Aptamer-vermitteltes drug delivery

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Molekulare Werkzeuge
Aptamer-vermitteltes drug delivery
EILEEN MAGBANUA, ULRICH HAHN
FACHBEREICH CHEMIE, INSTITUT FÜR BIOCHEMIE UND MOLEKULARBIOLOGIE, UNIVERSITÄT HAMBURG
Aptamers are multifunctional tools relatively easy to generate and modify
thus allowing a broad application spectrum. Highly specific for tumor
markers or receptors aptamers are able to discriminate between healthy
and malignant cells and furthermore may serve as vehicles for directed
drug or therapeutic agents’ delivery.
DOI: 10.1007/S12268-016-0702-3
© Springer-Verlag 2016
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ó Als Aptamere werden üblicherweise kurze Nukleinsäuren bezeichnet (< 100 Nukleotide), die spezifisch und hochaffin Zielmoleküle binden. In neuerer Zeit werden auch spezielle kurze Peptide in den Kreis der Aptamere mit einbezogen. Durch intramolekulare
Interaktionen innerhalb eines Nukleinsäurestrangs wird eine dreidimensionale Struktur ausgebildet, die nicht nur durch herkömmliche Watson-Crick-, sondern auch
durch Hoogsteen-Basenpaarungen (Abb. 1A)
in Kombination mit Stapelwechselwirkungen
entstehen können. Dadurch bilden sich hoch
komplexe Tertiärstrukturen wie Guanin-Quadruplexe, mehrsträngige Helices oder auch
koaxiale Stapel aus, die durch komplexierte
Kationen stabilisiert werden können. Diese
Strukturen ermöglichen die affine Wechselwirkung eines Aptamers mit Targets wie
molekularen Bausteinen, Proteinen (Abb. 1B),
Mikroorganismen oder ganzen Zellen. Trotz
ihrer ausgeprägten Struktur müssen vor
allem RNA-Aptamere vor Degradation
geschützt werden. Die 2’-Hydroxylgruppe der
Ribose kann dazu durch Fluor, Methoxy-,
O-Methoxyethyl- oder eine Aminogruppe substituiert werden. Im Vergleich zu DNA ist RNA
strukturell flexibler und kann dadurch mehr
tertiäre Strukturen einnehmen. Das Kettenrückgrat kann durch Einbau von „verriegelten“ Nukleinsäuren (locked nucleic acid, LNA,
Brücke zwischen 2’-O und 4’-C), L-Nukleinsäuren (Spiegelmere) oder Phosphothioaten
stabil modifiziert werden. Um eine längere
Bioverfügbarkeit zu gewährleisten, kann der
renalen Clearance durch Fusion mit kleinen
Molekülen wie Cholesterol oder Polyethylenglykol entgegengewirkt werden.
Selektion von Aptameren
˚ Abb. 1: Durch Basenpaarungen können Aptamere hoch komplexe Tertiärstrukturen ausbilden,
die eine affine Wechselwirkung mit Targets ermöglichen. A, verschiedene Wasserstoffbrückenbindungstypen in Nukleinsäuren. Bei der Standard-DNA- oder RNA-Doppelhelix werden die Stränge
über Watson-Crick-Basenpaarungen per Wasserstoffbrückenbindungen (rot) zusammengehalten
(in der DNA wird Uracil durch Thymin [grün] ersetzt). Darüber hinaus stellen Hoogsteen-Basenpaarungen (blau) ebenfalls ein wichtiges Struktur-stabilisierendes Element dar. Die Schlangenlinien symbolisieren die Bindungen zum Ribose-Phosphat-Rückgrat. B, Komplex eines Aptamers
(rot) mit der G-Protein-gekoppelten Rezeptorkinase 2 (grau; Quelle: PDB-ID: 3UZT).
Aptamere werden in vitro in einem als SELEX
(systematische Evolution von Liganden durch
exponentielle Anreicherung) bezeichneten
Prozess selektiert [1, 2]. Die konventionelle
SELEX-Methode (Abb. 2A) besteht grundlegend aus drei Schritten: (1) Inkubation einer
Oligonukleotid-Bibliothek mit einem gewählten Target, (2) Separation der gebundenen
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˚ Abb. 2: SELEX (systematische Evolution von Liganden durch exponentielle Anreicherung) und die Variante Zell-SELEX. A, SELEX. Ausgangsmaterial ist eine randomisierte Oligonukleotid-Bibliothek. Diese besteht aus bis zu 1015 individuellen Molekülen, die eine zentrale randomisierte Region zwischen zwei Abschnitten mit vorgegebener Sequenz aufweisen, welche eine Primerbindung bei der PCR-Amplifikation ermöglichen. Target-bindende
Aptamere werden in mehreren aufeinanderfolgenden SELEX-Runden angereichert, wobei
der kritische Schritt – die Selektion von Bindern – mit unterschiedlichen Methoden erfolgen kann. B, Zell-SELEX. Target sind hier ganze Zellen, die ein ausgewähltes Zielmolekül auf
ihrer Oberfläche präsentieren. Hier werden zwei Selektionsschritte vorgenommen: eine
Prä-Selektion mit Zellen, die das Zielmolekül nicht tragen (z. B. nach einem siRNA-vermittelten Knock-down), und dann die eigentliche Selektion mit Zellen, die das Zielmolekül
präsentieren, und einer durch die Prä-Selektion „filtrierten“ Oligonukleotid-Bibliothek.
Wenn die Oligonukleotide fluoreszenzmarkiert sind, ermöglicht das eine Selektion mittels
FACS (fluorescence activated cell sorter).
von nicht-gebundenen Nukleinsäuren und
(3) Amplifikation der Binder, gefolgt von
einer erneuten Inkubation mit dem Target. Diesem iterativen Prozess folgen die
Klonierung der Aptamere sowie deren
Charakterisierung. Im Folgenden wird hier
auf Zell-SELEX eingegangen – eine Metho-
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de, die sich zur Selektion von zellspezifischen Aptameren eignet.
Mittels Zell-SELEX wurden bereits Aptamere mit Spezifität für diverse Krebs- und
Bakterienzellen selektiert. Für diese
SELEX-Variante (Abb. 2B) sind nicht zwingend Kenntnisse über das Zielmolekül
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˚ Abb. 3: Aptamer-vermitteltes drug delivery. Chlorin e6 (c-e6), ein in der photodynamischen
Therapie eingesetztes Agens, wurde an ein Interleukin-6-Rezeptor(IL-6R)-spezifisches Aptamer
(blau) gekoppelt und zu Zellen gegeben, die IL-6R auf ihrer Oberfläche präsentieren. Das Aptamer
wurde mit dem Rezeptor internalisiert. Bestrahlung der Zellen mit Licht entsprechender Wellenlänge führte zu einer Erniedrigung der Zellvitalität und Erhöhung der Apoptose. Die Inkubation der
Zellen mit Aptameren, in die das Krebs-Chemotherapeutikum 5-FUdR (5-Fluor-2’-desoxyuridin)
„eingebaut“ worden war, führte auch zu einer verminderten Proliferationsrate; das Aptamer wurde
internalisiert, wahrscheinlich lysosomal abgebaut, das entstandene 5-FUdR per Nukleosidtransporter ins Zytosol transferiert und zu FdUMP phosphoryliert, einem potenten Inhibitor der Thymidylatsynthase, welche wiederum ein wichtiges Enzym für die DNA-Biosynthese darstellt [4, 5].
erforderlich. Es werden anstelle eines isolierten Target-Moleküls ganze Zellen (von Prooder Eukaryoten) mit der OligonukleotidBibliothek inkubiert und Binder von NichtBindern separiert [3]. Zur Erhöhung der Zellspezifität wird eine Prä- oder Gegenselektion
(counter selection) durchgeführt, in der die
Oligonukleotide zunächst mit Zellen inkubiert werden, die sich von den Zielzellen
dahingehend unterscheiden, dass sie nur das
Target nicht (hervorgerufen z. B. durch silencing des entsprechenden Gens), ansonsten
aber alle anderen Oberflächenbestandteile
tragen. Die nicht-bindenden Oligonukleotide
werden dann im anschließenden eigentlichen
Selektionsprozess weiter verwendet. Zusätzliche Vorteile gegenüber der konventionellen
SELEX sind, dass auch Targets angegangen
werden können, die nicht löslich produziert
werden können, sowie die Möglichkeit, Zielmoleküle in ihrer natürlichen Umgebung oder
auch in Assoziation mit Liganden anzuvisieren.
Zielmoleküle auf der Zelloberfläche
Rezeptoren stellen klassische drug de li very-Targets auf Zelloberflächen dar. Im
Rahmen zellulärer Prozesse unterstehen
Rezeptoren regulären Recyclingprozessen,
mit denen gebundene Aptamere sowie daran gekoppelte Wirkstoffe ins Zellinnere
gelangen können. Zwei konkrete Beispiele
aus unserem Labor sind in Abbildung 3
skizziert [4, 5]. Hier wurde einmal das in
der photodynamischen Therapie eingesetzte Agens Chlorin e6 (c-e6) an ein Interleukin-6-Rezeptor(IL-6R)-spezifisches Aptamer
gekoppelt und mit IL-6R-präsentierenden
Zellen inkubiert. Nach Inkorporation des
derivatisierten Aptamers führte Bestrahlung
mit Licht der geeigneten Wellenlänge zu
einer signifikanten Erniedrigung der Zellvitalität und Erhöhung der Apoptose. Im anderen Fall wurde das Krebs-Chemotherapeutikum 5-FUdR in das IL-6R-spezifische Aptamer direkt eingebaut. Auch hier sank bei
entsprechenden Zellen nach Applikation des
„FdU-Aptamers“ die Proliferationsrate signifikant.
Prinzipiell eignen sich alle Rezeptoren als
Target für das Aptamer-vermittelte drug delivery, um jedoch eine gewisse Zellspezifität zu
erzielen, sind Rezeptoren, die mit bestimmten
Organen, Geweben oder malignen Zellen assoziiert sind, die erste Wahl. Darüber hinaus
sind bisher wenige Rezeptoren bekannt, die
eine einfache Rezeptor-vermittelte Internalisierung ermöglichen, wie z. B. Transferrinrezeptor, EGFR (epidermal growth factor receptor), VEGFR (vascular endothelial growth factor receptor), CD4-Rezeptor, HIV-1 gp120 und
Tyrosinkinase-7-Rezeptor. Überdies eignen
sich für das drug delivery Zielproteine (z. B.
Nukleolin, Tenascin-C) oder Tumorantigene
(z. B. prostataspezifisches Antigen, Mucin-1),
die auf malignen Zellen signifikant überproduziert werden.
Eine interessante diesbezügliche Variante,
die nicht nur auf Zellspezifität zielt, sondern
auch den erfolgreichen Membrantransport
einbezieht, ist die ZellinternalisierungsSELEX. Dabei wird die Oligonukleotid-Bibliothek mit ausgewählten Zellen inkubiert,
Nicht-Binder und nicht-internalisierte Oligonukleotide werden entfernt, die internalisierte
RNA isoliert, amplifiziert und mittels Hochdurchsatzsequenzierung detektiert [6]. Das
so identifizierte Aptamer kann im Anschluss
post-selektiv z. B. an ein Therapeutikum
gekoppelt und als drug delivery-Vehikel verwendet werden.
Rezeptor-vermittelte Aufnahme und
Freisetzung aus dem Endosom
Nicht jedes Target eignet sich gleichermaßen
für ein RNA-vermitteltes drug delivery. Rezeptoren unterliegen zwar alle mehr oder weniger Internalisierungsprozessen, diese bedingen aber nicht gleichzeitig den Transport
eines Aptamers und des daran gekoppelten
Wirkstoffs in das Zytosol.
Signalling-Rezeptoren werden beispielsweise über intraluminale Vesikel internalisiert und schließlich im Lysosom degradiert.
Andere Rezeptoren werden Clathrin-abhängig oder -unabhängig vesikuliert und gelangen in das frühe Endosomenkompartiment.
ATP-getriebene Protonenpumpen führen zu
einem aziden Lumen (pH 5,9–6,0) und zu
einer Dissoziation des mit dem Rezeptor assoziierten Liganden. Unter diesen Bedingungen
würde das gebundene Aptamer ebenfalls vom
Rezeptor dissoziieren. Der Rezeptor könnte
endozytotisch über drei Wege recycelt werden: (1) direkt vom frühen Endosom zurück
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zur Zelloberfläche, (2) über das endozytotische Recyclingkompartiment
(ERK) oder (3) über das trans-GolgiNetzwerk. Rezeptoren, die nicht recycelt werden, verblieben im frühen
Endosom, das erst zum späten Endosom heranreifen müsste, und würden
schließlich im Lysosom abgebaut, in
dem der gesamte lysosomale Inhalt
degradiert würde.
Wirkstoffe, die Rezeptor-vermittelt
mit einem Aptamer in die Zelle gelangen und nicht direkt im Endosom oder
Lysosom wirken, müssten aus dem
Endosom freigesetzt werden. Ansonsten würden die Wirkstoffe noch im
frühen Endosom vom Rezeptor dissoziieren und anschließend degradiert werden (weitere Details hierzu
siehe [7, 8]).
ó
Literatur
[1] Ellington AD, Szostak JW (1990) In vitro selection
of RNA molecules that bind specific ligands. Nature
346:818–822
[2] Tuerk C, Gold L (1990) Systematic evolution of
ligands by exponential enrichment: RNA ligands to
bacteriophage T4 DNA polymerase. Science
249:505–510
[3] Shangguan D, Li Y, Tang Z et al. (2006) Aptamers
evolved from live cells as effective molecular probes
for cancer study. Proc Natl Acad Sci USA
103:11838–11843
[4] Kruspe S, Hahn U (2014) An aptamer intrinsically comprising 5-fluoro-2’-deoxyuridine for targeted
chemotherapy. Angew Chem Int Ed Engl
53:10541–10544
[5] Kruspe S, Meyer C, Hahn U (2014) Chlorin e6
conjugated interleukin-6 receptor aptamers selectively kill target cells upon irradiation. Mol Ther Nucleic
Acids 3:e143
[6] Thiel WH, Bair T, Peek AS et al. (2012) Rapid
identification of cell-specific, internalizing RNA
aptamers with bioinformatics analyses of a cell-based
aptamer selection. PLoS One 7:e43836
[7] Maxfield FR, McGraw TE (2004) Endocytic recycling. Nat Rev Mol Cell Biol 5:121–132
[8] Grant BD, Donaldson JG (2009) Pathways and
mechanisms of endocytic recycling. Nat Rev Mol Cell
Biol 10:597–608
Korrespondenzadresse:
Prof. Dr. Ulrich Hahn
Universität Hamburg
Fakultät für Mathematik, Informatik &
Naturwissenschaften
Fachbereich Chemie
Institut für Biochemie & Molekularbiologie
Martin-Luther-King-Platz 6
D-20146 Hamburg
Tel.: 040-42838-2841
Fax: 040-42838-2848
[email protected]
AUTOREN
Eileen Magbanua
Jahrgang 1981. Biologiestudium an der Universität Hamburg. 2007 Diplomarbeit, 2007–2011 Promotion und 2012–2014 Postdoc am Institut
für Biochemie und Molekularbiologie bei Prof. Dr. U. Hahn, Universität
Hamburg.
Ulrich Hahn
Jahrgang 1950. Studium der Agrarwissenschaften und Biologie (Hauptfach Mikrobiologie), Universität Göttingen. 1980 Promotion am MaxPlanck-Institut für experimentelle Medizin, Göttingen. 1982 Akademischer Rat, FU Berlin. 1993 Hochschuldozent, Medizinische Universität
zu Lübeck. 1994 Professur für Allgemeine und Mikrobielle Biochemie,
Universität Leipzig. 2002 Professur für Biochemie und Molekularbiologie, Universität Hamburg.
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