「スギ花粉ペプチド含有米（キタアケ）」 の 供与核酸・調製等に関する情報 国立研究開発法人 農業・食品産業技術総合研究機構 目次 (1) 「スギ花粉ペプチド含有米」の宿主と導入遺伝子に関する情報 ................ 1 (2) 供与核酸に関する情報 ........................................................................... 2 ① 構成及び構成要素の由来 ................................................................... 2 ② 構成要素の機能 ................................................................................ 3 1) 目的遺伝子、発現調節領域、局在化シグナル、選抜マーカーその他の 供与核酸の構成要素それぞれの機能 ....................................................... 3 2) 目的遺伝子及び選抜マーカーの発現により産生される蛋白質の機能及び 当該蛋白質がアレルギー性 (食品としてのアレルギー性を除く) を有する ことが明らかとなっている蛋白質との相同性 .......................................... 4 (3) ベクターに関する情報 ........................................................................... 4 ① 名称及び由来 .......................................................................................... 4 ② 特性 ....................................................................................................... 5 1) ベクターの塩基数及び塩基配列 ......................................................... 5 2) 特定の機能を有する塩基配列がある場合はその機能 ........................... 5 3) ベクターの感染性の有無及び感染性を有する場合はその宿主域に関する 情報 ...................................................................................................... 5 (4) 遺伝子組換え生物等の調製方法............................................................... 5 ① 宿主内に移入された核酸全体の構成 ......................................................... 5 ② 宿主内に移入された核酸の移入方法 ......................................................... 5 ③ 核酸が移入された細胞の選抜の方法 ......................................................... 5 (5) 細胞内に移入した核酸の存在状態及び当該核酸による形質発現の安定性 .. 5 ① 移入された核酸の複製物が存在する場所 .................................................. 5 ② 移入された核酸の複製物のコピー数及び移入された核酸の複製物の複数世 代における伝達の安定性 .............................................................................. 5 1) 核酸のコピー数 ................................................................................ 5 2) 複数世代における遺伝の安定性 ......................................................... 6 ③ 染色体上に複数コピーが存在している場合は、それらが隣接しているか離 れているかの別 ............................................................................................ 6 ④ 導入遺伝子産物の自然条件下での個体間及び世代間での発現の安定性 ....... 6 参考文献 ...................................................................................................... 6 (1) 「スギ花粉ペプチド含有米」の宿主と導入遺伝子に関する情報 ス ギ花粉 ペプチ ド含有米 は、イ ネ品種 「キタア ケ」に スギ花 粉抗原の 複数 の エ ピ ト ー プを 連 結し た 7Crp 遺 伝 子を 導 入し て 作 製 した 。 図 1 a に 示 さ れる ように、スギ Cry j I の 3 箇所、スギ Cry j II の 4 箇所、計 7 箇所につい て、多くのヒトのスギ花粉アレルゲン特異的 T 細胞が認識する主要なエピト ープとして同定されてきた。スギ花粉ペプチド含有米には、これら 7 個のエ ピ ト ー プ を図 1 b のよ う に 連 結し た 7 連結 ペ プ チ ド (7Crp； 96 ア ミ ノ 酸の 長さ) に KDEL 配列を連結した 100 アミノ酸のペプチドをコードする遺伝子 が導入されている。7Crp は、KDEL 配列及びシグナルペプチドの働きにより、 小胞体由来の蛋白質顆粒 protein body I に蓄積する。 a. 212 (ペクテートリアーゼ） Cry jⅠ 224 235 247 1 312 2 330 3 花粉壁表層 N C (353a.a) Cry j Ⅱ N C (388a.a) （ポリメチルガラ クツロナーゼ） 澱粉粒 4 5 77 89 96 6 107 192 7 204 356 367 b. 7Crp（ヒト7連続Ｔ細胞エピトープ） N 4 1 6 7 2 3 100アミノ酸残基 5 C KDEL 図 1. ヒトの T 細胞が認識するスギ花粉アレルゲンの抗原決定基 (エピトープ) と、7Crp 中の 7 つのエピトープの配列順序 ま た、ス ギ花粉 ペプチド 含有米 には、 選抜マー カー遺 伝子と して、大 腸菌 由 来のハイグロマイシン耐性遺伝子 (hpt) が導入されている。 1 (2) 供与核酸に関する情報 ① 構成及び構成要素の由来 スギ花粉ペプチド含有米の作出に用いたプラスミドのマップを図 2 に、供 与核酸の構成及び構成要素の由来を表 1 に示した。 図 2. スギ花粉ペプチド含有米の作出に用いたプラスミド 表 1 スギ花粉ペプチド含有米の作出に用いたプラスミドの各構成要素の由来 及び機能 構成要素 サイズ (kb) 由来及び機能 7Crp 発現カセット イネ種子貯蔵蛋白質グルテリン GluB-1 をコー グルテリン GluB-1 2.3 kb プロモーター の胚乳組織特異的に発現を規定する。イネ由 来。 イ ネ 種 子 貯 蔵 蛋 白 質 グ ル テ リ ン GluB-1 の シ グ グルテリン GluB-1 ドする遺伝子のプロモーター配列。種子登熟期 0.072 kb シグナルペプチド ナルペプチド配列。グルテリン蛋白質の小胞体 膜内への輸送に関与する。イネ由来。 スギ花粉 Cry j I 及び Cry j II アレルゲン蛋白 7Crp (目的遺伝子) 0.288 kb 質遺伝子に由来し、ヒトのスギ花粉アレルゲン 特異的 T 細胞が認識する 7 箇所の配列を連結 させた人工ペプチドをコードする遺伝子。 2 KDEL 局在化 シグナル 0.012 kb グルテリン GluB-1 0.65 kb ターミネーター 導入遺伝子産物の小胞体への係留に関与するシ グナル配列。イネ由来。 グ ル テ リ ン GluB-1 遺 伝 子 の タ ー ミ ネ ー タ ー 。 転写終結を規定する。イネ由来。 ハイグロマイシン耐性発現カセット CaMV35S プロモーター hpt 恒常的発現プロモーター。下流につないだ遺伝 0.8 kb 子を植物体全体で発現させる。カリフラワーモ ザイクウイルスゲノム DNA 由来。 1.1 kb ハイグロマイシン耐性を付与する選抜マーカー 遺伝子。大腸菌由来。 ア グ ロ バ ク テ リ ウ ム Ti プ ラ ス ミ ド 上 の Ag7 Ag7 ターミネーター 0.3 kb 遺伝子のターミネーター。導入遺伝子の転写終 結 を 規 定 す る 。 ア グ ロ バ ク テ リ ウ ム Ti プ ラ ス ミド由来。 ② 構成要素の機能 1) 目的遺伝子、発現調節領域、局在化シグナル、選抜マーカーその他の供与核 酸の構成 要素それぞれの機能 ・ 7Crp 発現カセット GluB-1 プ ロ モ ー タ ー は 、 イ ネ 由 来 種 子 貯 蔵 蛋 白 質 グ ル テ リ ン の プ ロ モ ー タ ー で 、 DNA を 鋳 型に mRNA 合 成 を 開 始 す る DNA 上 の 特 定 の 塩 基 配 列 で あ る 。 種 子 登 熟 期 の 胚 乳 に 特 異 的 に 発 現 す る 。 GluB-1 シ グ ナ ル ペ プ チ ド は 、イ ネ由 来種 子貯 蔵蛋 白質 グル テリ ンの シグ ナル ペプ チド の塩 基配 列で あ る 。シ グナ ルペ プチ ドは 、合 成さ れた 蛋白 質の 小胞 体へ の付 着及 び膜 通過 の 先導役を努め、膜通過後にシグナルペプチターゼで切断される。 7Crp は、スギ花粉中の花粉症の原因となる抗原蛋白質 Cry j I 及び Cry j II に 含 ま れ 、 ヒ ト の ス ギ 花 粉 抗 原 特 異 的 T 細 胞 に よ り 認 識 され る ア ミ ノ 酸 配 列 (T 細 胞 エ ピ ト ー プ ) 部 分 を 発 現 さ せ る 塩 基 配 列 で あ る (図 1 参 照 )。 Cry j I から 3 箇所、Cry j II から 4 箇所の合計 7 箇所について、それぞ れ 12 か ら 19 個 の ア ミ ノ 酸 残 基 か ら な るヒ ト T 細 胞 エ ピ ト ープ が 同 定 さ れ て い る 。 こ の 7 箇所 の エ ピ ト ー プ (アミノ 酸 配 列 ) を 連 結さ せ、 96 ア ミ ノ酸残基からな る人工 ペプチド (7Crp) を発現させるため、 T 細胞エピトー プ の ア ミ ノ 酸 配 列 に 従 っ て 人 工 遺 伝 子 を 合 成 し た (図 1 参 照 )。 合成 の 際 、 イ ネ種 子の 主要 な貯 蔵蛋 白質 をコ ード する 遺伝 子群 の中 で使 用頻 度の 高い コ 3 ドンを選択した (Takagi et al., 2005a, 2005b)。 KDEL 配 列 は、 蛋 白質 を 小 胞 体 へ 局 在 化 さ せ る 役 割 を 果 た す 4 つ の ア ミ ノ 酸 の 塩 基 配 列 で あ り 、 C 末 端 に KDEL 配 列 (ア ミ ノ 酸 ) を 持 つ 蛋 白 質 は 小胞体に局在化する。 GluB-1 タ ー ミ ネ ー タ ー は 、 イ ネ 由 来 蛋 白 質 グ ル テ リ ン の タ ー ミ ネ ー タ ー で、mRNA の合成を終結させるのに必要な塩基配列である。 ・ ハイグロマイシン耐性発現カセット CaMV35S プロ モー ター は、 カリ フラ ワー モザ イク ウイ ルス 由来 のプ ロモ ー タ ー で 、 DNA を 鋳型 に mRNA 合 成 を 開 始 す る DNA 上 の 特 定 の 塩 基 配 列である。植物の全組織で発現する。 hpt は、大腸菌 K-12 株由来の遺伝子 で 、 抗 生 物 質 ハ イ グ ロ マ イ シ ン 耐 性 を 示 す 。 Ag7 タ ー ミ ネ ー タ ー は 、 Agrobacterium tumefaciens C58 株由来のターミネー ターで、mRNA の合 成を終結させるのに必要な塩基配列である。 2) 目的遺伝子及び選抜マーカーの発現により産生される蛋白質の機能及び当該 蛋 白 質 が ア レ ル ギ ー 性 (食 品 と し て の ア レ ルギ ー 性 を 除 く ) を 有 する こ と が 明らかとなっている蛋白質との相同性 ・ 7Crp ペプチド スギ花粉ペプチド含有米には、スギ花粉抗原であるスギ由来の Cry j I 及 び Cry j II 蛋白質の持つ主要なヒト T 細胞エピトープ配列のみを連結して 作製した 7Crp が蓄積している。7Crp は、Cry j I 及び Cry j II のヒト T 細 胞エ ピト ープ 部分 であ るが 、一 連の アレ ルギ ー反 応に 必要 とさ れる 抗原 特 異的 IgE 抗体との結合性はなく、B 細胞エピトープも含まない。 ・ hpt ハ イ グロ マイ シン をリン 酸 化さ せる 酵素 を産生 す る。 この 酵素 の働き に よ り ハイ グロ マイ シン がリ ン酸 化さ れ不 活化 する 。ハ イグ ロマ イシ ン耐 性酵 素 については、アレルゲン蛋白質との相同性は認められない。 (3) ベクターに関する情報 ① 名称及び由来 バ イ ナ リ ー ベ ク タ ー pGTV-35S-HPT を 基 に 構 築 さ れ た 。 詳 細 は 表 1 及 び 図 2 を参照。T-DNA 領域 (Right Border と Left Border との間) に選抜マ ーカー遺伝子である hpt 遺伝子及び 7Crp 遺伝子が挿入されている。 4 ② 特性 1) ベクターの塩基数及び塩基配列 スギ花粉ペプチド含有米の作出に用いたプラスミドの塩基数は13,900bps。 塩基配列等は文献 (Becker et al., 1992) を参照。 2) 特定の機能を有する塩基配列がある場合はその機能 薬剤耐性遺伝子としてハイグロマイシン耐性遺伝子 ( hpt ) と、 hpt 遺伝 子の発現調節因子としてカリフラワーモザイクウイルス由来の CaMV 35S プロモーター及び Agrobacterium tumefaciens C58 株由来の Ag7 ターミ ネーターが存在する。 3) ベクターの感染性の有無及び感染性を有する場合はその宿主域に関する情 報 ベクターの感染性は知られてない。 (4) 遺伝子組換え生物等の調製方法 ① 宿主内に移入された核酸全体の構成 宿主内に移入された核酸全体の構成は図 2 のとおりである。 ② 宿主内に移入された核酸の移入方法 アグロバクテリウム法によった。 ③ 核酸が移入された細胞の選抜の方法 目 的遺伝 子を導 入したア グロバ クテリ ウムをイ ネ種子 カルス に感染さ せ、 ハ イグロマイシン (50 mg/L) を含む選抜培地で核酸が移入された細胞を選抜した。 (5) 細胞内に移入した核酸の存在状態及び当該核酸による形質発現の安定性 ① 移入された核酸の複製物が存在する場所 ゲノム DNA を用いたサザンブロット解析により、移入した核酸は染色体上 に挿入されていること を確認した。また、世 代間でサザンブロット 解析のバン ドパターンが一致して いた事から、移入した 核酸は染色体上に存在 すると判断 した。 ② 移入された核酸の複製物のコピー数及び移入された核酸の複製物の複数世代 における伝達の安定性 1) 核酸のコピー数 T 2 及 び T 5 世 代 の ゲ ノ ム DNA の サ ザ ン ブ ロ ッ ト 解 析 に よ り 、 7Crp、 5 hpt 遺伝子ともにゲノム上に安定に保持され、コピー数は 4 と推定した。 2) 複数世代における遺伝の安定性 T 1 ～ T 4 世 代 の PCR 解 析の 結果 、並 びに 、T 2 、 T 5 及 び T 7 世代の ゲ ノ ム DNA のサザンブロット解析の結果、各世代で安定して遺伝子が保持され ていた。 ③ 染色体上に複数コピーが存在している場合は、それらが隣接しているか離れ ているかの別 サザンブロット解析の結果、導入されたカセットは 4 コピーであるが、そ れぞれ 4 コピーのうち 2 コピーずつ遺伝子は隣接して位置していた。導入箇 所は 2 箇所、すなわち 2 遺伝子座と推定した。 ④ 導入遺伝子産物の自然条件下での個体間及び世代間での発現の安定性 閉鎖系で採種した T2 ～T4 種子、非閉鎖系温室で採種した T5 種子及び隔 離ほ場で採種した T8 種子についてウエスタンブロット解析を行った結果、 7Crp の安定した発現が確認された。 参考文献 Becker, D., Kemper, E., Schell, J. and Masterson, R. (1992) New plant binary vectors with selectable markers located proximal to the left TDNA border. Plant Mol. Biol. 20, 1195-1197. Takagi, H., Saito, S., Yang, L., Nagasaka, S., Nishizawa, N. and Takaiwa, F. (2005a) Oral immunotherapy against a pollen allergy using a seedbased peptide vaccine. Plant Biotech. J. 3, 521-533. Takagi, H., Hiroi, T., Yang, L., Tada, Y., Yuki, Y., Takamura, K., Ishimitsu, R., Kawauchi, H., Kiyono, H. and Takaiwa, F. (2005b) A rice-based edible vaccine expressionf multiple T cell epitopes induces oral tolerance for inhibition of Th2-mediated IgE responses. PNAS 102, 17525-17530. 6
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