウトマウスの作製
ターゲテイングベクターをES細胞に導入
↓
相同組換えが起きた細胞を選択
↓
この細胞を胚盤胞にインジェクション
↓
胚盤胞をC57BL6マウスの子宮に移植
↓
キメラマウスを取得
↓
キメラ＋野生型(sgpp1+/+)
↓
ヘテロ＋ヘテロ(sgpp1+/-)
↓
ノックアウトマウス(sgpp1-/-)
Sgpp1ノックアウトマウスの作製
(2-day-old/adult)Sgpp1+/+(WT)と-/-(KO)マウス→半定量RT-PCR
ターゲテイングベクターを導入したことにより、sgpp1の対立遺伝子が無効化された。
Sgpp1ノックアウトマウスの作製
(adult)WTとKOマウス→RT-qPCR
Sgpp1遺伝子を完全にノックアウトされた。
Sgpp1欠損により新生マウスの致死及び皮膚異常
ヘテロマウスを交配させ→生後何日間及び三週間後で遺伝子型決定
182匹新生マウスの中で
Sgpp1+/+
Sgpp1+/-
Sgpp1-/-
26%
51%
23%
三週間後、sgpp1-/-マウスの割合が3.5%になった。
Sgpp1の欠損は新生マウスに対して致死性があることが明らかにした。
Sgpp1欠損により新生マウスの致死及び皮膚異常
C,D,E (2-day)マウスのSC -eosin,SL-hematoxylinで染色
Sgpp1遺伝子のノックダウンにより、新生マウスにおける表皮異常を引き起こした。
表皮におけるsgpp1の発現
(2-day)sgpp1+/-とWTマウスの背部表皮→X galの発色
表皮ケラチノサイトの分化とともに、sgpp1遺伝子の発現量を上昇させた。
皮膚バリア機能
トルイジンブルー染色によりWTとKOマウスの表皮透過性を評価する
新生KOマウスのバリア機能が局部に異常だった。
表皮のスフィンゴ脂質レベル
(1-to2-day)WTとKOマウスの表皮→HPLC-MSでスフィンゴ脂質を定量分析した
表皮のスフィンゴ脂質レベル
KOマウス表皮において、C26-CERのレベルが減少した。
ケラチノサイトの増殖及び分化
(2-day)WTとKOマウス
背部皮膚＋抗体
↓
インキュベーター
↓
顕微鏡
Sgpp1欠損により、新生マウスの表皮細胞増殖が過剰し、分化が異常だった。
成年KOマウスにおける魚鱗癬類似表現型
B,C 成年WTとKOマウスの
背部皮膚を染色
D-K
背部皮膚＋抗体
↓
インキュベーター
↓
顕微鏡
成年KOマウスにおいて、魚
鱗癬に類似する表現型が
あった。
ケラチノサイトに与える影響（in vitro）
Sgpp1+/+&-/-ケラチノサイト（low Ca 2+）→三、四日間後、HPLC-MS
Sgpp1-/-ケラチノサイトにおいて、S1Pのレベルが有意に増加した。
ケラチノサイトに与える影響（in vitro）
Sgpp1-/-ケラチノサイトにおいて、C14,18,22,24:1-CERsレベルが有意に減少した。
ケラチノサイトに与える影響（in vitro）
Sgpp1+/+&-/-ケラチノサイト→マイクロアレイ
ケラチノサイトに与える影響（in vitro）
マイクロアレイ→RT-qPCR
ケラチノサイトにおいて、sgpp1の欠損
が分化関連遺伝子の過剰発現の内因
性原因となった。
ケラチノサイトに与える影響（in vitro）
Sgpp1+/+ケラチノサイトに10-7M S1P添加→RT-qPCR
KOマウス由来ケラチノサイトにおいて、Sgpp1ノックアウト→S1Pレベルの上昇→過剰分化を引き起こした。
ケラチノサイトに与える影響（in vitro）
B HEK293 細胞＋C-DMEM →incubate 60min→顕微鏡
C HEK293 細胞＋10-7M S1P
添加された 10-7MS1PがS1Pレセプターに結合して細胞内に取り込まれた。
ケラチノサイトに与える影響（in vitro）
D sgpp1+/+ケラチノサイトの５日間培養培地
E sgpp1-/-ケラチノサイトの５日間培養培地
＋HEK293細胞→incubate 60min→顕微鏡
ケラチノサイト培養中のS1PがS1Pレセプターの内部化をさせなかった。
表皮におけるCa 2+レベル
(4-day)WTとKOマウスの皮膚をcalcium green-1で染色→蛍光顕微鏡
sgpp1のノックアウトにより、Ca 2+レベルが上昇した。
まとめ
Supplementary
figures

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