HER2 CISH pharmDx™ Kit
Code SK109
2nd edition/ 2
ème
édition/ 2. Ausgabe
HER2 CISH pharmDx™ Kit is a direct dual-color chromogenic in situ hybridization (CISH)
assay designed to quantitatively determine HER2 gene amplification in formalin-fixed, paraffinembedded (FFPE) breast cancer tissue specimens. HER2 CISH pharmDx™ Kit generates red
(HER2) and blue (CEN-17) chromogenic signals on the same tissue section for evaluation by
bright field microscopy.
The kit contains reagents sufficient for 20 tests.
Le kit HER2 CISH pharmDx™ est un test d’hybridation in situ chromogénique (CISH)
double couleur direct conçu pour déterminer de manière quantitative l’amplification du gène
HER2 dans des échantillons de tissus de cancer du sein fixés au formol et inclus en paraffine.
Le kit HER2 CISH pharmDx™ génère des signaux chromogéniques rouges (HER2) et bleus
(CEN-17) sur la même coupe de tissus qui seront évalués au microscope optique.
Les réactifs contenus dans ce kit permettent d’effectuer 20 tests.
Das HER2 CISH pharmDx™-Kit wurde als direkter Test für zweifarbige Chromogen-in-situHybridisierung (CISH) zur quantitativen Bestimmung der HER2-Genamplifikation in
formalinfixierten paraffineingebetteten (FFPE) Brustkrebs-Gewebeproben entwickelt.
Das HER2 CISH pharmDx™-Kit erzeugt gleichzeitig rote (HER2) und blaue (CEN-17)
Farbsignale in einem Gewebeschnitt, die mit einem Lichtmikroskop ausgewertet werden.
Der Kitinhalt ist für 20 Tests ausreichend.
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Contents/ Table des matières/ Inhalt
ENGLISH
Intended Use .................................................................................................................5
Summary and Explanation ............................................................................................5
Principle of Procedure ...................................................................................................5
Reagents .......................................................................................................................6
Materials provided .....................................................................................................6
Materials required but not provided...........................................................................8
Precautions ...................................................................................................................9
Storage........................................................................................................................10
Specimen Preparation.................................................................................................11
Paraffin-embedded sections ...................................................................................11
INSTRUCTIONS FOR USE.........................................................................................11
A. Reagent Preparation ...............................................................................................11
A.1
Pre-Treatment Solution ...............................................................................11
A.2
Stringent Wash Buffer .................................................................................11
A.3
Wash Buffer 1..............................................................................................11
A.4
Ethanol series..............................................................................................12
A.5
Wash Buffer 2..............................................................................................12
A.6
Red Chromogen Solution ............................................................................12
A.7
Blue Chromogen Solution............................................................................12
A.8
Counterstain ................................................................................................12
B. Staining Procedure .................................................................................................13
B.1
Procedural notes .........................................................................................13
B.2
Deparaffinization..........................................................................................14
B.3
Staining protocol..........................................................................................14
B.3.1 Manual immunochemical staining protocol..................................................16
B.3.2 Automated immunochemical staining protocol (Dako Autostainer
instruments).................................................................................................17
Use of Bright Field Microscope....................................................................................18
Quality Control.............................................................................................................18
Interpretation of Staining .............................................................................................19
Limitations ...................................................................................................................20
Performance characteristics ........................................................................................21
Troubleshooting...........................................................................................................26
Appendix 1 ..................................................................................................................30
Appendix 2 ..................................................................................................................32
References ..................................................................................................................93
Explanation of symbols ...............................................................................................94
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FRANÇAIS
Utilisation prévue .........................................................................................................33
Résumé et explication .................................................................................................33
Principe de la procédure .............................................................................................33
Réactifs .......................................................................................................................34
Matériel fourni .........................................................................................................34
Matériel requis mais non fourni ...............................................................................36
Précautions .................................................................................................................37
Conservation ...............................................................................................................39
Préparation des échantillons .......................................................................................39
Coupes incluses en paraffine..................................................................................39
INSTRUCTIONS D’UTILISATION ...............................................................................40
A. Préparation des réactifs ..........................................................................................40
A.1
Solution de prétraitement ............................................................................40
A.2
Tampon de lavage stringent ........................................................................40
A.3
Tampon de lavage 1....................................................................................40
A.4
Série de bains d’éthanol ..............................................................................40
A.5
Tampon de lavage 2....................................................................................40
A.6
Solution de chromogène rouge ...................................................................40
A.7
Solution de chromogène bleu ......................................................................41
A.8
Contre-colorant............................................................................................41
B. Procédure de coloration..........................................................................................41
B.1
Remarques concernant la procédure ..........................................................41
B.2
Déparaffinage ..............................................................................................43
B.3
Protocole de coloration................................................................................43
B.3.1 Protocole de coloration immunohistochimique manuelle.............................45
B.3.2 Protocole de coloration immunohistochimique automatisée (appareils Dako
Autostainer) .................................................................................................46
Utilisation d’un microscope optique .............................................................................48
Contrôle qualité ...........................................................................................................48
Interprétation de la coloration......................................................................................49
Limites .........................................................................................................................50
Caractéristiques de performance ................................................................................51
Dépannage..................................................................................................................56
Annexe 1 .....................................................................................................................60
Annexe 2 .....................................................................................................................62
Bibliographie................................................................................................................93
Explications des symboles ..........................................................................................94
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DEUTSCH
Verwendungszweck.....................................................................................................63
Zusammenfassung und Erklärung ..............................................................................63
Verfahrensprinzip ........................................................................................................63
Reagenzien .................................................................................................................64
Mitgelieferte Materialien ..........................................................................................64
Zusätzlich benötigte Reagenzien und Zubehör (außerhalb des Lieferumfangs).....66
Vorsichtsmaßnahmen .................................................................................................67
Aufbewahrung .............................................................................................................69
Vorbereitung der Probe ...............................................................................................70
Paraffineingebettete Schnitte ..................................................................................70
GEBRAUCHSANWEISUNG .......................................................................................70
A. Vorbereitung der Reagenzien .............................................................................70
A.1
Vorbehandlungslösung................................................................................70
A.2
Stringenzwaschpuffer ..................................................................................70
A.3
Waschpuffer 1 .............................................................................................70
A.4
Ethanolreihe ................................................................................................71
A.5
Waschpuffer 2 .............................................................................................71
A.6
Rote Chromogenlösung...............................................................................71
A.7
Blaue Chromogenlösung .............................................................................71
A.8
Gegenfärbung..............................................................................................71
B. Arbeitsablauf des Färbens ......................................................................................72
B.1
Verfahrenshinweise .....................................................................................72
B.2
Entparaffinierung .........................................................................................73
B.3
Färbeprotokoll..............................................................................................73
B.3.1 Protokoll für manuelle immunchemische Färbung.......................................76
B.3.2 Protokoll für automatische immunchemische Färbung (Dako AutostainerGeräte) ........................................................................................................77
Verwendung des Lichtmikroskops...............................................................................78
Qualitätskontrolle.........................................................................................................78
Auswertung der Färbeergebnisse ...............................................................................79
Beschränkungen .........................................................................................................80
Leistungsmerkmale .....................................................................................................81
Fehlerbehebung ..........................................................................................................86
Anhang 1 .....................................................................................................................90
Anhang 2 .....................................................................................................................92
Literatur .......................................................................................................................93
Erläuterung der Symbole.............................................................................................94
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ENGLISH
Intended Use
For in vitro diagnostic use
HER2 CISH pharmDx™ Kit is intended for dual-color chromogenic visualization of signals
achieved with directly labeled in situ hybridization probes targeting the HER2 gene and
centromeric region of chromosome 17. The kit is designed to quantitatively determine HER2
gene status in formalin-fixed, paraffin-embedded breast cancer tissue specimens. Red and
blue chromogenic signals are generated on the same tissue section for evaluation under bright
field microscopy. The CISH procedure can be performed either manually or automated using
Dako Autostainer instruments.
HER2 CISH pharmDx™ Kit is indicated as an aid in the assessment of patients for whom
Herceptin™ (trastuzumab) treatment is being considered. Results from the HER2 CISH
pharmDx™ Kit are intended for use as an adjunct to the clinicopathologic information currently
used for estimating prognosis in stage II, node-positive breast cancer patients.
Summary and Explanation
The human HER2 gene (also known as ERBB2 or NEU) is located on chromosome 17 and
encodes the HER2 protein or p185HER2. The HER2 protein is a membrane receptor tyrosine
kinase with homology to the epidermal growth factor receptor (EGFR or HER1) (1-2). The
HER2 gene is present in 2 copies in all normal diploid cells.
In a fraction of patients with breast cancer, the HER2 gene is amplified as part of the process
of malignant transformation and tumor progression (3-8). HER2 gene amplification generally
leads to overexpression of the HER2 protein on the surface of breast cancer cells (9).
Amplification of the HER2 gene and/or overexpression of its protein have been demonstrated
in 25-30% of breast cancers. This upregulation is associated with poor prognosis, increased
risk of recurrence, and lower overall survival. Several studies have shown that HER2 status
correlates with sensitivity or resistance to certain chemotherapy regimens (10).
Demonstration of high HER2 protein overexpression or HER2 gene amplification is essential
for initiating therapy with Herceptin™, a monoclonal antibody to HER2 protein. Clinical studies
have shown that patients whose tumors have high HER2 protein overexpression and/or
amplification of the HER2 gene benefit most from Herceptin™ (11).
Principle of Procedure
HER2 CISH pharmDx™ Kit contains all reagents required to complete a CISH procedure for
formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) tissue section specimens (except hematoxylin for
counterstaining).
After deparaffinization and rehydration, specimens are heated in Pre-Treatment Solution for 10
minutes. The next step involves a proteolytic digestion using ready-to-use Pepsin either at
room temperature or at 37 °C. Optimal Pepsin incubation time depends on the fixation history
of the tissue and should be determined by the user but 8 minutes at room temperature or 2
minutes at 37 °C will be suitable for most specimens. Following the heating and proteolytic pretreatment steps, this kit employs a ready-to-use FISH Probe Mix based on a combination of
PNA (peptide nucleic acid) (12) and DNA technology. The Probe Mix consists of a mixture of
Texas Red-labeled DNA probes covering a 218 kb region including the HER2 gene on
chromosome 17, and a mixture of fluorescein-labeled PNA probes targeted at the centromeric
region of chromosome 17 (CEN-17). The specific hybridization to the two targets results in
formation of a distinct red fluorescent signal at each HER2 gene locus and a distinct green
fluorescent signal at each chromosome 17 centromere. To diminish background staining, the
Probe Mix also contains unlabelled PNA blocking probes. After a stringent wash and rinse in
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two different wash buffers the fluorescent probe signals are converted into chromogenic
signals by an immunohistochemical staining procedure. The first step is to block endogenous
peroxidase with ready-to-use Peroxidase Block, followed by incubation with ready-to-use CISH
Antibody Mix, comprised of anti-FITC conjugated with horseradish peroxidase (HRP) and antiTexas Red conjugated with alkaline phosphatase (AP). Next, the tissue specimens are
incubated with Red Chromogen solution followed by incubation with Blue Chromogen solution.
The enzymatic conversion of the added chromogens results in formation of visible red and blue
end-products at the antigen site (FISH probes). Thus, the red fluorescent signals are
converted to red, chromogenic signals and the green fluorescent signals are converted to blue,
chromogenic signals. The specimens are then counterstained and coverslipped. Results are
evaluated using a bright field microscope.
Using a bright field microscope, the invasive component of the tumor cells are located, and
enumeration of the red (HER2) and blue (CEN-17) signals is conducted. Then the HER2/CEN17 ratio is calculated. Normal cells within the analyzed tissue section serve as an internal
positive control of pre-treatment and hybridization efficiency. For details see the Interpretation
of Staining section.
Reagents
Materials provided
The materials listed below are sufficient for 20 tests (a test is defined as one 22 mm x 22 mm
target area). The number of tests is based on the use of 5-8 drops (250 µL per slide) of Vial 2,
10 µL per slide of Vial 3, 400 µL per slide of vial 7 and 8, and 400 µL of the Red Chromogen
(Vial 11) and Blue Chromogen (Vial 12) diluted in their respective substrate buffers (Vial 9 and
10). The kit provides materials sufficient for 20 tests in 10 individual staining runs. For staining
on Dako Autostainer Link platform, the kit provides materials sufficient for 20 tests in 5
individual staining runs.
The HER2 CISH pharmDx™ Kit is shipped as two separate items; SK109 Vial 2 (Pepsin) is
shipped in a separate box and the remaining reagents in one kit box. SK109 Vial 2 (Pepsin) is
shipped on dry ice and the kit box is shipped on cooling packs. To ensure that Vial 2 (Pepsin)
has not been exposed to high temperatures during transport dry ice should still be
present in shipment upon receipt.
Vial 1
Pre-Treatment Solution (20x)
150 mL, concentrated 20x
MES (2-[N-morpholino]ethanesulphonic acid) buffer.
Vial 2
Pepsin
7.5 mL, ready-to-use
Pepsin solution, pH 2.0; contains stabilizer and an
antimicrobial agent.
Vial 3
HER2/CEN-17 Probe Mix
200 µL, ready-to-use
Mix of Texas Red-labeled HER2 DNA probes and
fluorescein-labeled CEN-17 PNA probes; supplied in
hybridization buffer with 45% formamide, stabilizer, and
unlabeled PNA blocking probes.
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Vial 4
Stringent Wash Buffer (20x)
150 mL, concentrated 20x
SSC (saline-sodium citrate) buffer with detergent.
Vial 5
Wash Buffer 1 (20x)
500 mL, concentrated 20x
Tris/HCl buffer.
Vial 6
Wash Buffer 2 (10x)
1 L, concentrated 10x
Tris-buffered saline solution with 0.05% Tween 20.
Vial 7
Peroxidase Block
9 mL, ready-to-use. 3% hydrogen peroxidase containing
15 mmol/L sodium azid (NaN3).
Vial 8
CISH Antibody Mix
9 mL, ready-to-use.
Mix of horseradish peroxidase-conjugated antibody to
fluorescein and alkaline phosphatase-conjugated antibody
to Texas Red; Supplied in 50 mmol/L Tris buffer with
stabilizer, preservative, pH 7.5.
Vial 9
Red Substrate Buffer
12 mL, substrate buffer for dilution of Red Chromogen.
Vial 10
Blue Substrate Buffer
12 mL, substrate buffer for dilution of Blue Chromogen.
Vial 11
Red Chromogen
120 µL, to be diluted in Red Substrate Buffer (Vial 9).
Vial 12
Blue Chromogen
2 x 550 µL, to be diluted in Blue Substrate Buffer (Vial 10).
Vial 13
CISH Mounting Medium
5 mL, permanent mounting media without alcohol or xylene
Coverslip Sealant
1 tube, ready-to-use
Solution for removable sealing of coverslips.
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User-Fillable Reagent Bottles
5 mL Capacity, 6 Bottles*
12 mL Capacity, 2 Bottles**
For use on Dako Autostainer Link platform
* To run more than 4 separate stains, additional bottles will be needed.
** The 12 mL bottles are needed if all 20 tests are to be processed in one staining run
Materials required but not provided
Laboratory reagents:
Distilled or deionized water
Ethanol, 96%
Xylene or xylene substitutes
Dako Hematoxylin, Code S3301
User-fillable reagent bottles: 12 mL (Code SK201) or 5 mL (Code SK200) for diluted
hematoxylin)
Laboratory equipment:
Lintless tissue
Adjustable pipettes
Calibrated partial immersion thermometer (range 37-100 °C)
Calibrated surface thermometer (range 37-100 °C)***
Coverslips (22 mm x 22 mm for 10 µL hybridization and ex. 50 mm x 24 mm for mounting)
Forceps
Fume hood
Dako Hybridizer (Code S2450 or S2451)* + Humidity Control Strips (Code S2452)*
Humid chamber
Slides, Dako Silanized Slides, Code S3003, or poly-L-lysine-coated slides (see Specimen
Preparation)
Staining jars or baths.
Whirl mixer (or equivalent) and table centrifuge
Timer (capable of 2-30 minute intervals)
Water bath with lid (capable of maintaining 65 (±2) °C to 99 °C)
Microwave oven with sensing capability if pre-treatment is performed using microwave oven
(see B3. Staining protocol, Step 1: Pre-treatment, Method B)
Bright field microscope
*** Heating block or hybridization oven for denaturation (82 (±2) °C) and hybridization (45 (±2) °C) together with a
humid chamber can be used as an alternative to Dako Hybridizer.
Extra materials required for automated staining on Dako Autostainer/Autostainer Plus
instruments include the following:
Autostainer Reagent Vials (Code S3425)
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Precautions
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
For in vitro diagnostic use
For professional users.
Vial 1, Pre-Treatment Solution (20x), contains 1-<20% 2-morpholinoethanesulphonic acid;
Vial 2, Pepsin, contains 5-10% propan-2-ol;
Vial 4, Stringent Wash Buffer (20x), contains 1-<5% octoxinol
Vial 5, Wash Buffer 1 (20x), contains 1-<20% trometamol.
Vial 7, Peroxidase Block, contains sodium azide
At product concentrations these substances do not require hazard labeling. Material
Safety Data Sheets (MSDSs) are available for professional users on request.
Vial 2, Pepsin, contains pepsin A that may cause an allergic reaction.
Vial 3, HER2/CEN-17 Probe Mix contains 45% formamide and is labeled:
Toxic.
R61 May cause harm to the unborn child.
S45 In case of accident or if you feel unwell, seek medical advice immediately (show label
where possible).
S53 Avoid exposure – obtain special instructions before use.
S60 This material and/or its container must be disposed of as hazardous waste.
As a general rule, persons under 18 years of age are not allowed to work with this product.
Users must be carefully instructed in the proper working procedure, the dangerous
properties of the product and the necessary safety instructions.
Please refer to the Material Safety Data Sheet (MSDS) for additional information.
Coverslip Sealant contains 60-100% naphtha (petroleum), hydrotreated light, and is
labeled:
Extremely flammable.
Dangerous for the environment.
R11 Highly flammable.
R51/53 Toxic to aquatic organisms, may cause long-term adverse effects in the aquatic
environment.
S9 Keep container in a well-ventilated place.
S16 Keep away from sources of ignition – No smoking.
S35 This material and its container must be disposed of in a safe way.
S57 Use appropriate container to avoid environmental contamination.
S61 Avoid release to the environment. Refer to special instructions/safety data sheets.
Please refer to the Material Safety Data Sheet (MSDS) for additional information.
Vial 7, Peroxidase block, contains sodium azide (NaN3), a chemical highly toxic in pure
form. At product concentrations, though not classified as hazardous, build-ups of NaN3 may
react with lead and copper plumbing to form highly explosive metal azides. Upon disposal,
flush with large volumes of water to prevent azide build-up in plumbing.
Vial 11, Red Chromogen, contains Fast Red KL Salt and is labeled:
Toxic
R45 May cause cancer.
S35 This material and its container must be disposed of in a safe way.
S45 In case of accident or if you feel unwell, seek medical advice immediately (show label
where possible).
S53 Avoid exposure - obtain special instructions before use.
As a general rule, persons under 18 years of age are not allowed to work with this product.
Users must be carefully instructed in the proper working procedure, the dangerous
properties of the product and the necessary safety instructions (per European Union
Directive 94/33/EC).
Please refer to the Material Safety Data Sheet (MSDS) for additional information
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9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
Vial 12, Blue Chromogen, contains 5-amino-2-[3-[5-amino-1,3-dihydro-3,3-dimethyl-1-(4sulfobutyl)- 2H-indol-2-ylidene]-1-propenyl]-3,3-dimethyl-1-(4-sulfobutyl)-3H-Indolium, ter
trifluoroacetate.
Caution: This product contains a substance, which has not yet been fully tested. As a
general rule, persons under 18 years of age are not allowed to work with this product.
Users must be carefully instructed in the proper working procedure, the dangerous
properties of the product and the necessary safety instructions (per European Union
Directive 94/33/EC).
Please refer to the Material Safety Data Sheet (MSDS) for additional information
Vial 13, CISH Mounting Medium.
Safety Data Sheet available for professional users on request.
Specimens, before and after fixation and all materials exposed to them, should be handled
as if capable of transmitting infection and should be disposed of with proper precautions
(13). Never pipette reagents by mouth and avoid contacting the skin and mucous
membranes with reagents and specimens. If reagents come in contact with sensitive
areas, wash with copious amounts of water.
Minimize microbial contamination of reagents to avoid erroneous results.
Incubation times and temperatures, or methods other than those specified, may give
erroneous results.
Tissue fixation methods and thickness of specimen other than those specified may affect
tissue morphology and/or signal intensity.
Avoid evaporation of HER2/CEN-17 Probe Mix during hybridization by ensuring sufficient
humidity in the hybridization chamber.
Reagents have been optimally diluted. Further dilution may result in loss of performance.
Unused solution should be disposed according to local, State, and Federal regulations.
Wear appropriate personal protective equipment to avoid contact with eyes and skin.
Safety Data Sheet available for professional users on request.
It is recommended to follow standard procedure with respect to service and maintenance
of the Dako Autostainer Instrument.
People suffering from color vision deficiency should score samples with caution.
21. As with any product derived from biological sources, proper handling procedures should
be used.
22. Before preparation of the blue chromogen solution, the blue chromogen (vial 12) should
be thoroughly mixed to ensure complete dissolution of the chromogen.
23. It is recommended to use two dropzones with 200 µL in each (1 and 3) on the Dako
Autostainer Instrument to cover the complete slide area and prevent drying of large tissue
sections
Storage
HER2 CISH pharmDx™ Kit is shipped as two separate items; SK109 Vial 2 (Pepsin) in a
separate box and the remaining reagents in one kit box. SK109 Vial 2 (Pepsin) is shipped on
dry ice and the kit box is shipped on cooling packs. To ensure that Vial 2 (Pepsin) has not
been exposed to high temperatures during transport dry ice should still be present in
shipment upon receipt.
Store all kit reagents at 2-8 °C, except Vial 13 (CISH Mounting Medium). Vial 13 (CISH
Mounting Medium) should be stored at room temperature. Vial 3, 7 and 8 should be stored in
the dark at 2-8 °C.
Pepsin and Red Chromogen (Vials 2 and 11) may be affected adversely if exposed to heat.
Do not leave these components at room temperature.
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Do not use the kit after the expiration date stamped on the kit box. If reagents are stored under
conditions other than those specified in this package insert, the user must validate reagent
performance (14).
There are no obvious signs to indicate instability of this product. Therefore, it is important to
evaluate normal cells in the analyzed tissue section. If an unexpected staining pattern is
observed which cannot be explained by variations in laboratory procedures, and a problem
with the HER2 CISH pharmDx™ Kit is suspected, contact our Technical Services.
Specimen Preparation
Specimens from biopsies, excisions or resections must be handled to preserve the tissue for
CISH analysis. Standard methods of tissue processing for immunohistochemical staining
should be used for all specimens (15).
Paraffin-embedded sections
Only tissues preserved in neutral buffered formalin and paraffin-embedded are suitable for
use. Specimens should e.g. be blocked into a thickness of 3 or 4 mm and fixed for 18-24 hours
in neutral buffered formalin. The tissues are then dehydrated in a graded series of ethanol and
xylene, followed by infiltration by melted paraffin held at no more than 60 °C. Properly fixed
and embedded tissues will keep indefinitely prior to sectioning and slide mounting if stored in a
cool place (15-25 °C) (15-16). Other fixatives are not suitable.
Tissue specimens should be cut into sections of 4-6 µm.
It is recommended that tissue sections are mounted on Dako Silanized Slides, Code S3003, or
poly-L-lysine-coated slides. Specimens should be analyzed within 4-6 months of sectioning when
stored at room temperature (20-25 °C).
INSTRUCTIONS FOR USE
A. Reagent Preparation
It is convenient to prepare the following reagents prior to staining:
Day 1, Probe hybridization:
A.1 Pre-Treatment Solution
Crystals may occur in Vial 1, but they will dissolve at room temperature. Ensure that no
crystals are present before preparation of reagent.
Dilute a sufficient quantity of Vial 1 (Pre-Treatment Solution 20x) by diluting the concentrate
1:20 in distilled or deionized water. Unused diluted solution may be stored at 2-8 ºC for one
month. Discard diluted solution if cloudy in appearance.
A.2 Stringent Wash Buffer
Dilute a sufficient quantity of Vial 4 (Stringent Wash Buffer 20x) by diluting the concentrate
1:20 in distilled or deionized water. Unused diluted buffer may be stored at 2-8 ºC for one
month. Discard diluted buffer if cloudy in appearance.
A.3 Wash Buffer 1
Dilute a sufficient quantity of Vial 5 (Wash Buffer 1 20x) by diluting the concentrate 1:20 in
distilled or deionized water. Unused diluted buffer may be stored at 2-8 ºC for one month.
Discard diluted buffer if cloudy in appearance.
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A.4 Ethanol series
From a 96% ethanol solution, prepare 3 jars with 70%, 85%, and 96% ethanol, respectively.
Store covered jars at room temperature or at 2-8 °C , and use for a maximum of 200 slides.
Discard solutions if cloudy in appearance.
Day 2, Immunohistochemical staining:
All reagents related to the immunohistochemical staining (Vial 6-13), except Red
Chromogen (Vial 11), should be equilibrated to room temperature (20-25 °C) prior to
reagent preparation. Reagents should be protected from light during equilibration.
A.5 Wash Buffer 2
Dilute a sufficient quantity of Wash Buffer 2 (Vial 6) (1:10) using distilled or deionised water for
the staining procedure that is planned. Unused diluted solution may be stored at 2-8 °C for one
month. Discard solution if cloudy in appearance. Wash Buffer 2 is interchangeable with Dako
Wash Buffer, Code S3006.
A.6 Red Chromogen Solution
Before removing an aliquot of Red Chromogen from Vial 11, tip or mix the solution and
centrifuge shortly. Prepare a sufficient quantity of Red Chromogen Solution but at least 1 mL.
The proportion is 10 µL per 1 mL and the following procedure yields 1.01 mL of Red
Chromogen Solution:
Transfer 1 mL of Red Substrate Buffer from Vial 9 to an empty, appropriate vial. Add 10 µL of
Red Chromogen from Vial 11. Mix well.
Note: The prepared Red Chromogen Solution should be used within 20 minutes. For best
results, prepare the Red Chromogen Solution immediately before use.
A.7 Blue Chromogen Solution
Before removing an aliquot of Blue Chromogen from Vial 12, thoroughly mix the chromogen
and centrifuge briefly to remove liquid from the lid. Then immediately continue with the
preparation of the blue chromogen solution.
Prepare a quantity of the blue chromogen solution that is sufficient for the entire run.
To prepare 1.075 mL blue chromogen solution; transfer 1 mL Blue Substrate Buffer from Vial
10 to an empty, appropriate vial. Add 75 µl of the thoroughly mixed Blue Chromogen from Vial
12. Mix well.
If a smaller volume Blue Chromogen Solution is sufficient the scale can be reduced
correspondingly – eg. for preparation of 430 µL Blue Chromogen Solution, add 30 µL
thoroughly mixed Blue Chromogen from Vial 12 to 400 µL Blue Substrate Buffer from Vial 10.
Note: It is recommended to prepare the blue chromogen solution at least 30 minutes before
use. The Blue Chromogen Solution should be used within 8 days when stored at 2-8 ºC in the
dark.
A.8 Counterstain
Dilute a sufficient quantity of Dako Hematoxylin (Code S3301), 1:5 using distilled or deionised
water for the staining procedure that is planned. Unused diluted hematoxylin may be stored at
room temperature (20-25 °C) for one day.
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B. Staining Procedure
B.1 Procedural notes
The user should read these instructions carefully and become familiar with all components
prior to use (see Precautions).
All reagents should be equilibrated to the relevant temperature prior to use as follows:
Vial 1:
The diluted Pre-Treatment Solution should be equilibrated to 95-99 °C if water bath
is used for pre-treatment (B3. Staining protocol, Step 1: Pre-Treatment, Method A).
If microwave oven with sensing capability is used for pre-treatment (B3. Staining
protocol, Step 1: Pre-Treatment, Method B) the diluted Pre-Treatment Solution
should be equilibrated to room temperature 20-25 °C.
Vial 2:
Vial 3:
Vial 4:
Pepsin should be kept cold at 2-8 °C continuously.
HER2/CEN-17 Probe Mix may be applied at any temperature from 2-25 °C.
The diluted Stringent Wash Buffer should be equilibrated to room temperature and
65 (±2) °C respectively prior to use.
Vial 5:
The diluted Wash Buffer 1 should be equilibrated to room temperature 20-25 °C.
Vial 6:
Vial 7:
Vial 8:
Wash Buffer 2 (10x) should be equilibrated to room temperate 20-25 °C prior dilution
in room temperature equilibrated distilled or deionised water.
Peroxidase Block should be equilibrated to room temperate 20-25 °C.
CISH Antibody Mix should be equilibrated to room temperate 20-25 °C.
Vial 9:
Red Substrate Buffer should be equilibrated to room temperate 20-25 °C.
Vial 10: Blue Substrate Buffer should be equilibrated to room temperate 20-25 °C.
Vial 11: Red Chromogen should be kept cold at 2-8 °C continuously.
Vial 12: Blue Chromogen should be equilibrated to room temperate 20-25 °C.
Vial 13: Mounting Medium should be equilibrated to room temperate 20-25 °C.
Coverslip sealant: Coverslip sealant may be applied at any temperature from 2-25 ºC
All steps must be performed at the outlined temperatures.
The procedure includes a number of dehydrations followed by drying of the tissue sections.
Ensure that tissue sections are completely dry before proceeding to the next step. Do not allow
tissue sections to dry during the other procedural steps.
If the staining procedure has to be interrupted, slides may be kept in Wash Buffer 1 after the
deparaffinization step for up to 1 hour at room temperature (20-25 °C) without affecting the
results.
Manual immunohistochemical staining:
All incubations should be performed at room temperature (20-25 °C).
Automated immunohistochemical staining;
Dako Autostainer/Autostainer Plus instruments:
All incubations should be performed at room temperature (20-25 °C). The relevant volumes
from Vial 7 (Peroxidase Block) and Vial 8 (CISH Antibody Mix) should be moved into Dako
Autostainer Reagent Vials (Code S3425) and the remainder reagents (Red and Blue
Chromogen Solutions, diluted Hematoxylin and Wash Buffer 2 for the 5 minutes post
counterstain incubation) should be prepared directly in Autostainer Reagent Vials (Code
S3425). Choose two dropzones (1 and 3) with 200 µL in each to prevent uneven staining and
drying of slides.
Dako Autostainer Link instruments:
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All incubations should be performed at room temperature (20-25 °C). Vial 7 (Peroxidase Block)
and Vial 8 (CISH Antibody Mix) can be loaded directly on the instrument, while Red and Blue
Chromogen Solutions and the Hematoxylin dilution should be prepared in User-Fillable Bottles.
The reagents supplied with the kit are sufficient for 20 tests in 5 individual runs. Default setting
is one dropzone with 200 µL reagent. Manually choose two drop zones (1 and 3) with 200 µL
in each to prevent uneven staining and drying of slides.
When running 20 samples in one staining run, use 12 mL user-fillable bottles for preparation of
Red and Blue Chromogen Solution.
Pay attention to incompatibility with other protocols in the same Autostainer run due to the
stability of the Red Chromogen Solution after preparation. In order to accommodate the short
stability of the Red Chromogen Solution, a maximum of 30 slides can be stained on the
instrument in one staining run.
B.2 Deparaffinization
Deparaffinization and rehydration: Prior to performing the analysis, tissue slides must be
deparaffinized to remove embedding medium and rehydrated. Avoid incomplete removal of
paraffin. Residual embedding medium will result in increased non-specific staining. This step
should be performed at room temperature (20-25 °C).
1. Place slides in a xylene bath and incubate for 5 (±1) minutes. Change baths and repeat
once.
2. Tap off excess liquid and place slides in 96% ethanol for 2 (±1) minutes. Change baths and
repeat once.
3. Tap off excess liquid and place slides in 70% ethanol for 2 (±1) minutes. Change baths and
repeat once.
4. Tap off excess liquid and place slides in diluted Wash Buffer 1 (see INSTRUCTIONS FOR
USE, Section A.3) for a minimum of 2 minutes. Commence staining procedure as outlined
in Section B.3, Step 1, Pre-Treatment.
If the staining is interrupted, slides may be kept in Wash Buffer 1 after the deparaffinization
step for up to 1 hour at room temperature (20-25 ºC) without affecting the results.
Xylene and alcohol solutions should be changed after 200 slides or less.
Xylene substitutes may be used.
NOTE: The reagents and instructions supplied in this kit have been designed for optimal
performance. Further dilution of the reagents or alteration of incubation temperatures may give
erroneous or discordant results. Differences in tissue processing and technical procedures in
the user’s laboratory may invalidate the assay results. The regular use of in-house control
slides is recommended for external quality control.
B.3 Staining protocol
DAY 1
Step 1: Pre-treatment
Pre-treatment can be performed either by use of water bath as described in the below Method
A) or, alternatively, by use of microwave oven with sensing capability as described in the below
Method B).
Method A) Pre-treatment using water bath:
Fill staining jars, e.g. Coplin jars, with the diluted Pre-Treatment Solution (see
INSTRUCTIONS FOR USE, Section A.1). Place staining jars containing Pre-Treatment
Solution in water bath. Heat the water bath and the Pre-Treatment Solution to 97-99 °C.
Measure temperature inside jar with a calibrated thermometer to ensure correct temperature.
Cover jars with lids in order to stabilize the temperature and avoid evaporation.
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Immerse the room temperature deparaffinized sections into the preheated Pre-Treatment
Solution in the staining jars. Re-check temperature and incubate for 10 (±1) minutes at 95-99 °C.
Remove the entire jar with slides from the water bath. Remove lid and allow the slides to cool
in the Pre-Treatment Solution for 15 minutes at room temperature.
Transfer the slides to a jar with diluted Wash Buffer 1 (see INSTRUCTIONS FOR USE,
Section A.3) for 3 minutes at room temperature (20-25 °C).
Replace Wash Buffer 1 and soak sections for another 3 minutes.
Method B) Pre-treatment using microwave oven with sensing capability:
Fill a plastic jar with diluted room temperature (20-25 °C) Pre-Treatment Solution. Immerse the
deparaffinized sections in Pre-Treatment Solution, cover the jar with a punctured lid and place
it in the microwave oven. Select the boiling sensor function and a program that runs for 10
minutes after boiling temperature has been reached*.
Following the 10 minutes incubation take the jar with slides out of the oven, remove the lid and
cool for 15 minutes at room temperature. Transfer the slides to a jar with diluted Wash Buffer 1
and soak for 3 minutes at room temperature (20-25 °C). Replace Wash Buffer 1 and soak
sections for another 3 minutes.
*The use of a microwave oven with a sensing capability means that the oven must include a sensor and
programs which initially heat the Pre-Treatment Solution to the boiling point and subsequently maintain
the required pre-treatment temperature (above 95 ºC) while counting down the preset time (10 (±1)
minutes). Some microwave oven models with sensing capability may not include the possibility to freely
set a count-down time. If the model only includes pre-set programs, be sure to select a program which
maintain the required pre-treatment temperature (above 95 ºC) for at least 10 (±1) minutes and manually
stop the program after 10 (±1) minutes.
NOTE: The Pre-Treatment Solution is designed for a single use application only. Do not reuse.
Step 2: Pepsin, ready-to-use
Pepsin incubation can be performed either at room temperature (20-25 °C) as described in the
below Method A) or, alternatively, at 37 °C as described in the below Method B)
Tap off excess Wash Buffer 1. Using lintless tissue (such as an absorbent wipe or gauze pad),
carefully wipe around the specimen to remove any remaining liquid and to keep reagents
within the prescribed area.
Apply 5-8 drops (250 µL) of cold (2-8 °C) Pepsin (Vial 2) to cover specimen. Always store
Pepsin at 2-8 °C.
Method A) Incubation at room temperature:
Incubate for 8 minutes at room temperature (20-25 °C). An incubation time of 8 minutes will be
adequate for most specimens, but the optimal incubation time may depend on tissue fixation
history and/or thickness of specimen and should be determined by the user.
Tap off Pepsin and soak sections in the diluted Wash Buffer 1 (see INSTRUCTIONS FOR
USE, Section A.3) for 3 minutes at room temperature (20-25 °C).
Replace diluted Wash Buffer 1 and soak sections for another 3 minutes. Continue to
dehydration.
Method B) Incubation at 37 °C:
Place specimen with Pepsin on a 37 °C heating block – e.g. Dako Hybridizer – and incubate
for 2 minutes. An incubation time of 2 minutes will be adequate for most specimens, but the
optimal incubation time may depend on tissue fixation and/or thickness of the specimen and
should be determined by the user.
Tap off Pepsin and soak sections in diluted Wash Buffer 1 for 3 minutes at room temperature
(20-25 °C).
Replace Wash Buffer 1 and soak sections for another 3 minutes. Continue to dehydration.
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Dehydrate tissue sections through a graded series of ethanol (see INSTRUCTIONS FOR
USE, Section A.4): 2 minutes in 70% ethanol, 2 minutes in 85% ethanol, and 2 minutes in 96%
ethanol.
Allow tissue sections to air dry completely.
Step 3: HER2/CEN-17 Probe Mix, ready-to-use
The following step should be performed in a fume hood.
Apply 10 µL of HER2/CEN-17 Probe Mix (Vial 3) to the centre of the tissue section.
Immediately place a 22 mm x 22 mm glass coverslip over the Probe Mix and allow it to spread
evenly under the coverslip. Avoid air bubbles. If air bubbles are observed, gently tap them
away from the tissue using forceps.
Seal coverslip with Coverslip Sealant by ejecting the Sealant around the periphery of the
coverslip. Allow the Coverslip Sealant to overlap the coverslip and the slide, thereby forming a
seal around the coverslip. Make sure that the Coverslip Sealant covers the entire edge of the
coverslip.
Prepare Dako Hybridizer* (Code S2450 or S2451) for a hybridization run. Start the Hybridizer
and choose a program that will denature at 82 °C for 5 minutes and hybridize overnight (14-20
hours) at 45 °C (please refer to Dako Hybridizer Instruction Manual for details).
Place slides in the Hybridizer. Make sure that Humidity Control Strips (Code S2452) are
saturated and optimal for use. Make sure the lid is properly closed and start program.
*Instrumentation that allows for conditions similar to the ones described above may be used for
denaturation and hybridization.
DAY 2
Step 4: Stringent Wash
Fill two staining jars, e.g. Coplin jars, with the diluted Stringent Wash Buffer (see
INSTRUCTIONS FOR USE, Section A.2). A minimum volume of 100 mL or 15 mL per slide in
each jar is recommended.
Place one of the staining jars containing diluted Stringent Wash Buffer at room temperature in
a fume hood and the other in a water bath. Heat the water bath and the diluted Stringent Wash
Buffer to 65 (±2) °C. Ensure that the temperature has stabilized. Cover jar with lid in order to
stabilize the temperature and avoid evaporation. Measure the temperature inside the water
bath jar with a calibrated thermometer to ensure correct temperature. Stringent Wash Buffer
contains detergent and may become turbid at 65 °C; this will not affect performance.
Using forceps or gloves take slides from the hybridization chamber and gently remove
Coverslip Sealant as well as coverslip and place slides in the room temperature pre-wash jar,
one at a time.
As soon as all coverslips have been removed, transfer slides from the room temperature, prewash jar to the 65 (±2) °C jar in the water bath. Perform stringent wash for exactly 10 minutes
(do NOT wait for the temperature to get back up to 65 (±2) °C before starting the incubation
time).
Remove slides from the diluted Stringent Wash Buffer, and soak sections in diluted Wash
Buffer 1 for 3 minutes at room temperature (20-25 °C).
Change diluted Wash Buffer 1 and soak sections for another 3 minutes.
B.3.1 Manual immunochemical staining protocol
Perform all steps, except drying, at room temperature (20-25 °C).
Step 5: Wash
Remove slides from the diluted Wash Buffer 1 and soak sections in diluted Wash Buffer 2 (see
INSTRUCTIONS FOR USE, Section A.5) for 3 minutes.
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Step 6: Peroxidase Block
Tap off excess buffer. Using a lintless tissue carefully wipe around the specimen to remove
any remaining liquid and to keep reagents within the prescribed area.
Cover specimen with 400 µL Peroxidase Block.
Incubate 5 (±1) minutes.
Immerse in diluted Wash Buffer 2 for 3 minutes.
Repeat once in fresh Wash Buffer 2.
Step 7: CISH Antibody Mix
Tap off excess buffer and wipe slides as before.
Cover specimen with 400 µL CISH Antibody Mix.
Incubate 30 (±1) minutes in a humid chamber.
Immerse in diluted Wash Buffer 2 for 3 minutes. Repeat once in fresh Wash Buffer 2.
Step 8: Red Chromogen Solution (prepare immediately before use, see INSTRUCTIONS
FOR USE, Section A.6)
Tap off excess buffer and wipe slides as before.
Cover specimen with 400 µL Red Chromogen Solution.
Incubate 10 minutes in a humid chamber.
Immerse in diluted Wash Buffer 2 for 3 minutes. Repeat once in fresh Wash Buffer 2.
Step 9: Blue Chromogen Solution (prepare 30 minutes-8 days before use, see
INSTRUCTIONS FOR USE, Section A.7)
Tap off excess buffer and wipe slides as before.
Cover specimen with 400 µL Blue Chromogen Solution.
Incubate 10 minutes in a humid chamber.
Immerse in diluted Wash Buffer 2 for 3 minutes. Repeat once in fresh Wash Buffer 2.
Step 10: Counterstain
Cover specimen with 400 µL diluted hematoxylin (Dako Hematoxylin, Code S3301 diluted 1:5,
see INSTRUCTIONS FOR USE, Section A.8) for 5 minutes.
Rinse with Wash Buffer 2 and place tissue sections in a fresh Wash Buffer 2 bath for a
minimum of 5 minutes to “blue” hematoxylin counterstain.
Rinse thoroughly with distilled or deionised water.
Dry sections for 30 minutes at 37 °C on Dako Hybridizer with the lid open. Allow sections to
cool to room temperature before mounting.
Step 11: Mounting
Coverslip with CISH Mounting Medium (Vial 13) and let the mounting medium harden at room
temperature (20–25 °C) for at least 30 minutes, preferably 60 minutes, prior to inspection.
Note: Subjecting specimens to alcohol or xylene prior to mounting must be avoided. It may
compromise the sensitivity of the reaction and result in adverse effects on staining.
B.3.2 Automated immunochemical staining protocol (Dako Autostainer instruments)
Automated staining protocol
Step 1: Select the HER2CISH protocol under pharmDx in the protocol selector. For first time
users, the protocol should be installed prior to staining. On other Dako Autostainer platforms
the protocol should be set up according to the program in figure 1. Alternatively contact Dako
Technical Service for assistance in protocol installation for the automated platforms.
Step 2: Load reagents
Step 3: Load tissue slides. Do not allow tissue sections to dry while loading slides on the Dako
Autostainer Instrument and during the staining procedure. Dried tissue sections may display
increased background staining and weak signals.
Step 4: Begin run. For Autostainer Link platforms choose “air blow” for completion
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If the HER2CISH protocol is not present on your Autostainer Link platform, please contact
Dako Technical Services.
Figure 1. Generic program for Dako Autostainer instruments
Note: Choose two dropzones (1 and 3) with 200 µl in each.
Step 5: Remove the slides from the Dako Autostainer instrument after the program has ended.
Dry the sections for 30 minutes at 37 ºC on Dako Hybridizer with the lid open. Allow slides to
cool to room temperature before mounting.
Step 6: Mounting
Coverslip with CISH Mounting Medium (Vial 13) and let the mounting medium harden at room
temperature (20–25°C) for at least 30 minutes, preferably 60 minutes, prior to inspection.
Note: Subjecting specimens to alcohol or xylene prior to mounting must be avoided. It may
compromise the sensitivity of the reaction and result in adverse effects on staining.
Use of Bright Field Microscope
Use a microscope objective of sufficient quality and magnification to allow for optimal scoring
of specimens. Adjust light intensity to allow for easy separation of blue and red color. Focus up
and down to find all of the signals in the individual nucleus.
Quality Control
1. Signals must be clear, well balanced in intensity, distinct and easy to evaluate.
2. Normal cells within the sample allow for an internal control of the staining run.
•
•
•
•
Normal cells should have 1-2 clearly visible blue signals indicating that the CEN-17 PNA
Probe has successfully hybridized to the centromeric region of chromosome 17.
Normal cells should have 1-2 clearly visible red signals indicating that the HER2 DNA
Probe has successfully hybridized to the HER2 amplicon.
In case of tissue sectioning, some normal cells will have less than the expected 2 signals
of each color.
Failure to detect signals in normal cells indicates assay failure, and results should be
considered invalid.
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•
Numeric evaluation of normal cells should give a result corresponding to the expected
value.
3. Nuclear morphology must be intact. Numerous ghost-like cells and a general poor nuclear
morphology indicate over-digestion of the specimen, resulting in loss or fragmentation of
signals. Such specimens should be considered invalid.
4. Differences in tissue fixation, processing, and embedding in the user’s laboratory may
produce variability in results, necessitating regular evaluation of in-house control slides.
Interpretation of Staining
Assessable tissue
Only specimens from patients with invasive carcinoma should be tested. In cases with carcinoma
in situ and invasive carcinoma in the same specimen, only the invasive component should be
scored. Avoid areas of necrosis and areas where the nuclear borders are ambiguous. Do not
include nuclei that require subjective judgment. Skip nuclei with weak signal intensity and nonspecific or high background.
Assessment of HER2 CISH
Slide assessment:
Scan slide to account for possible heterogeneity between tumor areas. Make the assessment
of the slide according to the guidelines below:
Signal enumeration: Scan several areas of tumor cells to account for possible heterogeneity.
Select an area having good nuclei distribution. Begin analysis in the upper left quadrant of the
selected area and, scanning from left to right, count the number of signals within the nuclear
boundary of each evaluated nucleus according to the guidelines below.
-
-
-
Focus up and down to find all of the signals in the individual nucleus.
If a signal appears to have more than one center of origin, and hence has a shape that
differs significantly from a circular dot, it should be counted as two signals (please refer to
signal counting guide below)
In nuclei with high levels of HER2 gene amplification, the HER2 signals may be positioned
very close to each other forming a cluster of signals. In these cases the number of HER2
signals cannot be counted, but must be estimated. Special attention must be paid to the
blue signals, as clusters of HER2 signals can cover the blue signals making them hard to
see.
In case of doubt, do not include the nuclei in the evaluation
Do not score nuclei without signals or with signals of only one color. Score only those nuclei
with one or more signals of each color.
(120946-003)
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Signal Counting Guide
1
Do not count. Nuclei are overlapping, not all areas
of nuclei are visible.
2
Two blue signals, do not score nuclei with signals of
only one color.
3
Count as 3 blue and 12 red signals (cluster
estimation).
4
Count as 2 blue and 1 red signal. Signals that
appear to have more than one centre of origin,
should be counted as two signals.
5
Do not count (over- or under digested
nuclei)Missing signals in the centre of nuclei.
6
Count as 2 blue and 5 red signals. Signals that
appear to have more than one centre of origin,
should be counted as two signals.
7
Count as 1 blue and 5 red signals.
8
Count as 3 blue (1 blue out of focus) and 3 red
signals.
9
Cluster of red signals hiding blue signals. Go to a
higher level of magnification to confirm presence or
absence of blue signals. In case of doubt, do not
count.
Record counts
Count 20 nuclei per tissue specimen, when possible from distinct tumor areas (17).
Calculate the HER2/CEN-17 ratio by dividing the total number of red HER2 signals by the total
number of blue CEN-17 signals.
Specimens with a HER2/CEN-17 ratio above or equal to 2 should be considered HER2 gene
amplified (18-19).
Results at or near the cut-off (1.8-2.2) should be interpreted with caution.
If the ratio is borderline (1.8-2.2), count an additional 20 nuclei and recalculate the ratio for the
40 nuclei.
In case of doubt, the specimen slide should be re-scored. For borderline cases a consultation
between the pathologist and the treating physician is warranted.
Limitations
1. HER2 CISH pharmDx™ is a multi-step process that requires specialized training in the
selection of the appropriate reagents, as well as in tissue selection, fixation, and processing,
preparation of the CISH slide, and interpretation of the staining results.
2. CISH results are dependent on the handling and processing of the tissue prior to staining.
Improper fixation, washing, drying, heating, sectioning, or contamination with other tissues or
fluids may influence on probe hybridization. Inconsistent results may be due to variations in
fixation and embedding methods, or to inherent irregularities within the tissue.
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3. For optimal and reproducible results, the tissue slides must be deparaffinized completely.
The paraffin removal needs to be completed at the beginning of the staining process. (See
INSTRUCTIONS FOR USE, section B.2).
4. Only temperature-calibrated water bath should be used. Dako Hybridizer (Code S2450 or
S2451) is recommended for denaturation and hybridization, however, if heating block and
hybridization oven is used, they must be temperature-calibrated. Use of other types of
equipment may result in evaporation of HER2/CEN-17 Probe Mix during hybridization and
must be validated by user.
5. Excessive or incomplete counterstaining may compromise proper interpretation of results.
6. The immunohistochemical staining procedure should be performed at ambient
temperature of 20-25 °C.
7. Do not replace reagents with reagents carrying other lot numbers or with reagents from
other manufactures.
Performance characteristics
Analytical sensitivity
The HER2 DNA probes in HER2/CEN-17 Probe Mix have been end-sequenced and mapped
to confirm a total coverage of 218 kb including the HER2 gene. The CEN-17 PNA probes in
HER2/CEN-17 Probe Mix have been tested individually and in combination to confirm their
specific hybridization to the centromeric region of chromosome 17.
To exclude cross-hybridization to chromosomes other than chromosome 17, studies were
performed on metaphase spreads according to standard Dako QC procedures. A total of 250
metaphase spreads were evaluated for specific hybridization of the HER2 DNA and CEN-17
PNA probe mixes. In all 250 cases the hybridization was specific for chromosome 17. No
cross-hybridization to loci on other chromosomes was observed in any of the 250 cases.
Furthermore, sensitivity was tested on 18 normal human breast epithelium specimens to verify
that HER2 CISH pharmDx™ Kit detects the target substances (HER2 and CEN-17). The
HER2/CEN-17 ratios were between 0.97-1.09, i.e. in the interval expected of normal diploid
cells.
Analytical specificity
Analytical specificity was tested to measure the assay’s ability to solely identify target
substances HER2/CEN-17 without interference from other substances. Stained slides were
evaluated for presence of signals in the absence of HER2/CEN-17 Probe Mix or CISH
Antibody Mix. No unspecific binding of the CISH Antibody Mix or the chromogens resulting in
signals visible in either FISH or CISH were observed.
Robustness studies
The robustness of HER2 CISH pharmDx™ Kit assay was tested by varying time and
temperature for incubation with CISH Antibody Mix, Red Chromogen Solution, Blue
Chromogen Solution and counterstaining. All other parameters of the procedure have been
tested as part of the robustness studies for HER2 FISH pharmDx™ Kit.
•
•
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•
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•
Pre-treatment for 7, 10 and 13 minutes at 95-99 ºC.
Pre-treatment at 89, 92 and 95-99 ºC for 10 minutes.
Pepsin incubation times of 2, 5, 10, 15 and 18 minutes at room temperature.
Denaturation temperatures of 72, 77, 82, 87 and 92 ºC.
Hybridization time of 17 hours at 40, 45 and 50 ºC.
Hybridization times of 10, 12 and 14 hours at 45 ºC.
The stringent wash was tested for 10 minutes at 60, 65 and 70 ºC.
Stringent wash was tested for 5, 10 and 15 minutes at 65 ºC. Stringent wash for 10
minutes at 70 ºC, and stringent wash for 15 minutes at 65 ºC resulted in loss of signals,
whereas no significant difference in results was observed at the other time/temperature
combinations.
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Dilutions of Stringent Wash Buffer were tested: 1:10, 1:15, 1:20, 1:30 and 1:40. The 1:40
dilution of Stringent Wash Buffer resulted in loss of signals, whereas no significant
difference in signal intensity was observed at the other dilutions.
Antibody incubation time: 25, 27, 30, 33 and 35 minutes. 25 minutes incubation with
antibody mix resulted in a loss of red signal intensity while no significant differences were
observed at all other time points.
Red chromogen solution incubation time for 8, 9, 10, 11 and 12 minutes
Blue chromogen solution incubation time for 8, 9, 10, 11 and 12 minutes
Counterstaining incubation time for 4, 5 and 6 minutes
Counterstaining concentration at 1:4, 1:5 and 1:6 dilution
Note: For the robustness studies tests only one parameter in the staining procedure was
changed at a time while all other parameters were kept constant. It is recommended to adhere
to the time and temperatures indicated in the staining procedure.
Repeatability
The repeatability of the HER2/CEN-17 ratio was investigated with HER2 CISH pharmDx™ Kit
using three consecutive sections from nine different breast cancer specimens. The coefficient
of variance was found to be 1-7% with higher ratio resulting in higher CV.
Repeatability on consecutive sections of breast cancer specimens with different thickness
(3-7 µm) was tested with HER2 CISH pharmDx™ Kit. The coefficient of variance of the
HER2/CEN-17 ratio in this study was found to be 3-6%, i.e. in the same range as for tissue of
equal thickness.
Reproducibility
The reproducibility of HER2 CISH pharmDx™ Kit was tested for day-to-day and site-tosite/observer-to-observer reproducibility. Sections from 9 different breast cancer specimens
were stained and analyzed on three days at three sites.
In the reproducibility study the analysis of breast cancer specimens using HER2 CISH
pharmDx™ Kit has shown reproducible results between days and between laboratories.
According to a variance component model, measurements made on different sites and
different days differed only slightly more than putative measurements made the same day at
the same site (residual error) (Table 1).
Table 1. Variance component CV estimates
Amplified
IHC 2+
Nonamplified
Site-to-site
15.8%
12.2%
9.0%
Day-to-day
13.6%
12.2%
8.4%
Residual error
13.1%
12.2%
8.4%
Comparative study
The clinical utility of HER2 CISH pharmDx™ Kit was investigated in a clinical study comprising
365 invasive breast cancer specimens that were analyzed by HER2 CISH pharmDx™ Kit and
the PathVysion HER-2 DNA Probe Kit (FISH). Specimens were consecutively collected and
the specimen pool was enriched with 60 IHC 2+ specimens as determined by HercepTest™
and analyzed at a US reference laboratory. Test results from 350 specimens were eligible for
statistical analysis, and the HercepTest™ IHC scores as well as their CISH HER2 gene status
are shown below in Table 2. A HER2/CEN-17 ratio below 2.0 indicates a non-amplified case
and a HER2/CEN-17 ratio above or equal to 2.0 indicates an amplified case.
(120946-003)
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Table 2. Cross tabulation of HercepTest™ IHC scores and CISH HER2 gene status
HercepTest IHC score
0
CISH HER2
gene status
non-amplified
amplified
Total
1+
2+
Total
3+
98
108
95
5
0
1
17
26
306
44
98
109
112
31
350
The overall agreement between HER2 status obtained by HER2 CISH pharmDx™ Kit and
PathVysion HER-2 DNA Probe Kit (FISH) was 97.7% as shown in Table 3. The positive and
negative agreement was 90.9% and 98.7%, respectively. McNemars test for a systematic bias
between the two tests was not significant (p=1.00).
Table 3. Cross tabulation of CISH HER2 gene status versus PathVysion FISH HER2 gene status
PathVysion FISH
HER2 gene status
non-amplified
CISH HER2
gene status
Total
non-amplified
amplified
Total
amplified
302
4
306
4
40
44
306
44
350
Overall agreement: (342/350 x 100) = 97.7%; (CI95 lower 95.7%; CI95 upper 98.9%)
Positive agreement: (40/44 x 100) = 90.9%; (CI95 lower 79.8%; CI95 upper 96.9%)
Negative agreement: (302/306 x 100) = 98.7%; (CI95 lower 96.9%; CI95 upper 99.6%)
Kappa: 0.90 (standard error 0.04)
In an exploratory analysis of the HER2/CEN-17 ratios obtained by the two methods the ratios
have been plotted (Figure 1).
Figure 1. Plot of HER2/CEN-17 ratios for Dako HER2 CISH pharmDx™ Kit and PathVysion
HER-2 DNA Probe Kit (FISH)
Linear regression of the logarithmically transformed HER2/CEN-17 ratios revealed a
correlation coefficient at 0.90 and a slope of 0.71.
(120946-003)
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Slide evaluation time
The average slide evaluation time for HER2 CISH pharmDx™ was 3:13 (min:sec) and for
PathVysion HER2 DNA Probe Kit (FISH) it was 4:02 (min:sec). In a paired, two tailed t-test the
mean difference in slide evaluation time was 0:49 (min:sec) which is significantly different from
zero (p<0.001).
CISH success rate
From a total of 364 CISH tests performed, 352 (96.7%) were successfully completed.
Prognostic value of HER2 CISH pharmDx™ Kit
To link the prognostic value of HER2 FISH pharmDx™ Kit to HER2 CISH pharmDx™ Kit their
concordance between test results was investigated. The prognostic value of HER2 FISH
pharmDx™ Kit was previously shown based on the data in the DBCG (Danish Breast Cancer
Cooperative Group) study 89D that analyzed HER2 status using Dako HER2 FISH pharmDx™
Kit. In the DBCG 89D study test results from 649 patient specimens were available for
multivariate analysis, 417 had a HER2/CEN-17 ratio below 2.0 (normal or non-amplified HER2
gene status) and 232 had a HER2/CEN-17 ratio above or equal to 2.0 (amplified HER2 gene
status).
From univariate analysis of the prognostic value of HER2 amplification in node-positive
patients (n=423) it was found that HER2 gene amplification as determined by HER2 FISH
pharmDx™ Kit had a significant prognostic value for overall survival (Figure 2).
Figure 2. Kaplan Meier curve showing overall survival (OS) depending on HER2 FISH amplification in
node-positive patients (n=423).
Further multivariate analysis revealed that HER2 FISH amplification had an independent
prognostic value in node-positive patients with a hazard ratio corresponding to HER2
amplification for overall survival at 1.40 (hazard ratio CI95 limits: 1.07-1.85), p=0.015.
The concordance between HER2 FISH pharmDx™ Kit and HER2 CISH pharmDx™ Kit assays
was investigated in a clinical study comprising 200 invasive breast cancer specimens. Test
results from 189 specimens were eligible for statistical analysis of HER2 status, and the cross
tabulation of HER2 status obtained by the two assays are presented below in Table 4. The
concordance data show an overall agreement between Dako FISH and CISH pharmDx™ Kit
assays of 97.9%, with positive and negative agreements at 92.6% and 98.8%, respectively.
Therefore, the data shows that the prognostic value of the HER2 FISH pharmDx™ Kit analysis
result can be acquired using the HER2 CISH pharmDx™ Kit assay.
(120946-003)
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Table 4. Cross tabulation of HER2 gene status obtained by HER2 CISH pharmDx™ Kit and HER2 FISH
pharmDx™ Kit.
Dako FISH HER2 status
non-amplified
Dako CISH
HER2 status
Total
non-amplified
amplified
Total
amplified
160
2
162
2
25
27
162
27
189
Overall agreement: (185/189 x 100) = 97.9%; (CI95 lower 95.0%; CI95 upper 99.3%)
Positive agreement: (25/27 x 100) = 92.6%; (CI95 lower 78.3%; CI95 upper 98.4%)
Negative agreement: (160/162 x 100) = 98.8%; (CI95 lower 96.1%; CI95 upper 99.7%)
Kappa: 0.91 (standard error 0.04)
(120946-003)
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Troubleshooting
Problem
Probable cause
Suggested Action
1. No signals or weak
signals
1a. Kit has been exposed to
high temperatures
during transport or
storage
1a. Check storage
conditions. Ensure that
dry ice was present
when Vial 2 (Pepsin)
was received. Ensure
that the cool packs were
cold when the kit was
received. Ensure that the
complete kit is stored at
maximum 2-8 °C in the
dark. Mounting medium
(Vial 13) should be
stored at room
temperature.
1b. Pre-treatment conditions
incorrect
1b. Ensure that the
recommended pretreatment temperature
and time are used.
1c. Ensure sufficient
humidity in the
hybridization chamber
1c. Evaporation of Probe
Mix during hybridization
1d. Microscope settings not
optimal
- Inadequate light
- Higher magnification
(40x or 60x
objectives)
1e. Red and/or Blue
Chromogen Solution are
not used within the
indicated time
1f. Automated staining
- Reagents are not
used in proper order
- Insufficient reagent
volume
- Inadequate incubation
times
- Wrong dropzone
1g. Drying of slides
(120946-003)
1d. Try different microscope
settings. In case of
doubt, contact your local
microscope vendor
1e. Prepared Red
Chromogen Solution
must be used within 20
minutes.
Blue Chromogen
Solution should be
prepared 30 minutes
before use and must be
used within 8 days
(when stored at 2-8 ºC in
the dark).
1f. Review Programming
Grid, slide layout and
Reagent Map prior to
commencing the run.
1g. Do not allow the tissue
sections to dry at any
time in the staining
procedure
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2. No blue signals
2a. Stringent wash
conditions incorrect
2b. Wrong dilution of Blue
Chromogen
2c. Problems with
preparation of Blue
Chromogen Solution
3. No red signals
3a. Pre-treatment conditions
incorrect
3b. Incorrect use of Red
Chromogen Solution
3c. Wrong dilution of Red
Chromogen
4. Areas without signal
4a. Probe volume too small
4b. Air bubbles caught
during Probe Mix
application or mounting
4c. Reagent volume too
small
4d. Air bubbles caught
during mounting
4e. Drop zone
(120946-003)
2a. Ensure that the
recommended stringent
wash temperature and
time are used, and that
coverslips are removed
before performing
stringent wash
2b. Prepare Blue
Chromogen Solution by
mixing 75 µL Blue
Chromogen (vial 12) in 1
mL Blue Substrate
Buffer (vial 10)
2c. Blue Chromogen (vial
12) was not mixed
before preparation of
Blue Chromogen
Solution
3a. Ensure that the
recommended pretreatment temperature
and time are used
3b. Prepared Red
Chromogen Solution
should be used within 20
minutes (including
incubation time)
3c. Prepare Red
Chromogen Solution by
mixing 10 µL Red
Chromogen (vial 11) in 1
mL Red Substrate
Buffer (vial 9)
4a. Ensure that the probe
volume is large enough
to cover the area under
the coverslip
4b. Avoid air bubbles. If
observed, gently tap
them away using
forceps
4c. Ensure that the reagent
volume is large enough
to cover the tissue area
4d. Avoid air bubbles. Use
the mounting medium
supplied with the kit.
4e. Make sure dropzone is
aligned with location of
tissue section. Use two
dropzones (1 and 3)
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5. Excessive background
staining
5a. Inappropriate tissue
fixation
5b. Paraffin incompletely
removed
5c. Stringent wash
temperature too low
5d. Evaporation of Probe
Mix during hybridization
5e. Slides not thoroughly
rinsed
5f. Sections dried during
manual staining
procedure
5g. Sections dried while
loading the Autostainer
5h. Sections dried during
automated staining
procedure
6. Poor tissue morphology
(120946-003)
6a. Incorrect Pepsin
treatment
5a Ensure that only
formalin-fixed, paraffinembedded tissue
sections are used
5b. Follow the
deparaffinization and
rehydration procedures
outlined in Section B.2
5c. Ensure that the stringent
wash temperature is
65 (±2) °C
5d. Ensure sufficient
humidity in the
hybridization chamber.
Use humidity control
strips
5e. Use fresh wash buffer.
Ensure that the
Autostainer is properly
primed prior to running.
Check to make sure that
adequate buffer is
provided for entire run
5f. Use humidity chamber.
Wipe only three to four
slides at a time before
applying reagent
5g. Ensure sections remain
wet with buffer while
loading and prior to
initiating run
5h. Verify that the
appropriate volume of
reagent is applied to
slides. Make sure that
the Autostainer is run
with fume hood in the
closed position and is
not exposed to
excessive heat.
6a. Adhere to recommended
Pepsin incubation times.
See section B.3, step 2.
Ensure that Pepsin is
handled at the correct
temperature. See
Section B.1.
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6b. Overdigested tissue
7.
The hematoxylin
counterstaining makes it
difficult to see the
specific HER2 and CEN17 signals
8.
Excessive strong
specific staining
(120946-003)
6c. Incorrect pre-treatment
conditions may result in
unclear or cloudy
appearance
6b. Shorten the pepsin
incubation time in the
Dako FISH staining
procedure. For neutral
buffered formalin (24
hours) and paraffinembedded tissue 2
minutes pepsin
incubation at 37 °C is a
good starting point.
There is a balance
between tissue
morphology and signal
intensity/quality that the
user should be aware of
when making a pepsin
gradient in the FISH
procedure as both
under- and
overdigestion of tissue
specimens has an
effect on signal
intensity/quality.
6c. Ensure that the
recommended pretreatment temperature
and time are used
6d. Too long Pepsin
treatment or very thin
section thickness may
cause ghost cells or
donut cells to appear.
7a. Hematoxylin
counterstaining too
strong
6d. Shorten Pepsin
incubation time. See
section B.3, step 2.
Ensure that the section
thickness is 4-6 µm.
7a. Further dilution of
hematoxylin or shorter
incubation time needed
8a. Reagent incubation time
too long
8b. Inappropriate wash
solution used
8a. Review staining
procedure instructions
8b. Use only Wash Buffer
recommended with the
kit (Wash buffer 2,
supplied with the kit or
Dako Wash Buffer,
Code S3006)
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Appendix 1
HER2 CISH pharmDxTM Kit, Code SK109
Protocol Checklist
Staining Run Log ID: _________________
Date (day 1) of the run: ______________
HER2 CISH pharmDx™ Kit, SK109 Lot: _____________
Specimen ID(s):_________________________________________________________
Equipment ID(s):_________________________________________________________
Tissue fixed in neutral buffered formalin
Yes
No
Date of dilution/expiration of the 1 x Wash Buffer 1 (Vial 5 diluted 1:20)
/
Date of dilution/expiration of the 1 x Wash Buffer 2 (Vial 6 diluted 1:10)
/
DAY 1
Step 1: Pre-treatment
Date of dilution/expiration of Pre-Treatment Solution (Vial 1 diluted 1:20)
Measured temperature of Pre-Treatment Solution (95-99 °C) if water bath
(method A) is used for heating
If microwave oven (method B) is used, mark with a dash
Pre-treatment (10 minutes), and cooling (15 minutes)
Wash in Wash Buffer 1 (Vial 5 diluted 1:20) (2 x 3 minutes)
Step 2: Pepsin
Duration of Pepsin (Vial 2) treatment at 37 ºC or
Duration of Pepsin (Vial 2) treatment at room temperature
Wash in Wash Buffer 1 (Vial 5 diluted 1:20) (2 x 3 minutes)
Dehydrate slides (3 x 2 minutes) in graded series of ethanol and air dry
Step 3: HER2/CEN-17 Probe Mix
Apply Probe Mix (Vial 3), coverslip and seal with Coverslip Sealant
Measured denaturation temperature (82 °C) if equipm ent other than Dako
Hybridizer is used
Denaturation for 5 minutes
Measured hybridization temperature (45 °C) if equip ment other than Dako
Hybridizer is used
Hybridization overnight (protect from light)
DAY 2
Step 4: Stringent Wash
Date of dilution/expiration of the Stringent Wash Buffer (Vial 4 diluted 1:20)
Measured temperature of Stringent Wash Buffer (65 °C)
Stringent wash (10 minutes) after removing the coverslip
Wash in Wash Buffer 1 (Vial 5 diluted 1:20) (2 x 3 minutes)
Step 5: Peroxidase Block
Wash in Wash Buffer 2 (Vial 6 diluted 1:10) (3 minutes)
Peroxidase block (Vial 7) for 5 minutes
(120946-003)
/
ºC
Minutes
Minutes
ºC
ºC
Hours
/
ºC
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Wash in Wash Buffer 2 (Vial 6 diluted 1:10) (2 x 3 minutes)
Step 6: CISH Antibody Mix
CISH Antibody Mix (Vial 8) for 30 minutes
Wash in Wash Buffer 2 (Vial 6 diluted 1:10) (2 x 3 minutes)
Step 7: Red Chromogen Solution
Mix Red chromogen solution from Red Substrate buffer (Vial 9) and Red
chromogen (Vial 11). Should be used within 20 minutes
Red Chromogen Solution for 10 minutes
Wash in Wash Buffer 2 (Vial 6 diluted 1:10) (2 x 3 minutes)
Step 8: Blue Chromogen Solution
Mix Blue Chromogen Solution from Blue Substrate buffer (Vial 10) and
Blue Chromogen (Vial 12). Should be prepared 30 minutes prior to use
and used within 8 days (when stored at 2-8 ºC in the dark)
Blue Chromogen Solution for 10 minutes
Wash in Wash Buffer 2 (Vial 6 diluted 1:10) (2 x 3 minutes)
Step 9: Counterstain
Hematoxylin counterstain for 5 min (not provided with the Kit. 1:5 dilution
of Dako Hematoxylin, Code S3301 in deionized water)
Rinse in Wash Buffer 2 (Vial 6 diluted 1:10)
Wash in Wash Buffer 2 (Vial 6 diluted 1:10) (5 minutes)
Rinse thoroughly with deionized water
Step 10: Mounting
Dry for 30 minutes at 37 º C, cool to room temperature, then
Apply Mounting medium (Vial 13) and coverslip
Wait at least 30-60 minutes before inspection
Comments:__________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________________
__________________________________________________________________________________
Date and signature, Technician:
(120946-003)
SK109/EFG/JEN/2013.03 p. 31/96
Appendix 2
HER2 CISH pharmDx™ Kit, Code SK109
Scoring Scheme
Staining Run Log ID: ___________
Date (day 1) of the run: ______________
HER2 CISH pharmDx™ Kit, SK109 Lot: ________
Specimen ID(s):__________
Count signals in 20 nuclei
Nucleus
No.
HER2
score
(red)
CEN-17
score
(blue)
Nucleus
No.
1
11
2
12
3
13
4
14
5
15
6
16
7
17
8
18
9
19
10
20
Total (1-10)
Total (11-20)
HER2
score
(red)
CEN-17
score
(blue)
For determination of the HER2/CEN-17 ratio, count the number of HER2 signals and the
number of CEN-17 signals in the same 20 nuclei and divide the total number of HER2 signals
by the total number of CEN-17 signals. If the HER2/CEN-17 ratio is borderline (1.8-2.2), count
an additional 20 nuclei and recalculate the ratio.
A ratio at or near the cut-off (1.8-2.2) should be interpreted with caution (see counting guide).
HER2
CEN-17
HER2/CEN-17 ratio
Total score (1-20)
Ratio < 2: HER2 gene amplification was not observed
Ratio ≥ 2: HER2 gene amplification was observed
Date and signature, Technician:
Date and signature, Pathologist:
For scoring guidelines: See Interpretation of Staining
(120946-003)
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FRANÇAIS
Utilisation prévue
Pour usage diagnostique in vitro
Le kit HER2 CISH pharmDx™ est destiné à la visualisation chromogénique double couleur de
signaux obtenus à l’aide de sondes d’hybridation in situ directement marquées ciblant le gène
HER2 et la région centromérique du chromosome 17. Ce kit est conçu pour déterminer de
manière quantitative le statut du gène HER2 dans des échantillons de tissus de cancer du sein
fixés au formol et inclus en paraffine. Des signaux chromogéniques rouges et bleus sont produits
sur la même coupe de tissus et ils seront évalués au microscope optique. La procédure CISH
peut être effectuée manuellement ou de manière automatisée en utilisant les appareils Dako
Autostainer.
L’utilisation du kit HER2 CISH pharmDx™ est indiquée comme aide à l’évaluation des
patients chez lesquels un traitement par Herceptin™ (trastuzumab) est envisagé. Les résultats
obtenus avec le kit HER2 CISH pharmDx™ sont à utiliser en complément des informations
pathologiques et cliniques actuellement utilisées pour évaluer un pronostic chez les patients
atteints d’un cancer du sein de stade II, à ganglions positifs.
Résumé et explication
Le gène humain HER2 (également connu sous le nom de ERBB2 ou NEU) est situé sur le
chromosome 17 et code pour la protéine HER2 ou p185HER2. La protéine HER2 est un récepteur
membranaire à activité tyrosine kinase possédant une homologie avec le récepteur du facteur
de croissance épidermique (EGFR ou HER1) (1-2). Le gène HER2 est présent en
2 copies dans toutes les cellules diploïdes normales.
Chez certains patients atteints d’un cancer du sein, le gène HER2 est amplifié ; ceci faisant
partie du processus de transformation maligne et de progression de la tumeur (3-8).
L’amplification du gène HER2 entraîne généralement une surexpression de la protéine HER2
à la surface des cellules de cancer du sein (9).
L’amplification du gène HER2 et/ou la surexpression de sa protéine ont été montrées dans
25 à 30 % des cas de cancer du sein. Cette régulation en amont est associée à un mauvais
pronostic, à un risque accru de récidive et à une survie globale écourtée. Plusieurs études ont
montré que le statut de HER2 est en corrélation avec la sensibilité ou la résistance à certains
régimes de chimiothérapie (10).
La mise en évidence d’une forte surexpression de la protéine HER2 ou de l’amplification
du gène HER2 est essentielle à l’instauration d’un traitement par Herceptin™, un anticorps
monoclonal dirigé contre la protéine HER2. Des études cliniques ont montré que ce sont les
patients atteints de tumeurs dans lesquelles la protéine HER2 est surexprimée et/ou le gène
HER2 est amplifié qui bénéficient le plus d’un traitement par Herceptin™ (11).
Principe de la procédure
Le kit HER2 CISH pharmDx™ contient tous les réactifs nécessaires à la réalisation d’une
procédure CISH sur des échantillons de coupes de tissus fixées au formol et incluses en
paraffine (à l’exception de l’hématoxyline pour la contre-coloration).
Après déparaffinage et réhydratation, les échantillons sont chauffés dans une solution de
prétraitement pendant 10 minutes. L’étape suivante implique une digestion protéolytique
utilisant de la pepsine prête à l’emploi soit à température ambiante soit à 37 °C. Le temps
d’incubation optimal de la pepsine dépend des antécédents de fixation du tissu et doit être
déterminé par l’utilisateur mais 8 minutes à température ambiante ou 2 minutes à 37 °C
conviennent pour la plupart des échantillons. Après les étapes de chauffage et de digestion
(120946-003)
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protéolytique, ce kit utilise un mélange de sondes FISH prêt à l’emploi basé sur l’association
des technologies PNA (Peptide Nucleic Acid en anglais) (12) et ADN. Ce mélange de sondes
est composé d’un mélange de sondes ADN marquées au Texas Red couvrant une région de
218 kb incluant le gène HER2 sur le chromosome 17, et d’un mélange de sondes PNA
marquées à la fluorescéine ciblant la région centromérique du chromosome 17 (CEN-17).
L’hybridation spécifique sur ces deux cibles entraîne la formation d’un signal fluorescent rouge
net au niveau de chaque locus du gène HER2 et d’un signal fluorescent vert net au niveau de
chaque centromère du chromosome 17. Afin d’atténuer la coloration de fond, le mélange de
sondes contient également des sondes de blocage PNA non marquées. Après un lavage
stringent et un rinçage dans deux tampons de lavage différents, les signaux des sondes
fluorescentes sont convertis en signaux chromogéniques à l’aide d’une procédure de
coloration immunohistochimique. La première étape consiste à bloquer la peroxydase
endogène à l’aide d’un agent de blocage de la peroxydase prêt à l’emploi, suivi par l’incubation
du mélange d’anticorps pour CISH prêt à l’emploi, composé d’un anticorps anti-FITC conjugué
à de la peroxydase de raifort (HRP) et d’un anticorps anti-Texas Red conjugué à de la
phosphatase alcaline (AP). Ensuite les échantillons de tissus sont incubés avec une solution
de chromogène rouge, suivi par une incubation avec une solution de chromogène bleu. La
conversion enzymatique des chromogènes ajoutés se traduit par la formation de produits
visibles rouges et bleus sur les sites antigéniques (sondes FISH). Ainsi, les signaux à
fluorescence rouge sont convertis en signaux chromogéniques rouges et les signaux à
fluorescence verte sont convertis en signaux chromogéniques bleus. Les échantillons sont
ensuite contre-colorés et recouverts d’une lamelle de protection. Les résultats sont évalués à
l’aide d’un microscope optique.
Le composant invasif des cellules tumorales est localisé et une numération des signaux
rouges (HER2) et bleus (CEN-17) est effectuée à l’aide d’un microscope optique. Le rapport
HER2/CEN-17 est ensuite calculé. Les cellules normales présentes dans la coupe de tissus
analysée servent de contrôle positif interne de l’efficacité du prétraitement et de l’hybridation.
Pour plus de détails, voir la section Interprétation de la coloration.
Réactifs
Matériel fourni
Le matériel répertorié ci-dessous est suffisant pour effectuer 20 tests (un test est défini comme
une zone cible de 22 mm x 22 mm). Le nombre de tests indiqué est basé sur l’utilisation de 5 à
8 gouttes (250 µL par lame) pour le flacon 2, 10 µL par lame pour le flacon 3, 400 µL par lame
pour les flacons 7 et 8, et 400 µL de chromogène rouge (flacon 11) et de chromogène bleu
(flacon 12) dilués dans leurs tampons substrat respectifs (flacons 9 et 10). Les quantités
contenues dans ce kit permettent d’effectuer 20 tests en 10 cycles de coloration individuels.
Pour les colorations sur la plate-forme Dako Autostainer Link, les quantités contenues dans ce
kit permettent d’effectuer 20 tests en 5 cycles de coloration individuels.
Le kit HER2 CISH pharmDx™ est livré sous la forme de deux articles distincts ; le flacon 2
(pepsine) SK109 est livré dans une boîte distincte et les autres réactifs dans la boîte composant
le kit. Le flacon 2 (pepsine) SK109 est livré avec de la carboglace et la boîte composant le kit
est, quant à elle, livrée avec des pains de glace. Pour être sûr que le flacon 2 (pepsine) n’a
pas été exposé à des températures élevées pendant le transport, il doit rester de la
carboglace dans le colis à la réception.
Flacon 1
Solution de prétraitement (20x)
150 mL, concentré 20x
Tampon MES (acide 2-[N-morpholino]éthanesulphonique).
(120946-003)
SK109/EFG/JEN/2013.03 p. 34/96
Flacon 2
Pepsine
7,5 mL, prêt à l’emploi
Solution de pepsine, pH 2,0 ; contient un stabilisateur et un
agent antimicrobien.
Flacon 3
Mélange de sondes HER2/CEN-17
200 µL, prêt à l’emploi
Mélange de sondes ADN HER2 marquées au Texas Red et
de sondes PNA CEN-17 marquées à la fluorescéine ; fourni
dans un tampon d’hybridation avec 45 % de formamide, un
stabilisateur et des sondes de blocage PNA non marquées.
Flacon 4
Tampon de lavage stringent (20x)
150 mL, concentré 20x
Tampon SSC (solution saline/citrate de sodium) avec un
détergent.
Flacon 5
Tampon de lavage 1 (20x)
500 mL, concentré 20x
Tampon Tris/HCl.
Flacon 6
Tampon de lavage 2 (10x)
1 L, concentré 10x
Solution saline de tampon Tris contenant du Tween 20 à
0,05 %.
Flacon 7
Agent de blocage de la peroxydase
9 mL, prêt à l’emploi. Peroxyde d’hydrogène à 3 %
contenant 15 mmol/L d’azide de sodium (NaN3).
Flacon 8
Mélange d’anticorps pour CISH
9 mL, prêt à l’emploi.
Mélange d’anticorps anti-fluorescéine conjugué à de la
peroxydase de raifort et d’anticorps anti-Texas Red
conjugué à de la phosphatase alcaline ; fourni dans du
tampon Tris à 50 mmol/L avec un stabilisateur, un agent de
conservation, pH 7,5.
Flacon 9
Tampon substrat rouge
12 mL, tampon substrat pour la dilution du chromogène
rouge.
Flacon 10
Tampon substrat bleu
12 mL, tampon substrat pour la dilution du chromogène
bleu.
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Flacon 11
Chromogène rouge
120 µL, à diluer dans le tampon substrat rouge (flacon 9).
Flacon 12
Chromogène bleu
2 x 550 µL, à diluer dans le tampon substrat bleu
(flacon 10).
Flacon 13
Milieu de montage CISH
5 mL, milieu de montage permanent sans alcool ni xylène
Étanchéisant pour lamelle
1 tube, prêt à l’emploi
Solution pour un vernissage supprimable des lamelles.
Flacons à réactifs, à remplir par l’utilisateur
Capacité de 5 mL, 6 flacons*
Capacité de 12 mL, 2 flacons**
À utiliser sur les plates-formes Dako Autostainer Link
* Pour effectuer plus de 4 colorations distinctes, des flacons supplémentaires seront nécessaires.
** Les flacons de 12 mL sont nécessaires si l’ensemble des 20 tests doivent être effectués en un
seul cycle de coloration.
Matériel requis mais non fourni
Réactifs de laboratoire :
Eau distillée ou déionisée
Éthanol à 96 %
Xylène ou substituts du xylène
Dako Hematoxylin, réf. S3301
Flacons à réactifs, à remplir par l’utilisateur : 12 mL (réf. SK201) ou 5 mL (réf. SK200 pour
l’hématoxyline diluée)
Équipement de laboratoire :
Chiffon non pelucheux
Pipettes réglables
Thermomètre à immersion partielle étalonné (plage de température de 37 à 100 °C)
Thermomètre de surface étalonné (plage de température de 37 à 100 °C)***
Lamelles de protection (22 mm x 22 mm pour 10 µL d’hybridation et par ex. 50 mm x 24 mm
pour le montage)
Pince
Hotte de laboratoire
Dako Hybridizer (réf. S2450 ou S2451)* + bandelettes de contrôle de l’humidité Humidity
Control Strips (réf. S2452)*
Chambre humide
Lames silanisées Dako Silanized Slides, réf. S3003 ou lames revêtues de poly-L-lysine
(voir la section Préparation des échantillons)
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Cuves ou bains de coloration
Agitateur vortex (ou équivalent) et centrifugeuse de paillasse
Minuteur (pouvant accepter des intervalles de 2 à 30 minutes)
Bain-marie avec couvercle (pouvant maintenir une température comprise entre
65 (±2) °C et 99 °C)
Four à micro-ondes avec fonction de détection si le prétraitement est réalisé à l’aide d’un four
à micro-ondes (voir la section B3. Protocole de coloration, Étape 1 : Prétraitement, Méthode B)
Microscope optique
*** Un bloc chauffant ou une étuve d’hybridation pour la dénaturation (82 (±2) °C) et l’hybridation (4 5 (±2) °C),
associés à une chambre humide, peuvent être utilisés en remplacement du Dako Hybridizer.
Matériel supplémentaire requis pour effectuer une coloration automatisée sur les
appareils Dako Autostainer/Autostainer Plus :
Flacons à réactifs Autostainer Reagent Vials (réf. S3425)
Précautions
1.
2.
Pour usage diagnostique in vitro.
Pour utilisateurs professionnels.
3.
Le flacon 1, solution de prétraitement (20x), contient de 1 à <20 % d’acide
2-morpholinoéthanesulphonique et le flacon 2, pepsine, contient de 5 à 10 % de propan-2ol.
Le flacon 4, tampon de lavage stringent (20x), contient de 1 à <5 % d’octoxinol.
4.
5.
6.
Le flacon 5, tampon de lavage 1 (20x), contient de 1 à <20 % de trométamol.
Le flacon 7, agent de blocage de la peroxydase, contient de l’azide de sodium.
Aux concentrations du produit, ces substances ne nécessitent pas d’étiquetage de
sécurité. Les fiches de données de sécurité (FDS) destinées aux utilisateurs
professionnels sont disponibles sur demande.
Le flacon 2, pepsine, contient de la pepsine A qui peut provoquer une réaction allergique.
Le flacon 3, mélange de sondes HER2/CEN-17 contient 45 % de formamide et comporte
les mentions suivantes :
Toxique.
R61 Risques pendant la grossesse d’effets néfastes pour l’enfant.
S45 En cas d’accident ou de malaise, consulter immédiatement un médecin
(si possible, lui montrer l’étiquette).
S53 Éviter l’exposition – se procurer des instructions spéciales avant l’utilisation.
S60 Éliminer le produit et son récipient comme un déchet dangereux.
D’une manière générale, les personnes âgées de moins de 18 ans ne sont pas autorisées
à manipuler ce produit. Les utilisateurs doivent avoir été soigneusement formés à la
procédure opérationnelle correcte, et informés des propriétés dangereuses du produit et
des consignes de sécurité requises.
Se reporter à la fiche de données de sécurité (FDS) pour plus d’informations.
L’étanchéisant pour lamelle contient de 60 à 100 % de naphta léger (pétrole), hydrotraité,
et comporte les mentions suivantes :
Extrêmement inflammable.
Dangereux pour l’environnement.
R11 Facilement inflammable.
R51/53 Toxique pour les organismes aquatiques, peut entraîner des effets néfastes à
long terme pour l’environnement aquatique.
S9 Conserver le récipient dans un endroit bien ventilé.
S16 Conserver à l’écart de toute flamme ou source d’étincelles - Ne pas fumer.
S35 Ne se débarrasser de ce produit et de son récipient qu’en prenant toutes les
précautions d’usage.
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7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
S57 Utiliser un récipient approprié pour éviter toute contamination du milieu ambiant.
S61 Éviter le rejet dans l’environnement. Consulter les instructions spéciales/la fiche de
données de sécurité. Se reporter à la fiche de données de sécurité (FDS) pour plus
d’informations.
Le flacon 7, agent de blocage de la peroxydase, contient de l’azide de sodium (NaN3),
produit chimique hautement toxique dans sa forme pure. Aux concentrations du produit, bien
que non classé comme dangereux, l’accumulation de NaN3 peut réagir avec le cuivre et le
plomb des canalisations et former des azides métalliques hautement explosives. Lors de
l’élimination, rincer abondamment à l’eau pour éviter toute accumulation d’azide dans
les canalisations.
Le flacon 11, chromogène rouge, contient du Fast Red KL Salt et comporte les
mentions suivantes :
Toxique
R45 Peut causer le cancer.
S35 Ne se débarrasser de ce produit et de son récipient qu’en prenant toutes les
précautions d’usage.
S45 En cas d’accident ou de malaise, consulter immédiatement un médecin (si possible,
lui montrer l’étiquette).
S53 Éviter l’exposition – se procurer des instructions spéciales avant l’utilisation.
D’une manière générale, les personnes âgées de moins de 18 ans ne sont pas autorisées
à manipuler ce produit. Les utilisateurs doivent avoir été soigneusement formés à la
procédure opérationnelle correcte, et informés des propriétés dangereuses du produit et
des consignes de sécurité requises (conformément à la directive 94/33/CE de l’Union
européenne).
Se reporter à la fiche de données de sécurité (FDS) pour plus d’informations.
Le flacon 12, chromogène bleu, contient du 5-amino-2-[3-[5-amino-1,3-dihydro-3,3diméthyl-1-(4-sulfobutyl)-2H-indol-2-ylidène]-1-propényl]-3,3-diméthyl-1-(4-sulfobutyl)-3HIndolium, ter trifluoroacétate.
Attention : ce produit contient une substance qui n’a pas encore été testée intégralement.
D’une manière générale, les personnes âgées de moins de 18 ans ne sont pas autorisées à
manipuler ce produit.
Les utilisateurs doivent avoir été soigneusement formés à la procédure opérationnelle
correcte, et informés des propriétés dangereuses du produit et des consignes de sécurité
requises (conformément à la directive 94/33/CE de l’Union européenne).
Se reporter à la fiche de données de sécurité (FDS) pour plus d’informations.
Flacon 13, milieu de montage.
La fiche de données de sécurité destinée aux utilisateurs professionnels est disponible sur
demande.
Les échantillons, avant et après fixation, ainsi que tout le matériel ayant été en contact
avec ceux-ci, doivent être manipulés comme s’ils étaient susceptibles de transmettre une
infection, et être éliminés en prenant toutes les précautions nécessaires (13). Ne jamais
pipeter les réactifs à la bouche et éviter tout contact de la peau et des muqueuses avec
les réactifs et les échantillons. Si les réactifs entrent en contact avec des zones sensibles,
laver abondamment à l’eau.
Minimiser tout risque de contamination microbienne des réactifs afin d’éviter des
résultats erronés.
Toute modification des durées et des températures d’incubation ou des méthodes
spécifiées est susceptible d’entraîner des résultats erronés.
Toute modification des méthodes de fixation des tissus et de l’épaisseur des échantillons
spécifiées peut affecter la morphologie tissulaire et/ou l’intensité du signal.
Éviter l’évaporation du mélange de sondes HER2/CEN-17 pendant l’hybridation en
assurant une humidité suffisante dans la chambre d’hybridation.
Les réactifs ont été dilué de manière optimale. Une dilution supplémentaire peut entraîner
une perte des performances.
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17. Les solutions non utilisées doivent être éliminées conformément aux réglementations
locales et nationales.
18. Porter un équipement de protection approprié pour éviter tout contact avec les yeux et la
peau. La fiche de données de sécurité (FDS) destinée aux utilisateurs professionnels est
disponible sur demande.
19. Il est recommandé de suivre la procédure standard en ce qui concerne toute réparation et
tout entretien de l’appareil Dako Autostainer.
20. Les personnes atteintes de dyschromatopsie doivent évaluer les échantilons avec
précautions.
21. Comme avec tout produit d’origine biologique, respecter les procédures de manipulation
appropriées.
22. Avant de préparer la solution de chromogène bleu, le chromogène bleu (flacon 12) doit
être soigneusement mélangé afin d’assurer sa dissolution complète.
23. Il est recommandé d’utiliser deux zones de dépôt de 200 µL chacune (1 et 3) sur l’appareil
Dako Autostainer pour recouvrir complètement la lame et empêcher le dessèchement des
larges coupes de tissus.
Conservation
Le kit HER2 CISH pharmDx™ est livré sous la forme de deux articles distincts ; le flacon 2
(pepsine) SK109 est livré dans une boîte distincte et les autres réactifs dans la boîte composant
le kit. Le flacon 2 (pepsine) SK109 est livré avec de la carboglace et la boîte composant le kit
est, quant à elle, livrée avec des pains de glace. Pour être sûr que le flacon 2 (pepsine) n’a
pas été exposé à des températures élevées pendant le transport, il doit rester de la
carboglace dans le colis à la réception.
Conserver tous les réactifs du kit entre 2 et 8 °C, à l’exception du flacon 13 (milieu de montage
CISH). Le flacon 13 (milieu de montage CISH) doit être conservé à température ambiante.
Les flacons 3, 7 et 8 doivent être conservés entre 2 et 8 °C à l’abri de la lumière.
La pepsine et le chromogène rouge (flacons 2 et 11) peuvent être affectés en cas d’exposition
à la chaleur. Ne pas laisser ces composants à température ambiante.
Ne pas utiliser le kit après la date de péremption indiquée sur la boîte. Si les réactifs sont
conservés dans des conditions autres que celles spécifiées dans cette notice, les performances
des réactifs doivent être validées par l’utilisateur (14).
Aucun signe évident n’indique l’instabilité de ce produit. Par conséquent, il est important
d’évaluer les cellules normales dans la coupe de tissus analysée. Si un profil de coloration
inattendu est observé, ne pouvant être expliqué par un changement des procédures du
laboratoire et en cas de suspicion d’un problème avec le kit HER2 CISH pharmDx™,
contacter notre service technique.
Préparation des échantillons
Les échantillons provenant de biopsies, d’excisions ou de résections doivent être manipulés de
manière à préserver le tissu pour l’analyse CISH. Des méthodes standard de traitement des tissus
pour la coloration immunohistochimique doivent être utilisées pour tous les échantillons (15).
Coupes incluses en paraffine
Seuls les tissus préservés dans du formol neutre tamponné et inclus en paraffine conviennent
à cet usage. Les échantillons doivent, par exemple, être inclus dans des blocs d’une épaisseur
de 3 à 4 mm et être fixés pendant 18 à 24 heures dans du formol neutre tamponné. Les tissus
sont ensuite déshydratés dans une série de bains d’éthanol et de xylène à des concentrations
de plus en plus élevées, pour être ensuite infiltrés avec de la paraffine liquide maintenue à une
température ne dépassant pas 60 °C. Les tissus, fix és et inclus correctement, se conservent
indéfiniment avant la coupe et le montage sur lame s’ils sont conservés dans un endroit frais
(15 à 25 °C) (15-16). D’autres fixateurs ne convien nent pas.
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L’épaisseur des coupes d’échantillons tissulaires doit être comprise entre 4 et 6 µm.
Il est recommandé de monter les coupesde tissus sur des lames silanisées Dako Silanized
Slides, réf. S3003 ou sur des lames revêtues de poly-L-lysine. Les échantillons doivent être
analysés dans les 4 à 6 mois suivant la coupe lorsqu’ils sont conservés à température ambiante
(20 à 25 °C).
INSTRUCTIONS D’UTILISATION
A. Préparation des réactifs
Il est pratique de préparer les réactifs suivants avant de procéder à la coloration :
1er jour, Hybridation des sondes :
A.1 Solution de prétraitement
Des cristaux peuvent se former dans le flacon 1, mais ils se dissolvent à température
ambiante. S’assurer qu’il n’y a pas de cristaux avant de préparer le réactif.
Préparer une quantité suffisante à partir du flacon 1 (solution de prétraitement 20x) en diluant
le concentré au 1/20ème dans de l’eau distillée ou déionisée. La solution diluée inutilisée peut
être conservée entre 2 et 8 °C pendant un mois. Jet er la solution diluée si elle a un aspect
trouble.
A.2 Tampon de lavage stringent
Préparer une quantité suffisante à partir du flacon 4 (tampon de lavage stringent 20x) en
diluant le concentré au 1/20ème dans de l’eau distillée ou déionisée. Le tampon dilué inutilisé
peut être conservé entre 2 et 8 °C pendant un mois. Jeter le tampon dilué s’il a un aspect
trouble.
A.3 Tampon de lavage 1
Préparer une quantité suffisante à partir du flacon 5 (tampon de lavage 1 20x) en diluant le
concentré au 1/20ème dans de l’eau distillée ou déionisée. Le tampon dilué inutilisé peut être
conservé entre 2 et 8 °C pendant un mois. Jeter le tampon dilué s’il a un aspect trouble.
A.4 Série de bains d’éthanol
À partir d’une solution d’éthanol à 96 %, préparer 3 cuves contenant de l’éthanol à 70 %,
à 85 % et à 96 % respectivement. Conserver les cuves recouvertes d’un couvercle à
température ambiante ou entre 2 et 8 °C et les util iser pour un maximum de 200 lames.
Jeter les solutions si elles ont un aspect trouble.
2ème jour, Coloration immunohistochimique :
Tous les réactifs liés à la coloration immunohistochimique (flacons 6 à 13), sauf le
chromogène rouge (flacon 11), doivent être ramenés à température ambiante (20-25 °C)
avant la préparation des réactifs. Les réactifs doivent être protégés de la lumière alors
qu’ils sont ramenés à température ambiante.
A.5 Tampon de lavage 2
Diluer une quantité suffisante de tampon de lavage 2 (flacon 6) (1/10ème) dans de l’eau
distillée ou déionisée pour la procédure de coloration prévue. La solution diluée inutilisée peut
être conservée entre 2 et 8 °C pendant un mois. Jet er la solution si elle a un aspect trouble.
Le tampon de lavage 2 est interchangeable avec le tampon de lavage Dako Wash Buffer,
réf. S3006.
A.6 Solution de chromogène rouge
Avant de prélever un aliquot de chromogène rouge dans le flacon 11, retourner ou bien
mélanger la solution et centrifuger brièvement. Préparer une quantité suffisante de solution de
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chromogène rouge (en préparer au moins 1 mL). La proportion est de 10 µL par 1 mL et la
procédure suivante permet d’obtenir 1,01 mL de solution de chromogène rouge :
Transférer 1 mL de tampon substrat rouge du flacon 9 dans un flacon vide approprié. Ajouter
10 µL de chromogène rouge du flacon 11. Bien mélanger.
Remarque : la solution de chromogène rouge ainsi préparée doit être utilisée dans les
20 minutes. Pour de meilleurs résultats, préparer la solution de chromogène rouge
immédiatement avant de l’utiliser.
A.7 Solution de chromogène bleu
Avant de prélever un aliquot de chromogène bleu dans le flacon 12, mélanger soigneusement
le chromogène et centrifuger brièvement pour éliminer tout liquide présent dans le bouchon.
Ensuite, poursuivre immédiatement avec la préparation de la solution de chromogène bleu.
Préparer une quantité de solution de chromogène bleu suffisante pour réaliser le cycle
au complet.
Pour préparer 1,075 mL de solution de chromogène bleu, transférer 1 mL de tampon substrat
bleu du flacon 10 dans un flacon vide approprié. Ajouter 75 µL de chromogène bleu
soigneusement mélangé du flacon 12. Bien mélanger.
Si un plus petit volume de solution de chromogène bleu est nécessaire, réduire les
composants proportionnellement – c’est-à-dire pour préparer 430 µL de solution de
chromogène bleu, ajouter 30 µL de chromogène bleu soigneusement mélangé du flacon
12 à 400 µL de tampon substrat bleu du flacon 10.
Remarque : il est recommandé de préparer la solution de chromogène bleu au moins
30 minutes avant de l’utiliser. La solution de chromogène bleu doit être utilisée dans les
8 jours (lorsque conservée entre 2 et 8 ºC à l’abri de la lumière).
A.8 Contre-colorant
Diluer une quantité suffisante d’hématoxyline Dako Hematoxylin (réf. S3301) au 1/5ème dans
de l’eau distillée ou déionisée pour la procédure de coloration prévue. L’hématoxyline diluée
inutilisée peut être conservée à température ambiante (20-25 °C) pendant une journée.
B. Procédure de coloration
B.1 Remarques concernant la procédure
L’utilisateur doit lire attentivement les présentes instructions et se familiariser avec tous les
composants avant utilisation (voir la section Précautions).
Tous les réactifs doivent être ramenés à la bonne température comme suit avant d’être
utilisés :
Flacon 1 :
Flacon 2 :
Flacon 3 :
Flacon 4 :
Flacon 5 :
(120946-003)
La solution de prétraitement diluée doit être ramenée à 95-99 °C si un bain-marie
est utilisé pour le prétraitement (B3. Protocole de coloration, Étape 1 :
Prétraitement, Méthode A). Si un four à micro-ondes avec fonction de détection
est utilisé pour le prétraitement (B3. Protocole de coloration, Étape 1 :
Prétraitement, Méthode B), la solution de prétraitement diluée doit être ramenée
à température ambiante 20-25 °C.
La pepsine doit être constamment maintenue froide entre 2 et 8 °C.
Le mélange de sondes HER2/CEN-17 peut être appliqué à n’importe quelle
température comprise entre 2 et 25 °C.
Le tampon de lavage stringent dilué doit être ramené à température ambiante et
à 65 (±2) °C respectivement avant utilisation.
Le tampon de lavage 1 dilué doit être ramené à température ambiante 20-25 °C.
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Flacon 6 :
Le tampon de lavage 2 (10x) doit être ramené à température ambiante 20-25 °C
avant dilution dans de l’eau distillée ou déionisée ramenée elle aussi à
températeure ambiante.
Flacon 7 : L’agent de blocage de la peroxydase doit être ramené à température ambiante
20-25 °C.
Flacon 8 : Le mélange d’anticorps pour CISH doit être ramené à température ambiante
20-25 °C.
Flacon 9 : Le tampon substrat rouge doit être ramené à température ambiante 20-25 °C.
Flacon 10 : Le tampon substrat bleu doit être ramené à température ambiante 20-25 °C.
Flacon 11 : Le chromogène rouge doit être constamment maintenu froid entre 2 et 8 °C.
Flacon 12 : Le chromogène bleu doit être ramené à température ambiante 20-25 °C.
Flacon 13 : Le milieu de montage doit être ramené à température ambiante 20-25 °C.
Étanchéisant pour lamelle : L’étanchéisant pour lamelle peut être appliqué à n’importe quelle
température comprise entre 2 et 25 ºC.
Toutes les étapes doivent être réalisées à la température indiquée.
La procédure comprend plusieurs déshydratations suivies d’un séchage des coupes de tissu.
S’assurer que les coupesde tissus sont complètement sèches avant de passer à l’étape
suivante. Ne pas laisser les coupesde tissus se dessécher pendant les autres étapes de la
procédure.
Si la procédure de coloration doit être interrompue, les lames peuvent être conservées dans
du tampon de lavage 1 après l’étape de déparaffinage pendant une (1) heure maximum à
température ambiante (20-25 °C) sans que cela n’aff ecte les résultats.
Coloration immunohistochimique manuelle :
Toutes les incubations doivent être réalisées à température ambiante (20-25 °C).
Coloration immunohistochimique automatisée :
Appareils Dako Autostainer/Autostainer Plus :
Toutes les incubations doivent être réalisées à température ambiante (20-25 °C). Les volumes
appropriés de réactif du flacon 7 (agent de blocage de la peroxydase) et du flacon 8 (mélange
d’anticorps pour CISH) doivent être transférés dans des flacons à réactifs Autostainer Reagent
Vials (réf. S3425) de Dako ; les autres réactifs (solutions de chromogène rouge et bleu,
hématoxyline diluée et tampon de lavage 2 pour l’incubation de 5 minutes après la contrecoloration) doivent être préparés directement dans les flacons à réactifs Autostainer Reagent
Vials (réf. S3425). Choisir deux zones de dépôt (1 et 3) avec 200 µL chacune afin de prévenir
toute coloration inégale et prévenir tout dessèchement des lames.
Appareils Dako Autostainer Link :
Toutes les incubations doivent être réalisées à température ambiante (20-25 °C). Le flacon 7
(agent de blocage de la peroxydase) et le flacon 8 (mélange d’anticorps pour CISH) peuvent
être chargés directement sur l’appareil, alors que les solutions de chromogène rouge et bleu
ainsi que la dilution de l’hématoxyline doivent être préparées dans les flacons à remplir par
l’utilisateur. Les réactifs fournis avec ce kit permettent d’effectuer 20 tests en 5 cycles
individuels. Le réglage par défaut est d’une zone de dépôt avec 200 µL de réactif. Choisir
manuellement deux zones de dépôt (1 et 3) avec 200 µL chacune afin de prévenir toute
coloration inégale et prévenir tout dessèchement des lames.
Lors de l’exécution de 20 échantillons en un seul cycle de coloration, utiliser les flacons à
remplir par l’utilisateur de 12 mL pour la préparation des solutions de chromogène rouge
et bleu.
Faire attention à toute incompatibilité avec d’autres protocoles dans le même cycle en raison
de la stabilité de la solution de chromogène rouge une fois préparée. Afin de répondre à ce
problème de stabilité brève de la solution de chromogène rouge, un maximum de 30 lames
peut être coloré sur l’appareil lors d’un seul cycle de coloration.
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B.2 Déparaffinage
Déparaffinage et réhydratation : avant de réaliser l’analyse, les lamesde tissus doivent être
déparaffinées afin d’éliminer le milieu d’inclusion, puis réhydratées. Éviter toute élimination
incomplète de la paraffine. Tout résidu de milieu d’inclusion provoque une augmentation de la
coloration non spécifique. Cette étape doit être réalisée à température ambiante (20-25 °C).
1. Placer les lames dans un bain de xylène et incuber pendant 5 minutes (±1 minute).
Renouveler les bains et répéter l’opération une fois.
2. Éliminer l’excès de liquide en tapotant et placer les lames dans de l’éthanol à 96 % pendant
2 minutes (±1 minute). Renouveler les bains et répéter l’opération une fois.
3. Éliminer l’excès de liquide en tapotant et placer les lames dans de l’éthanol à 70 % pendant
2 minutes (±1 minute). Renouveler les bains et répéter l’opération une fois.
4. Éliminer l’excès de liquide en tapotant et placer les lames dans le tampon de lavage 1 dilué
(voir INSTRUCTIONS D’UTILISATION, section A.3) pendant au moins 2 minutes.
Commencer la procédure de coloration comme indiqué dans la section B.3, Étape 1,
Prétraitement.
Si la procédure de coloration est interrompue, les lames peuvent être conservées dans du
tampon de lavage 1 après l’étape de déparaffinage pendant une (1) heure maximum à
température ambiante (20-25 °C) sans que cela n’aff ecte les résultats.
Les solutions de xylène et d’alcool doivent être renouvelées au maximum toutes les
200 lames.
Des substituts du xylène peuvent être utilisés.
REMARQUE : les réactifs et les instructions fournis dans ce kit ont été conçus pour des
performances optimales. Une dilution supplémentaire des réactifs ou une modification des
températures d’incubation peuvent entraîner des résultats erronés ou discordants. Toute
différence dans le traitement des tissus ou dans la procédure technique dans le laboratoire
de l’utilisateur peut invalider les résultats du test. L’utilisation régulière de lames de contrôle
interne est recommandée pour le contrôle de qualité externe.
B.3 Protocole de coloration
1er JOUR
Étape 1 : Prétraitement
Le prétraitement peut être réalisé soit en utilisant un bain-marie, comme décrit dans la
méthode A) ci-après, soit en utilisant un four à micro-ondes avec fonction de détection, comme
décrit dans la méthode B) ci-après.
Méthode A) Prétraitement à l’aide d’un bain-marie :
Remplir les cuves de coloration, par ex. cuves de Coplin, de solution de prétraitement diluée
(voir INSTRUCTIONS D’UTILISATION, section A.1). Placer les cuves de coloration contenant
la solution de prétraitement dans un bain-marie. Chauffer le bain-marie et la solution de
prétraitement à 97-99 °C. Vérifier la température à l’intérieur de la cuve à l’aide d’un
thermomètre étalonné pour s’assurer que la température est correcte. Recouvrir les cuves
avec des couvercles afin de stabiliser la température et d’éviter toute évaporation.
Immerger les coupes déparaffinées se trouvant à température ambiante dans les cuves de
coloration contenant la solution de prétraitement préchauffée. Vérifier à nouveau la température
et laisser incuber pendant 10 minutes (±1 minute) à 95-99 °C.
Retirer la cuve contenant les lames du bain-marie. Retirer le couvercle et laisser les lames
refroidir dans la solution de prétraitement pendant 15 minutes à température ambiante.
Transférer les lames dans une cuve contenant du tampon de lavage 1 dilué (voir INSTRUCTIONS
D’UTILISATION, section A.3) pendant 3 minutes à température ambiante (20-25 °C).
Renouveler le tampon de lavage 1 et laisser tremper les coupes pendant 3 minutes
supplémentaires.
Méthode B) Prétraitement à l’aide d’un four à micro-ondes avec fonction de détection :
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Remplir une cuve en plastique de solution de prétraitement diluée à température ambiante
(20-25 °C). Immerger les coupes déparaffinées dans la solution de prétraitement, recouvrir la
cuve d’un couvercle percé et la placer dans le four à micro-ondes. Sélectionner la fonction de
détection de l’ébullition ainsi qu’un programme qui s’exécute pendant 10 minutes après avoir
atteint la température d’ébullition*.
Après les 10 minutes d’incubation, sortir la cuve contenant les lames du four. Retirer le
couvercle et laisser refroidir pendant 15 minutes à température ambiante. Transférer les lames
dans une cuve contenant du tampon de lavage 1 dilué et laisser tremper les coupes pendant
3 minutes à température ambiante (20-25 °C). Renouv eler le tampon de lavage 1 et laisser
tremper les coupes pendant 3 minutes supplémentaires.
* L’utilisation d’un four à micro-ondes doté d’une fonction de détection de l’ébullition signifie que le four
doit être doté d’un capteur et de programmes qui chauffent d’abord la solution de prétraitement jusqu’à
son point d’ébullition puis maintiennent la température de prétraitement requise (supérieure à 95 ºC)
tout en décomptant le temps prédéterminé (10 minutes (±1 minute)). Il est possible que certains
modèles de fours à micro-ondes avec fonction de détection de l’ébullition ne permettent pas de choisir
le temps de chauffage. Si le modèle comprend uniquement des programmes préréglés, s’assurer de
sélectionner un programme qui maintient la température de prétraitement requise (supérieure à 95 ºC)
pendant au moins 10 minutes (±1 minute) et arrêter manuellement le programme après 10 minutes
(±1 minute).
REMARQUE : la solution de prétraitement est conçue pour une seule application.
Ne pas la réutiliser.
Étape 2 : Pepsine, prête à l’emploi
L’incubation de la pepsine peut être réalisée à température ambiante (20-25 °C), comme décrit
dans la méthode A) ci-après, ou à 37 °C, comme décr it dans la méthode B) ci-après.
Éliminer l’excès de tampon de lavage 1 en tapotant. Avec un chiffon non pelucheux (lingette
absorbante ou compresse de gaze par exemple), essuyer soigneusement le pourtour de
l’échantillon afin d'éliminer tout liquide résiduel et de garder les réactifs dans la zone indiquée.
Déposer 5 à 8 gouttes (250 µL) de pepsine (flacon 2) froide (2 à 8 °C) pour recouvrir
l’échantillon. La pepsine doit toujours être conservée entre 2 et 8 °C.
Méthode A) Incubation à température ambiante :
Incuber à température ambiante (20-25 °C) pendant 8 minutes. Une durée d’incubation de
8 minutes est appropriée pour la plupart des échantillons, mais la durée d’incubation optimale
peut dépendre des antécédents de fixation du tissu et/ou de l’épaisseur de l’échantillon et elle
doit être déterminée par l’utilisateur.
Éliminer la pepsine en tapotant et faire tremper les coupes dans du tampon de lavage 1 dilué
(voir INSTRUCTIONS D’UTILISATION, section A.3) pendant 3 minutes à température ambiante
(20-25 °C).
Renouveler le tampon de lavage 1 dilué et faire tremper les coupes pendant 3 minutes
supplémentaires. Procéder à la déshydratation.
Méthode B) Incubation à 37 °C :
Placer l’échantillon avec la pepsine sur un bloc chauffant à 37 °C (par ex. Dako Hybridizer) et
incuber pendant 2 minutes. Une durée d’incubation de 2 minutes est appropriée pour la plupart
des échantillons, mais la durée d’incubation optimale peut dépendre de la fixation du tissu
et/ou de l’épaisseur de l’échantillon et elle doit être déterminée par l’utilisateur.
Éliminer la pepsine en tapotant et faire tremper les coupes dans du tampon de lavage 1 dilué
pendant 3 minutes à température ambiante (20-25 °C) .
Renouveler le tampon de lavage 1 et laisser tremper les coupes pendant 3 minutes
supplémentaires. Procéder à la déshydratation.
Déshydrater les coupesde tissus dans une série de bains d’éthanol à des concentrations de
plus en plus élevées (voir INSTRUCTIONS D’UTILISATION, section A.4) : 2 minutes dans de
l’éthanol à 70 %, 2 minutes dans de l’éthanol à 85 % et 2 minutes dans de l’éthanol à 96 %.
Laisser les coupesde tissus sécher complètement à l’air libre.
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Étape 3 : Mélange de sondes HER2/CEN-17, prêt à l’emploi
L’étape suivante doit être réalisée sous une hotte de laboratoire.
Appliquer 10 µL de mélange de sondes HER2/CEN-17 (flacon 3) au centre de la coupe de
tissu. Placer immédiatement une lamelle en verre de 22 mm x 22 mm sur le mélange de
sondes et laisser celui-ci s’étaler de manière homogène sous la lamelle. Éviter la formation de
bulles d’air. En cas de formation de bulles d’air, les éliminer du tissu en tapotant doucement
avec une pince.
Sceller la lamelle avec de l’étanchéisant pour lamelle en expulsant de l’étanchéisant sur tout le
pourtour de la lamelle. Laisser l’étanchéisant dépasser de la lamelle et de la lame pour former
un joint autour de la lamelle. S’assurer que l’étanchéisant recouvre bien tout le bord de
la lamelle.
Préparer le Dako Hybridizer* (réf. S2450 ou S2451) pour un cycle d’hybridation. Allumer
l’Hybridizer et choisir un programme qui va dénaturer à 82 °C pendant 5 minutes, puis hybrider
sur la nuit (14 à 20 heures) à 45 °C (veuillez vous reporter au manuel d’instruction du Dako
Hybridizer pour plus de détails).
Placer les lames dans l’Hybridizer. S’assurer que les bandelettes de contrôle de l’humidité
Humidity Control Strips (réf. S2452) sont saturées et optimales pour l’utilisation. S’assurer que
le couvercle est correctement fermé puis lancer le programme.
*Toute instrumentation permettant d’assurer des conditions similaires à celles décrites ci-dessus peut
être utilisée pour effectuer la dénaturation et l’hybridation.
2ème JOUR
Étape 4 : Lavage stringent
Remplir deux cuves de coloration, par ex. cuves de Coplin, de tampon de lavage stringent
dilué (voir INSTRUCTIONS D’UTILISATION, section A.2). Un volume minimum de 100 mL ou
15 mL par lame dans chaque cuve est recommandé.
Placer l’une des cuves de coloration contenant du tampon de lavage stringent dilué à
température ambiante dans une hotte de laboratoire et l’autre dans un bain-marie. Chauffer le
bain-marie et le tampon de lavage stringent dilué à 65 (±2) °C. S’assurer que la température
s’est stabilisée. Recouvrir la cuve avec un couvercle pour stabiliser la température et éviter toute
évaporation. Vérifier la température à l’intérieur de la cuve se trouvant au bain-marie à l’aide d’un
thermomètre étalonné pour s’assurer que la température est correcte. Le tampon de lavage
stringent contient un détergent et peut se troubler à 65 °C ; ceci n’affecte pas les performances.
À l’aide d’une pince ou de gants, sortir les lames de la chambre d’hybridation et retirer avec
précautions l’étanchéisant ainsi que les lamelles et placer les lames les unes après les autres
dans la cuve de prélavage ramenée à température ambiante.
Une fois toutes les lamelles retirées, transférer les lames de la cuve de prélavage à
température ambiante dans la cuve à 65 (±2) °C se t rouvant dans le bain-marie. Réaliser un
lavage stringent pendant 10 minutes exactement (ne PAS attendre que la température
atteigne à nouveau 65 (±2) °C pour démarrer l’incubation).
Retirer les lames du tampon de lavage stringent dilué et faire tremper les coupes dans le
tampon de lavage 1 dilué pendant 3 minutes à température ambiante (20-25 °C).
Renouveler le tampon de lavage 1 dilué et faire tremper les coupes pendant 3 minutes
supplémentaires.
B.3.1 Protocole de coloration immunohistochimique manuelle
Réaliser toutes les étapes, excepté le séchage, à température ambiante (20-25 °C).
Étape 5 : Lavage
Retirer les lames du tampon de lavage 1 dilué et faire tremper les coupes dans le tampon de
lavage 2 dilué (voir INSTRUCTIONS D’UTILISATION, section A.5) pendant 3 minutes.
Étape 6 : Agent de blocage de la peroxydase
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Éliminer l’excès de tampon en tapotant. À l’aide d’un chiffon non pelucheux, essuyer avec
précautions autour de l’échantillon pour enlever tout liquide résiduel et maintenir les réactifs
dans la zone indiquée.
Recouvrir l’échantillon de 400 µL d’agent de blocage de la peroxydase.
Incuber pendant 5 minutes (±1 minute).
Immerger dans du tampon de lavage 2 dilué pendant 3 minutes.
Répéter l’opération une fois dans du tampon de lavage 2 frais.
Étape 7 : Mélange d’anticorps pour CISH
Éliminer l’excès de tampon en tapotant et essuyer les lames comme décrit ci-avant.
Recouvrir l’échantillon de 400 µL de mélange d’anticorps pour CISH.
Incuber pendant 30 minutes (±1 minute) dans une chambre humide.
Immerger dans du tampon de lavage 2 dilué pendant 3 minutes. Répéter l’opération une fois
dans du tampon de lavage 2 frais.
Étape 8 : Solution de chromogène rouge (à préparer immédiatement avant de l’utiliser, voir
INSTRUCTIONS D’UTILISATION, section A.6)
Éliminer l’excès de tampon en tapotant et essuyer les lames comme décrit ci-avant.
Recouvrir l’échantillon avec 400 µL de solution de chromogène rouge.
Incuber pendant 10 minutes dans une chambre humide.
Immerger dans du tampon de lavage 2 dilué pendant 3 minutes. Répéter l’opération une fois
dans du tampon de lavage 2 frais.
Étape 9 : Solution de chromogène bleu (à préparer 30 minutes/8 jours avant de l’utiliser,
voir INSTRUCTIONS D’UTILISATION, section A.7)
Éliminer l’excès de tampon en tapotant et essuyer les lames comme décrit ci-avant.
Recouvrir l’échantillon avec 400 µL de solution de chromogène bleu.
Incuber pendant 10 minutes dans une chambre humide.
Immerger dans du tampon de lavage 2 dilué pendant 3 minutes. Répéter l’opération une fois
dans du tampon de lavage 2 frais.
Étape 10 : Contre-coloration
Recouvrir l’échantillon avec 400 µL d’hématoxyline diluée (Dako Hematoxylin, réf. S3301
diluée au 1/5ème, voir INSTRUCTIONS D’UTILISATION, section A.8) pendant 5 minutes.
Rincer avec le tampon de lavage 2 et placer les coupesde tissus dans un bain renouvelé de
tampon de lavage 2 pendant au moins 5 minutes jusqu’à l’obtention d’une contre-coloration à
l’hématoxyline « bleue ».
Rincer soigneusement à l’eau distillée ou déionisée.
Sécher les coupes pendant 30 minutes à 37 °C sur le Dako Hybridizer avec le couvercle
ouvert. Laisser les coupes refroidir à température ambiante avant de procéder au montage.
Étape 11 : Montage
Monter les lames avec du milieu de montage CISH (flacon 13) et laisser le milieu de montage
durcir à température ambiante (20–25 °C) pendant au moins 30 minutes, de préférence 60
minutes, avant de les analyser.
Remarque : éviter de soumettre les échantillons à de l’alcool ou à du xylène avant le montage.
Cela risque de compromettre la sensibilité de la réaction et d’aboutir à des effets négatifs sur
la coloration.
B.3.2 Protocole de coloration immunohistochimique automatisée
(appareils Dako Autostainer)
Protocole de coloration automatisée
Étape 1 : Sélectionner le protocole HER2CISH sous pharmDx dans le sélecteur de protocoles.
Pour les utilisateurs utilisant ce protocole pour la première fois, le protocole doit être installé
avant de réaliser la coloration. Sur les autres plates-formes Dako Autostainer, le protocole doit
être configuré conformément au programme illustré à la figure 1. Sinon, contacter le service
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technique de Dako pour obtenir une assistance sur l’installation d’un protocole sur les platesformes automatisées.
Étape 2 : Charger les réactifs.
Étape 3 : Charger les lames de tissus. Ne pas laisser les coupesde tissus sécher pendant le
chargement des lames sur l’appareil Dako Autostainer ni pendant la procédure de coloration.
Les coupesde tissus desséchées peuvent présenter une coloration de fond plus importante et
des signaux de faible intensité.
Étape 4 : Lancer le cycle. Pour les plates-formes Autostainer Link, sélectionner « air blow »
(jet d’air) pour terminer.
Si le protocole HER2CISH n’est pas disponible sur la plate-forme Autostainer Link utilisée,
contacter le service technique de Dako.
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Figure 1. Programme générique pour les appareils Dako Autostainer
Remarque : choisir deux zones de dépôt (1 et 3) avec 200 µL chacune.
Étape 5 : Retirer les lames de l’appareil Dako Autostainer une fois le programme terminé.
Sécher les coupes pendant 30 minutes à 37 ºC sur le Dako Hybridizer avec le couvercle
ouvert. Laisser les lames refroidir à température ambiante avant de procéder au montage.
Étape 6 : Montage
Monter les lames avec du milieu de montage CISH (flacon 13) et laisser le milieu de montage
durcir à température ambiante (20-25 °C) pendant au moins 30 minutes, de préférence 60
minutes, avant de les analyser.
Remarque : éviter de soumettre les échantillons à de l’alcool ou à du xylène avant le montage.
Cela risque de compromettre la sensibilité de la réaction et d’aboutir à des effets négatifs sur
la coloration.
Utilisation d’un microscope optique
Utiliser un objectif de microscope d’une qualité et d’un grossissement suffisants pour
permettre une évaluation optimale des échantillons. Ajuster l’intensité de la lumière pour
permettre une séparation facile des couleurs bleu et rouge. Faire la mise au point afin de
trouver tous les signaux dans chaque noyau.
Contrôle qualité
1. Les signaux doivent être clairs, distincts et faciles à évaluer, avec une intensité
bien équilibrée.
2. Les cellules normales présentes dans l’échantillon permettent d’effectuer un contrôle
interne du cycle de coloration.
• Les cellules normales doivent présenter 1 à 2 signaux bleus clairement visibles,
indiquant que la sonde PNA CEN-17 s’est hybridée avec succès à la région
centromérique du chromosome 17.
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•
•
•
•
Les cellules normales doivent présenter 1 à 2 signaux rouges clairement visibles,
indiquant que la sonde ADN HER2 s’est hybridée avec succès à l’amplicon HER2.
En cas de coupe du tissu, certaines cellules normales présenteront un nombre de
signaux inférieur à 2 pour chaque couleur.
L’absence de détection de signaux dans les cellules normales indique que le test a
échoué et les résultats doivent être considérés comme non valides.
L’évaluation numérique des cellules normales doit donner un résultat correspondant à
la valeur attendue.
3. La morphologie nucléaire doit être intacte. La présence de nombreuses cellules fantômes
et une mauvaise morphologie nucléaire générale indiquent une digestion trop forte de
l’échantillon, qui peut avoir pour effet une perte ou une fragmentation des signaux. De tels
échantillons doivent être considérés comme non valides.
4. Des différences dans la fixation, le traitement ou l’inclusion du tissu au niveau du laboratoire
de l’utilisateur peuvent produire une variation significative des résultats, ce qui exige une
évaluation régulière de lames de contrôle internes.
Interprétation de la coloration
Tissus pouvant être évalués
Seuls les échantillons de patients atteints de carcinomes invasifs doivent être analysés. Dans les
cas de carcinome in situ et de carcinome invasif dans le même échantillon, seuls le composant
invasif doit être évalué. Éviter les zones de nécrose et celles où les limites nucléaires sont ambiguës.
Ne pas inclure les noyaux nécessitant un jugement subjectif. Ne pas inclure les noyaux présentant
des signaux de faible intensité et une coloration de fond non spécifique ou importante.
Évaluation de la CISH pour HER2
Évaluation des lames :
Passer en revue la lame pour prendre en compte toute hétérogénéité possible entre les
différentes zones tumorales. Évaluer la lame conformément aux directives suivantes :
Numération des signaux : Passer en revue plusieurs zones contenant des cellules tumorales
pour prendre en compte toute hétérogénéité possible. Sélectionner une zone présentant une
bonne répartition des noyaux. Commencer l’analyse dans le coin supérieur gauche de la zone
sélectionnée puis, en allant de gauche à droite, compter le nombre de signaux à l’intérieur de
chaque noyau évalué, selon les instructions ci-dessous.
-
-
-
Faire la mise au point afin de trouver tous les signaux dans chaque noyau.
Si un signal semble avoir plus d’un centre d’origine, et a en conséquence une forme qui
diffère significativement d’un point circulaire, il doit être compté comme deux signaux
(veuillez vous reporter au guide de comptage des signaux ci-dessous).
Dans les noyaux présentant de forts niveaux d’amplification du gène HER2, les signaux
HER2 peuvent se trouver très proches les uns des autres et former un agrégat de signaux.
Dans ce cas, le nombre de signaux HER2 ne peut pas être compté mais doit être estimé.
Une attention particulière doit être portée aux signaux bleus, puisque les agrégats de signaux
HER2 peuvent masquer les signaux bleus et rendre difficile l’observation de ces derniers.
En cas de doute, ne pas inclure les noyaux dans l’évaluation.
Ne pas évaluer les noyaux sans signaux ou ne présentant des signaux que d’une seule
couleur. Évaluer uniquement les noyaux avec un ou plusieurs signaux de chaque couleur.
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Guide de comptage des signaux
1
Ne pas compter. Les noyaux se chevauchent,
certaines zones des noyaux ne sont pas visibles.
2
Deux signaux bleus, ne pas évaluer les noyaux
avec des signaux d’une seule couleur.
3
Compter comme 3 signaux bleus et 12 rouges
(estimation d’agrégat).
4
Compter comme 2 signaux bleus et 1 rouge.
Les signaux qui semblent avoir plus d’un
centre d’origine doivent être comptés comme
deux signaux.
5
Ne pas compter (noyau trop digéré ou pas assez
digéré). Signaux manquant au centre des noyaux.
6
Compter comme 2 signaux bleus et 5 rouges.
Les signaux qui semblent avoir plus d’un centre
d’origine doivent être comptés comme
deux signaux.
Compter comme 1 signal bleu et 5 rouges.
7
8
Compter comme 3 signaux bleus (1 bleu flou)
et 3 rouges.
9
Agrégat de signaux rouges masquant les signaux
bleus. Aller à un niveau de grossissement
supérieur pour confirmer la présence ou l’absence
de signaux bleus. En cas de doute, ne pas
compter.
Notation des comptages
Compter 20 noyaux par échantillon tissulaire, si possible à partir de zones tumorales distinctes
(17).
Calculer le rapport HER2/CEN-17 en divisant le nombre total de signaux HER2 rouges par le
nombre total de signaux CEN-17 bleus.
Les échantillons ayant un rapport HER2/CEN-17 supérieur ou égal à 2 doivent être considérés
comme présentant une amplification du gène HER2 (18-19).
Les résultats se trouvant à la valeur-seuil ou proches de la valeur-seuil (1,8-2,2) doivent être
interprétés avec prudence.
Si le rapport se situe à la valeur-seuil ou est proche de la valeur-seuil (1,8-2,2), compter 20
noyaux de plus et recalculer le rapport pour les 40 noyaux.
En cas de doute, la lame de l’échantillon doit être réévaluée. Pour les cas limites,
une consultation entre le pathologiste et le médecin traitant est recommandée.
Limites
1. La CISH utilisant le kit HER2 CISH pharmDx™ est un processus à plusieurs étapes qui
requiert une formation spécialisée dans la sélection des réactifs appropriés ; ainsi que la
sélection, la fixation et le traitement des tissus ; la préparation des lames CISH ; et
l’interprétation des résultats de la coloration.
2. Les résultats de l’analyse CISH dépendent de la manipulation et du traitement du tissu avant
la coloration. Une fixation, un lavage, un séchage, un chauffage ou une coupe incorrects,
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3.
4.
5.
6.
ou bien une contamination par d’autres tissus ou fluides peuvent avoir une influence sur
l’hybridation de la ou des sondes. Des résultats non cohérents peuvent être dus à des
variations dans les méthodes de fixation et d’inclusion ou à des irrégularités inhérentes
au tissu.
Pour des résultats optimaux et reproductibles, les lames de tissus doivent être entièrement
déparaffinées. L’élimination de la paraffine doit être terminée avant le début du processus
de coloration (voir INSTRUCTIONS D’UTILISATION, section B.2).
Utiliser uniquement un bain-marie dont la température a été étalonnée. Le Dako Hybridizer
(réf. S2450 ou S2451) est recommandé pour la dénaturation et l’hybridation, cependant, si un
bloc chauffant ou une étuve d’hybridation est utilisé, leur température doit être étalonnée.
L’utilisation d’autres types d’équipement peut entraîner l’évaporation du mélange de sondes
HER2/CEN-17 au cours de l’hybridation et celle-ci doit être validée par l’utilisateur.
Une contre coloration excessive ou incomplète peut conduire à une interprétation erronée
des résultats.
La procédure de coloration immunohistochimique doit être réalisée à température
ambiante, entre 20 et 25 °C.
7. Ne pas remplacer les réactifs par des réactifs portant d’autres numéros de lot ou par des
réactifs provenant d’autres fabricants.
Caractéristiques de performance
Sensibilité analytique
Les extrémités des sondes ADN HER2 du mélange de sondes HER2/CEN-17 ont été séquencées
et les sondes cartographiées afin de confirmer qu’elles couvrent au total 218 kb, y compris le
gène HER2. Les sondes PNA CEN-17 du mélange de sondes HER2/CEN-17 ont été testées
individuellement et en combinaison, afin de confirmer leur hybridation spécifique à la région
centromérique du chromosome 17.
Pour exclure toute hybridation croisée avec des chromosomes autres que le chromosome 17,
des études ont été réalisées sur des étalements de métaphases conformément aux procédures
standard de CQ de Dako. Au total, 250 étalements métaphasiques ont été évalués pour
l’hybridation spécifique des mélanges de sondes ADN HER2 et PNA CEN-17. Dans les 250
cas, l’hybridation était spécifique au chromosome 17 et aucune hybridation croisée sur les loci
d’autres chromosomes n’a été observée.
De plus, la sensitivité a été testée sur 18 échantillons d’épithélium mammaire humain normal
afin de vérifier que le kit HER2 CISH pharmDx™ détecte bien les substances ciblées (HER2 et
CEN-17). Les rapports HER2/CEN-17 se trouvaient entre 0,97 et 1,09, c.-à-d. dans l’intervalle
attendu pour les cellules diploïdes normales.
Spécificité analytique
La spécificité analytique a été testée afin de mesurer la capacité du test à uniquement
identifier les substances ciblées HER2/CEN-17 sans aucune interférence de la part d’autres
substances. Des lames colorées ont été évaluées pour la présence de signaux en l’absence du
mélange
de sondes HER2/CEN-17 ou du mélange d’anticorps pour CISH. Aucune liaison non spécifique
du mélange d’anticorps pour CISH ou des chromogèmes entraînant des signaux visibles en
FISH ou CISH n’a été observée.
Études de robustesse
La robustesse du kit HER2 CISH pharmDx™ a été testée en faisant varier la durée et la
température d’incubation du mélange d’anticorps pour CISH, de la solution de chromogène
rouge, de la solution de chromogène bleu et du contre-colorant. Tous les autres paramètres
de la procédure ont été testés ; ceux-ci faisant partie des études de robustesse pour le kit
HER2 FISH pharmDx™.
•
•
Prétraitement pendant 7, 10 et 13 minutes à 95-99 ºC.
Prétraitement à 89, 92 et 95-99 ºC pendant 10 minutes.
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Durées d’incubation de la pepsine de 2, 5, 10, 15 et 18 minutes à température ambiante.
Températures de dénaturation de 72, 77, 82, 87 et 92 ºC.
Durée d’hybridation de 17 heures à 40, 45 et 50 ºC.
Durées d’hybridation de 10, 12 et 14 heures à 45 ºC.
Le lavage stringent a été testé pendant 10 minutes à 60, 65 et 70 ºC.
Il a aussi été testé pendant 5, 10 et 15 minutes à 65 ºC. Le lavage stringent pendant
10 minutes à 70 ºC et le lavage stringent pendant 15 minutes à 65 ºC se sont traduits par
une perte des signaux, alors qu’aucune différence entre les résultats n’a été observée aux
autres combinaisons de durée/température.
Plusieurs dilutions du tampon de lavage stringent ont été testées : 1/10ème, 1/15ème,
1/20ème, 1/30ème et 1/40ème. La dilution du tampon de lavage stringent au 1/40ème
s’est traduite par une perte des signaux, alors qu’aucune différence significative de
l’intensité des signaux n’a été observée aux autres dilutions.
Durée d’incubation des anticorps : 25, 27, 30, 33 et 35 minutes. Une incubation de
25 minutes avec le mélange d’anticorps s’est traduite par une perte de l’intensité des
signaux rouges, alors qu’aucune différence significative n’a été observée avec les autres
durées d’incubation.
Durée d’incubation de la solution de chromogène rouge de 8, 9, 10, 11 et 12 minutes.
Durée d’incubation de la solution de chromogène bleu de 8, 9, 10, 11 et 12 minutes.
Durée d’incubation du contre-colorant de 4, 5 et 6 minutes.
Concentration du contre-colorant à une dilution au 1/4ème, au 1/5ème et au 1/6ème.
Remarque : pour les tests des études de robustesse, seul un paramètre de la procédure de
coloration a été modifié à la fois tandis que les autres paramètres étaient conservés. Il est
recommandé de respecter les durées et températures indiquées dans la procédure de
coloration.
Répétabilité
La répétabilité du rapport HER2/CEN-17 a été testée à l’aide du kit HER2 CISH pharmDx™
sur trois coupes consécutives provenant de neuf échantillons différents de cancer du sein.
Le coefficient de variation était de 1 à 7 %, avec un rapport supérieur entraînant un CV
supérieur.
La répétabilité sur des coupes consécutives d’échantillons de cancer du sein de différentes
épaisseurs (3 à 7 µm) a été testée avec le kit HER2 CISH pharmDx™. Le coefficient de
variation du rapport HER2/CEN-17 dans cette étude était de 3 à 6 %, c.-à-d. de même ordre
que celui des coupes tissulaires de même épaisseur.
Reproductibilité
La reproductibilité du kit HER2 CISH pharmDx™ a été déterminée en testant la reproductibilité
d’un jour à l’autre ainsi que la reproductibilité d’un site à l’autre/d’un observateur à l’autre.
Des coupes issues de 9 échantillons différents de cancer du sein ont été colorées et
analysées sur trois jours dans trois sites différents.
Lors de l’étude de la reproductibilité, l’analyse des échantillons de cancer du sein à l’aide du kit
HER2 CISH pharmDx™ a montré que les résultats étaient reproductibles d’un jour à l’autre et
d’un laboratoire à l’autre. D’après un modèle des composants de la variance, des mesures
effectuées sur différents sites et sur différents jours ne différaient que légèrement plus des
mesures supposées effectuées le même jour sur le même site (erreur résiduelle) (Table 1).
(120946-003)
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Tableau 1. Estimations du coefficient de variation (CV) des composants de la variance
Amplifié
2+ par IHC
Non amplifié
D’un site à l’autre
15,8 %
12,2 %
9,0 %
D’un jour à l’autre
13,6 %
12,2 %
8,4 %
Erreur résiduelle
13,1 %
12,2 %
8,4 %
Étude comparative
L’utilité clinique du kit HER2 CISH pharmDx™ a été étudiée lors d’une étude clinique
comprenant 365 échantillons de cancer du sein invasif qui ont été analysés à l’aide du kit
HER2 CISH pharmDx™ et du kit PathVysion HER-2 DNA Probe Kit (FISH). Des échantillons
ont été prélevés de manière consécutive, puis ont été ajoutés à cet ensemble d’échantillons 60
échantillons déterminés comme étant 2+ par IHC avec le test HercepTest™, l’ensemble des
échantillons ont ensuite été analysés dans un laboratoire de référence américain. Les résultats
de test de 350 échantillons étaient éligibles à une analyse statistique ; les scores IHC obtenus
avec le test HercepTest™ ainsi que le statut du gène HER2 obtenu par CISH sont présentés
au tableau Table 2 ci-après. Un rapport HER2/CEN-17 inférieur à 2,0 indique un cas non
amplifié et un rapport HER2/CEN-17 supérieur ou égal à 2,0 indique un cas amplifié.
Tableau 2. Tableau à double entrée des scores IHC obtenus avec le test HercepTest™ et du statut du
gène HER2 obtenu par CISH
Score IHC obtenu avec le test HercepTest
0
1+
2+
Total
3+
Statut du gène HER2 Non amplifié
obtenu par CISH
Amplifié
98
108
95
5
306
0
1
17
26
44
Total
98
109
112
31
350
La concordance globale entre le statut de HER2 obtenu avec le kit HER2 CISH pharmDx™ et
avec le kit PathVysion HER-2 DNA Probe Kit (FISH) était de 97,7 % comme présenté au Table 3.
La concordance positive et négative était de 90,9 % et 98,7 %, respectivement. Le test de
McNemar sur un biais systématique entre les deux tests n’était pas significatif (p=1,00).
Tableau 3. Tableau à double entrée du statut du gène HER2 obtenu par CISH par rapport au statut du
gène HER2 obtenu par FISH à l’aide du kit PathVysion
Statut du gène HER2
obtenu par FISH à l’aide
du kit PathVysion
Non amplifié
Statut du gène HER2
obtenu par CISH
Total
Non amplifié
Amplifié
Total
Amplifié
302
4
4
40
306
44
306
44
350
Concordance globale : (342/350 x 100) = 97,7 % ; (limite inférieure de l’IC 95 % : 95,7 % ;
limite supérieure de l’IC 95 % : 98,9 %)
Concordance positive : (40/44 x 100) = 90,9 % ; (limite inférieure de l’IC 95 % : 79,8 % ; limite
supérieure de l’IC 95 % : 96,9 %)
Concordance négative : (302/306 x 100) = 98,7 % ; (limite inférieure de l’IC 95 % : 96,9 % ;
limite supérieure de l’IC 95 % : 99,6 %)
Kappa : 0,90 (erreur standard 0,04)
Lors d’une analyse exploratoire des rapports HER2/CEN-17 obtenus par les deux méthodes,
les rapports ont été reportés sur un graphique (Figure 1).
(120946-003)
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Figure 1. Graphe des rapports HER2/CEN-17 pour le kit HER2 CISH pharmDx™ de Dako et le kit
PathVysion HER-2 DNA Probe Kit (FISH)
La régression linéaire des rapports HER2/CEN-17 transformés de manière logarithmique a
révélé un coefficient de corrélation à 0,90 et une pente de 0,71.
Durée d’évaluation des lames
La durée moyenne d’évaluation d’une lame était de 3 minutes et 13 secondes pour le kit HER2
CISH pharmDx™ et de 4 minutes et 2 secondes pour le kit PathVysion HER2 DNA Probe Kit
(FISH). Lors d’un test-t bilatéral apparié, la différence moyenne de la durée d’évaluation d’une
lame était de 49 secondes, ce qui est significativement différent de zéro (p<0,001).
Taux de réussite de la CISH
Sur un total de 364 tests CISH effectués, 352 (96,7 %) ont été réalisés avec succès.
Valeur pronostique du kit HER2 CISH pharmDx™
Afin d’associer la valeur pronostique du kit HER2 FISH pharmDx™ au kit HER2 CISH
pharmDx™, une étude de la concordance de leurs résultats de test a été réalisée. La valeur
pronostique du kit HER2 FISH pharmDx™ a été précédemment mise en évidence d’après les
données de l’étude 89D du DBCG (Danish Breast Cancer Cooperative Group) qui a analysé le
statut de HER2 à l’aide du kit HER2 FISH pharmDx™ de Dako. Lors de cette étude 89D du
DBCG, les résultats de tests de 649 échantillons de patients étaient disponibles pour une
analyse multivariée, 417 échantillons avaient un rapport HER2/CEN-17 inférieur à 2,0 (statut
du gène HER2 normal ou non amplifié) et 232 échantillons avaient un rapport HER2/CEN-17
supérieur ou égal à 2,0 (statut du gène HER2 amplifié).
Lors de l’analyse univariée de la valeur pronostique de l’amplification de HER2 chez des
patients à ganglions positifs (n=423), il a été observé que l’amplification du gène HER2,
déterminée par le kit HER2 FISH pharmDx™, avait une valeur pronostique significative sur la
survie globale (Figure 2).
(120946-003)
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Figure 2. Courbe de Kaplan Meier présentant la survie globale (SG) en fonction de l’amplification de
HER2 obtenue par FISH chez des patients à ganglions positifs (n=423).
Une analyse multivariée complémentaire a révélé que l’amplification de HER2 obtenue par
FISH avait une valeur pronostique indépendante chez les patients à ganglions positifs, avec
un rapport de risques correspondant à l’amplification de HER2 pour la survie globale de 1,40
(limites de l’IC 95 % du rapport de risques : 1,07-1,85), p=0,015.
La concordance entre les tests du kit HER2 FISH pharmDx™ et du kit HER2 CISH pharmDx™
a été étudiée lors d’une étude clinique comprenant 200 échantillons de cancer du sein invasif.
Les résultats de tests de 189 échantillons étaient éligibles pour une analyse statistique du
statut de HER2, et le tableau à double entrée du statut de HER2 obtenu par les deux tests est
présenté dans le tableau 4 ci-après. Les données de la concordance montrent une
concordance globale entre les tests des kits pharmDx™ FISH et CISH de Dako de 97,9 %,
avec des concordances positive et négative à 92,6 % et 98,8 %, respectivement. Par
conséquent, les données montrent que la valeur pronostique du résultat d’analyse avec le kit
HER2 FISH pharmDx™ peut être obtenue avec le kit HER2 CISH pharmDx™.
Tableau 4. Tableau à double entrée du statut du gène HER2 obtenu avec le kit HER2 CISH pharmDx™
et avec le kit HER2 FISH pharmDx™.
Statut de HER2 obtenu par
FISH de Dako
Non amplifié
Statut de HER2 obtenu
par CISH de Dako
Total
Non amplifié
Amplifié
Total
Amplifié
160
2
162
2
25
27
162
27
189
Concordance globale : (185/189 x 100) = 97,9 % ; (limite inférieure de l’IC 95 % : 95,7 % ;
limite supérieure de l’IC 95 % : 99,3%)
Concordance positive : (25/27 x 100) = 92,6% ; (limite inférieure de l’IC 95 % : 78,3 % ;
limite supérieure de l’IC 95 % : 98,4 %)
Concordance négative : (160/162 x 100) = 98,8 %; (limite inférieure de l’IC 95 % : 96,1 % ;
limite supérieure de l’IC 95 % : 99,7 %)
Kappa : 0,91 (erreur standard 0,04)
(120946-003)
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Dépannage
Problème
1. Aucun signal ou signaux
de faible intensité
Cause probable
1a. Le kit a été exposé à des
températures élevées
pendant le transport ou la
conservation
1b. Mauvaises conditions de
prétraitement
1c. Évaporation du mélange
de sondes pendant
l’hybridation
1d. Les réglages du
microscope ne sont pas
optimaux
- Éclairage inadéquat
- Grossissement plus
élevé (objectifs 40x
ou 60x)
1e. Les solutions de
chromogène rouge
et/ou bleu n’ont pas
été utilisées dans le
temps imparti
1f. Coloration automatisée
- Les réactifs n’ont pas
été utilisés dans l’ordre
- Volume de réactifs
insuffisant
- Durées d’incubation
inappropriées
- Mauvaise zone
de dépôt
(120946-003)
Mesure suggérée
1a. Vérifier les conditions de
conservation. S’assurer
qu’il restait de la
carboglace à la réception
du flacon 2 (pepsine).
S’assurer que les pains
de glace étaient froids à
la réception du kit.
S’assurer que l’intégralité
du kit est conservée à
l’abri de la lumière à un
maximum de 2-8 °C. Le
milieu de montage (flacon
13) doit être conservé à
température ambiante..
1b. S’assurer que la
température et la durée
recommandées pour le
prétraitement ont été
respectées.
1c. Assurer une humidité
suffisante dans la
chambre d’hybridation.
1d. Essayer différents
réglages de microscope.
En cas de doute,
contacter le fournisseur
local du microscope.
1e. La solution de
chromogène rouge
préparée doit être utilisée
dans les 20 minutes.
La solution de
chromogène bleu doit
être préparée 30 minutes
avant utilisation et elle
doit être utilisée dans les
8 jours (lorsque conservée
entre 2 et 8 ºC à l’abri de
la lumière).
1f. Vérifier la grille de
programmation,
l’agencement des lames
et la carte des réactifs
avant de lancer le cycle.
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1g. Dessèchement des lames
2. Aucun signal bleu
2a. Mauvaises conditions de
lavage stringent
2b. Mauvaise dilution du
chromogène bleu
2c. Problèmes lors de la
préparation de la solution
de chromogène bleu
3. Aucun signal rouge
3a. Mauvaises conditions de
prétraitement
3b. Mauvaise utilisation
de la solution de
chromogène rouge
3c. Mauvaise dilution du
chromogène rouge
4. Zones sans aucun signal
4a. Volume de sondes
insuffisant
4b. Formation de bulles d’air
pendant l’application du
mélange de sondes ou
pendant le montage
4c. Volume de réactif
insuffisant
(120946-003)
1g. Ne pas laisser les
coupesde tissus se
dessécher à aucun
moment pendant la
procédure de coloration.
2a. S’assurer que la
température et la durée
recommandées pour le
lavage stringent sont bien
respectées et que les
lamelles ont été retirées
avant de réaliser le
lavage stringent.
2b. Préparer la solution de
chromogène bleu en
mélangeant 75 µL de
chromogène bleu (flacon
12) dans 1 mL de tampon
substrat bleu (flacon 10).
2c. Le chromogène bleu
(flacon 12) n’a pas été
mélangé avant la
préparation de la solution
de chromogène bleu.
3a. S’assurer que la
température et la durée
recommandées pour le
prétraitement sont bien
respectées.
3b. La solution de
chromogène rouge
préparée doit être utilisée
dans les 20 minutes
(y compris la durée
d'incubation).
3c. Préparer la solution de
chromogène rouge en
mélangeant 10 µL de
chromogène rouge
(flacon 11) dans 1 mL de
tampon substrat rouge
(flacon 9).
4a. Veiller à ce que le volume
de sondes soit suffisant
pour recouvrir la zone
sous la lamelle.
4b. Éviter la formation de
bulles d’air. Si des bulles
sont observées, les
éliminer en tapotant
doucement.
4c. S’assurer que le volume
de réactif est suffisant
pour recouvrir la zone
tissulaire.
SK109/EFG/JEN/2013.03 p. 57/96
4d. Formation de bulles d’air
pendant le montage
4e. Zone de dépôt
5. Coloration de fond
excessive
5a. Mauvaise fixation du tissu
5b. Élimination incomplète de
la paraffine
5c.Température du lavage
stringent trop basse
5d. Évaporation du mélange
de sondes pendant
l’hybridation
5e. Les lames ne sont pas
bien rincées
5f. Les coupes ont séché au
cours de la procédure de
coloration manuelle
5g. Les coupes ont séché au
cours de leur chargement
sur l’Autostainer
5h. Les coupes ont séché au
cours de la procédure de
coloration automatisée
(120946-003)
4d. Éviter la formation de
bulles d’air. Utiliser le
milieu de montage fourni
avec le kit.
4e. S’assurer que la zone de
dépôt est alignée avec
l’emplacement de la
coupe tissulaire. Utiliser
deux zones de dépôt
(1 et 3).
5a S’assurer que seules des
coupesde tissus fixées au
formol et incluses en
paraffine sont utilisées.
5b. Suivre les procédures de
déparaffinage et de
réhydratation décrites
dans la section B.2.
5c. S’assurer que la
température du lavage
stringent est de
65 (±2) °C.
5d. S’assurer que la chambre
d’hybridation a une
humidité suffisante.
Utiliser des bandelettes
de contrôle de l’humidité.
5e. Utiliser du tampon de
lavage frais. Veiller à
correctement amorcer
l’Autostainer avant
d’exécuter un cycle.
S’assurer que le tampon
approprié est fourni en
quantité suffisante pour
l’ensemble du cycle.
5f. Utiliser une chambre
humide. N’essuyer que
trois à quatre lames à la
fois avant d’appliquer le
réactif.
5g. Veiller à ce que les
coupes soient
humidifiées par du
tampon et le restent
pendant le chargement et
avant de lancer le cycle.
5h. Vérifier que le volume de
réactif approprié est
appliqué sur les lames.
S’assurer que le capot de
l’Autostainer est fermé et
que le réactif n’est pas
exposé à une chaleur
excessive.
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6. Mauvaise morphologie
tissulaire
6a. Mauvais traitement à la
pepsine
6b. Tissu trop digéré
6c.De mauvaises conditions
de prétraitement peuvent
causer un aspect trouble
ou laiteux
6d. Un traitement à la
pepsine trop long ou des
coupes très fines peuvent
faire apparaître des
cellules fantômes ou
convexes
7. La contre-coloration à
l’hématoxyline rend la
visualisation des signaux
HER2 et CEN-17
spécifiques difficile
8. Coloration spécifique trop
forte
7a. La contre-coloration à
l’hématoxyline est trop
forte
8a. Durée d’incubation des
réactifs trop longue
8b. Une solution de lavage
inappropriée a été utilisée
(120946-003)
6a. Respecter les durées
d’incubation
recommandées pour la
pepsine. Voir la section
B.3, étape 2.
S’assurer que la pepsine
est manipulée à la bonne
température. Voir la
section B.1.
6b. Réduire la durée
d’incubation de la
pepsine dans la
procédure de coloration
FISH de Dako. Pour les
tissus fixés au formol
neutre tamponné (24
heures) et inclus en
paraffine, une incubation
de la pepsine de 2
minutes à 37 °C est un
bon point de départ.
Il y a un équilibre entre la
morphologie du tissu et
l’intensité/la qualité du
signal dont l’utilisateur
doit être conscient quand
il réalise un gradient
de pepsine dans la
procédure FISH car une
digestion trop faible ainsi
qu’une digestion trop
forte des échantillonsde
tissus ont un effet sur
l’intensité/la qualité
du signal.
6c.S’assurer que la
température et la durée
recommandées pour le
prétraitement sont bien
respectées.
6d. Raccourcir la durée
d’incubation de la
pepsine. Voir la
section B.3, étape 2.
S’assurer que l’épaisseur
des coupes est de
4 à 6 µm.
7a. Une dilution
supplémentaire de
l’hématoxyline ou une
durée d’incubation plus
courte sont nécessaires.
8a. Revoir les instructions de
la procédure de
coloration.
8b. Utiliser uniquement le
tampon de lavage
recommandé avec le kit
(tampon de lavage 2,
fourni avec le kit ou
tampon de lavage Dako
Wash Buffer, réf. S3006).
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Annexe 1
Kit HER2 CISH pharmDxTM, réf. SK109
Liste de contrôle du protocole
ID du compte-rendu du cycle de coloration : _________________
Date (1er jour) du cycle : ______________
Kit HER2 CISH pharmDx™, réf. SK109 Lot : _____________
ID de l’échantillon :_______________________________________________________
ID du matériel :__________________________________________________________
Tissu fixé au formol neutre tamponné
Oui
Non
Date de dilution/de péremption du tampon de lavage 1 (1x)
(flacon 5 dilué au 1/20ème)
/
Date de dilution/de péremption du tampon de lavage 2 (1x)
(flacon 6 dilué au 1/10ème)
/
1er JOUR
Étape 1 : Prétraitement
Date de dilution/de péremption de la solution de prétraitement
(flacon 1 dilué au 1/20ème)
Température de la solution de prétraitement mesurée (95-99 °C) si la
solution est chauffée au bain-marie (méthode A)
Si la solution est chauffée au four à micro-ondes (méthode B),
mettre un tiret
Prétraitement (10 minutes) et refroidissement (15 minutes)
Lavage dans le tampon de lavage 1 (flacon 5 dilué au 1/20ème)
(2 x 3 minutes)
Étape 2 : Pepsine
Durée du traitement à la pepsine (flacon 2) à 37 ºC ou
Durée du traitement à la pepsine (flacon 2) à température ambiante
Lavage dans le tampon de lavage 1 (flacon 5 dilué au 1/20ème)
(2 x 3 minutes)
Déshydratation des lames (3 x 2 minutes) dans une série de bains
d’éthanol à des concentrations de plus en plus élevées et séchage
à l’air libre
Étape 3 : Mélange de sondes HER2/CEN-17
Application du mélange de sondes (flacon 3), mise en place d’une lamelle
et étanchéisation avec de l’étanchéisant pour lamelle
Température de dénaturation mesurée (82 °C) si un appareil autre que le
Dako Hybridizer est utilisé
Dénaturation pendant 5 minutes
Température d’hybridation mesurée (45 °C) si un appareil autre que le
Dako Hybridizer est utilisé
Hybridation sur la nuit (protéger de la lumière)
(120946-003)
/
°C
minutes
minutes
°C
°C
heures
SK109/EFG/JEN/2013.03 p. 60/96
2ème JOUR
Étape 4 : Lavage stringent
Date de dilution/de péremption du tampon de lavage stringent (flacon 4
dilué au 1/20ème)
Température mesurée du tampon de lavage stringent (65 °C)
/
°C
Lavage stringent (10 minutes) après retrait des lamelles
Lavage dans le tampon de lavage 1 (flacon 5 dilué au 1/20ème)
(2 x 3 minutes)
Étape 5 : Agent de blocage de la peroxydase
Lavage dans le tampon de lavage 2 (flacon 6 dilué au 1/10ème)
(3 minutes)
Blocage de la peroxydase (flacon 7) pendant 5 minutes
Lavage dans le tampon de lavage 2 (flacon 6 dilué au 1/10ème)
(2 x 3 minutes)
Étape 6 : Mélange d’anticorps pour CISH
Mélange d’anticorps pour CISH (flacon 8) pendant 30 minutes
Lavage dans le tampon de lavage 2 (flacon 6 dilué au 1/10ème)
(2 x 3 minutes)
Étape 7 : Solution de chromogène rouge
Mélange de la solution de chromogène rouge à partir du tampon substrat
rouge (flacon 9) et du chromogène rouge (flacon 11). Doit être utilisée
dans les 20 minutes
Solution de chromogène rouge pendant 10 minutes
Lavage dans le tampon de lavage 2 (flacon 6 dilué au 1/10ème)
(2 x 3 minutes)
Étape 8 : Solution de chromogène bleu
Mélange de la solution de chromogène bleu à partir du tampon substrat
bleu (flacon 10) et du chromogène bleu (flacon 12). Doit être préparée
30 minutes avant utilisation et utilisée dans les 8 jours (lorsque conservée
entre 2 et 8 ºC à l’abri de la lumière)
Solution de chromogène bleu pendant 10 minutes
Lavage dans le tampon de lavage 2 (flacon 6 dilué au 1/10ème)
(2 x 3 minutes)
Étape 9 : Contre-coloration
Contre-coloration à l’hématoxyline (Non fournie avec le kit.
Dilution au 1/5ème de l’hématoxyline Dako Hematoxylin,
réf. S3301 dans de l’eau déionisée)
Rinçage dans le tampon de lavage 2 (flacon 6 dilué au 1/10ème)
Lavage dans le tampon de lavage 2 (flacon 6 dilué au 1/10ème)
(5 minutes)
Rinçage soigné à l’eau déionisée
Étape 10 : Montage
Séchage pendant 30 minutes à 37 º C, refroidissement à température
ambiante, puis
Application du milieu de montage (flacon 13) et mise en place d’une lamelle
Attente d’au moins 30 à 60 minutes avant évaluation
Commentaires :_______________________________________________________________________
___________________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________________
Date et signature du technicien :
(120946-003)
SK109/EFG/JEN/2013.03 p. 61/96
Annexe 2
Kit HER2 CISH pharmDx™, réf. SK109
Feuille d’évaluation
ID du compte-rendu du cycle de coloration : ___________
Date (1er jour) du cycle : ______________
Kit HER2 CISH pharmDx™, réf. SK109 Lot : ________
ID de l’échantillon :__________
Comptage des signaux dans 20 noyaux
N° du
noyau
HER2
score
(rouge)
CEN-17
score
(bleu)
N° du
noyau
1
11
2
12
3
13
4
14
5
15
6
16
7
17
8
18
9
19
10
20
Total (1-10)
Total (11-20)
HER2
score
(rouge)
CEN-17
score
(bleu)
Pour déterminer le rapport HER2/CEN-17, compter le nombre de signaux HER2 et celui des
signaux CEN-17 dans les 20 mêmes noyaux et diviser le nombre total de signaux HER2 par le
nombre total de signaux CEN-17. Si le rapport HER2/CEN-17 se trouve à la limite (1,8-2,2),
compter 20 noyaux de plus et recalculer le rapport.
Un rapport à la valeur-seuil ou proche de la valeur-seuil (1,8-2,2) doit être interprété avec
prudence (voir le guide de comptage).
HER2
CEN-17
Rapport HER2/CEN-17
Score total (1-20)
Rapport < 2 : aucune amplification du gène HER2 observée
Rapport ≥ 2 : amplification du gène HER2 observée
Date et signature du technicien :
Date et signature du pathologiste :
Pour des directives d’évaluation : voir la section Interprétation de la coloration
(120946-003)
SK109/EFG/JEN/2013.03 p. 62/96
DEUTSCH
Verwendungszweck
Zur In-vitro-Diagnostik
Das HER2 CISH pharmDx™-Kit ist zur zweifarbigen chromogenen Darstellung von Signalen
vorgesehen, die durch direkte Markierung von In-situ-Hybridisierungssonden erzeugt werden,
die auf das HER2-Gen und die Zentromerregion von Chromosom 17 abzielen. Das Kit ist zur
quantitativen Bestimmung des HER2-Genstatus in formalinfixierten paraffineingebetteten
Brustkrebs-Gewebeproben vorgesehen. Rote und blaue chromogene Signale werden
gleichzeitig in einem Gewebeschnitt erzeugt, die mit einem Lichtmikroskop ausgewertet
werden. Das CISH-Verfahren kann entweder manuell oder mit Dako AutostainerFärbeautomaten durchgeführt werden.
Das HER2 CISH pharmDx™-Kit ist als Hilfsmittel für die Bewertung von Patientinnen indiziert,
für die eine Behandlung mit Herceptin™ (Trastuzumab) in Erwägung gezogen wird. Mit dem
HER2 CISH pharmDx™-Kit erhaltene Ergebnisse dienen als Ergänzung zu klinischpathologischen Informationen, die gegenwärtig für die Erhebung der Prognose bei
Patientinnen mit einem Mammakarzinom Stadium II mit Lymphknotenbefall genutzt werden.
Zusammenfassung und Erklärung
Das humane HER2 -Gen (auch ERBB2 oder NEU) ist auf Chromosom 17 lokalisiert und
kodiert das HER2-Protein oder p185HER2. Als eine Membranrezeptor-Tyrosinkinase zeigt das
HER2-Protein Rezeptorhomologie mit dem Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR oder
HER1) (1-2). Das HER2-Gen liegt in allen normalen diploiden Zellen in 2 Kopien vor.
Bei einem gewissen Anteil von Mammakarzinomen erfolgt die Amplifikation des HER2-Gens
im Zuge der malignen Transformation und der Tumorprogression (3-8). Generell führt die
HER2-Genamplifikation zur Überexpression des HER2-Proteins auf der Oberfläche von
Mammakarzinomzellen (9).
Bei 25-30 % der Mammakarzinome wurde eine Amplifikation des HER2-Gens und/oder eine
Überexpression seines Proteins nachgewiesen. Diese Up-Regulation geht einher mit
schlechter Prognose, erhöhtem Rezidivrisiko und verkürzter Überlebenszeit. In mehreren
Studien wurde aufgezeigt, dass der HER2-Status mit der Empfindlichkeit für oder der
Resistenz gegen bestimmte Chemotherapieschemata korreliert (10).
Der Nachweis einer hohen Überexpression des HER2-Proteins oder einer HER2
-Genamplifikation ist für die Einleitung der Behandlung mit Herceptin™, einem monoklonalen
Antikörper gegen das HER2-Protein, unerlässlich. Klinische Studien haben den Nachweis
erbracht, dass Patientinnen, deren Tumoren eine starke Überexpression des HER2-Proteins
und/oder eine Amplifikation des HER2-Gens zeigen, am meisten von der Behandlung mit
Herceptin™ profitieren (11).
Verfahrensprinzip
Im HER2 CISH pharmDx™-Kit sind alle Reagenzien enthalten, die zur Durchführung eines
CISH-Verfahrens an formalinfixierten paraffineingebetteten (FFPE) Gewebeschnitten
(ausgenommen Hämatoxylin zur Gegenfärbung) benötigt werden.
Nach Entparaffinierung und Rehydrierung werden Proben 10 Minuten lang in Vorbehandlungslösung
erwärmt. Der nächste Schritt dient der proteolytischen Andauung mit gebrauchsfertigem
Pepsin bei Raumtemperatur oder bei 37 °C. Die optimale Pepsin-Inkubationszeit hängt von
der Fixierung des Gewebes ab und sollte vom Anwender bestimmt werden. 8 Minuten bei
Raumtemperatur oder 2 Minuten bei 37 °C dürfte für die Mehrzahl der Proben ausreichend
sein. Nach den Schritten des Erwärmens und der proteolytischen Vorbehandlung nutzt dieses
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Kit eine gebrauchsfertige FISH Sondenmischung, basierend auf einer Kombination aus PNA(Peptidnukleinsäure-)-(12) und DNA-Technologie. Diese Sondenmischung besteht aus einer
Mischung von mit Texas Red markierten DNA-Sonden,
die eine Region von 218 kb – einschließlich des HER2-Gens auf Chromosom 17 – abdecken
und einer Mischung aus Fluorescein-markierten PNA-Sonden, die auf die Zentromerregion von
Chromosom 17 (CEN-17) abzielen. Die spezifische Hybridisierung der beiden Targets
resultiert in der Bildung eines deutlichen roten Fluoreszenzsignals an jedem HER2-Genlokus
und eines deutlichen grünen Fluoreszenzsignals an jedem Chromosom-17-Zentromer. Zum
Herabsetzen der Hintergrundanfärbung enthält die Sondenmischung auch nicht markierte
PNA-Blockierungssonden. Nach dem Stringenzwaschschritt und dem Spülen in zwei
unterschiedlichen Waschpuffern werden die Fluoreszenzsondensignale durch ein
immunhistochemisches Färbeverfahren in chromogene Signale umgewandelt. Der erste
Schritt ist die Blockierung der endogenen Peroxidase mit dem gebrauchsfertigen PeroxidaseBlock. Anschließend folgt die Inkubation mit der gebrauchsfertigen CISH Antikörpermischung,
bestehend aus einem Komplex von an Meerrettichperoxidase (HRP) konjugiertem Anti-FITC
und an alkalische Phosphatase (AP) konjugiertem Anti-Texas Red. Dann werden die
Gewebeschnitte in der roten Chromogenlösung und anschließend in der blauen Chromogenlösung
inkubiert. Die enzymatische Umwandlung der zugesetzten Chromogene führt zur Ausbildung
der sichtbaren roten und blauen Reaktionsprodukte an den Antigenstellen (FISH-Sonden).
Somit werden die roten Fluoreszenzsignale in rote Chromogensignale und die grünen
Fluoreszenzsignale entsprechend in blaue Chromogensignale umgewandelt. Danach können
die Proben gegengefärbt und eingedeckt werden. Die Ergebnisse werden mit Hilfe eines
Lichtmikroskops ausgewertet.
Mit Hilfe eines Lichtmikroskops wird der invasive Anteil der Tumorzellen lokalisiert und eine
Auszählung der roten (HER2) und blauen (CEN-17) Signale vorgenommen. Daraufhin wird
das HER2/CEN-17-Verhältnis berechnet. Im untersuchten Gewebeschnitt vorliegende
gesunde Zellen dienen als interne Positivkontrolle der Effizienz der Vorbehandlung und
Hybridisierung. Weitere Einzelheiten finden sich im Abschnitt über die Auswertung der
Färbeergebnisse.
Reagenzien
Mitgelieferte Materialien
Die unten angeführten Kitmaterialien reichen für 20 Tests aus (Definition eines Tests:
Targetbereich von 22 mm x 22 mm). Die Zahl der Tests basiert auf der Verwendung von
5-8 Tropfen (250 µL je Objektträger) aus Fläschchen 2, 10 µL je Objektträger aus Fläschchen
3, 400 µL je Objektträger aus Fläschchen 7 und 8 und 400 µL von Rotem Chromogen
(Fläschchen 11) und Blauem Chromogen (Fläschchen 12), in den entsprechenden
Substratpuffern (Fläschchen 9 und 10) verdünnt. Die Kitmaterialien sind für 20 Tests in 10
einzelnen Färbedurchgängen ausreichend. Für die Färbung auf der Dako Autostainer LinkPlattform enthält das Kit Materialien, die für 20 Tests in 5 einzelnen Färbedurchgängen
ausreichen.
Das HER2 CISH pharmDx™ Kit wird in zwei getrennten Packungseinheiten geliefert: SK109
Fläschchen 2 (Pepsin) in einem separaten Karton und die übrigen Reagenzien zusammen in
einem Kit-Karton. SK109 Fläschchen 2 (Pepsin) wird auf Trockeneis verpackt, der Kit-Karton
auf Kühl-Packs ausgeliefert. Um sicherzustellen, dass Fläschchen 2 (Pepsin) während des
Transport keinen hohen Temperaturen ausgesetzt wurden, muss bei Entgegennahme
des Kits immer noch Trockeneis vorhanden sein.
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Fläschchen 1
Vorbehandlungslösung (20x)
150 mL, 20-fach konzentriert
MES-(2-[N-Morpholino]ethansulfonsäure-)Puffer.
Fläschchen 2
Pepsin
7,5 mL, gebrauchsfertig
Pepsinlösung, pH 2,0, enthält Stabilisierungsmittel
und antimikrobiellem Wirkstoff.
Fläschchen 3
HER2/CEN-17 Sondenmischung
200 µL, gebrauchsfertig
Mischung aus Texas Red-markierten HER2-DNASonden und Fluorescein-markierten CEN-17-PNASonden in Hybridisierungspuffer mit 45 % Formamid,
Stabilisierungsmittel und nicht markierten
PNA-Blockierungssonden.
Fläschchen 4
Stringenzwaschpuffer (20x)
150 mL, 20-fach konzentriert
SSC-Puffer (saline-sodium citrate; NaCl + Natriumcitrat)
mit Detergens.
Fläschchen 5
Waschpuffer 1 (20x)
500 mL, 20-fach konzentriert
Tris/HCl-Puffer.
Fläschchen 6
Waschpuffer 2 (10x)
1 L, 10-fach konzentriert
Tris-gepufferte Kochsalzlösung mit 0,05 % Tween 20.
Fläschchen 7
Peroxidase-Block
9 mL, gebrauchsfertig. 3% Wasserstoffperoxidase mit
15 mmol/L Natriumazid (NaN3).
Fläschchen 8
CISH Antikörpermischung
9 mL, gebrauchsfertig.
Enthält eine Mischung eines an Meerrettichperoxidase
konjugierten Fluorescein-Antikörpers und eines an
alkalische Phosphatase konjugierten Texas-RedAntikörpers in 50 mmol/L Tris-Puffer, pH 7,5 mit
Stabilisator und Konservierungsmittel.
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Fläschchen 9
Roter Substratpuffer
12 mL, Substratpuffer zur Verdünnung von rotem
Chromogen.
Fläschchen 10
Blauer Substratpuffer
12 mL, Substratpuffer zur Verdünnung von
blauem Chromogen.
Fläschchen 11
Red Chromogen
120 µL, wird mit rotem Substratpuffer verdünnt
(Fläschchen 3)
Fläschchen 12
Blaues Chromogen
2 x 550 µL, wird mit blauem Substratpuffer verdünnt
(Fläschchen 10)
Fläschchen 13
CISH Eindeckmedium
5 mL, Permanent-Fixiermittel ohne Alkohol oder Xylol
Deckglas-Abdichtmittel
1 Tube, gebrauchsfertig
Lösung für das wieder entfernbare Versiegeln
von Deckgläsern.
Befüllbare Reagenzflaschen
5 mL Fassungsvermögen, 6 Flaschen*
12 mL Fassungsvermögen, 2 Flaschen**
Zur Verwendung auf der Dako Autostainer LinkPlattform
* Um mehr als 4 separate Färbungen durchzuführen, sind zusätzliche Flaschen erforderlich.
** Die 12-mL-Flaschen sind erforderlich, wenn alle 20 Tests in einem Färbedurchlauf verarbeitet werden sollen.
Zusätzlich benötigte Reagenzien und Zubehör (außerhalb des Lieferumfangs)
Laborreagenzien:
Destilliertes oder entionisiertes Wasser
Ethanol, 96 %
Xylol oder Xylol-Ersatz
Dako Hematoxylin, Code-Nr. S3301
Befüllbare Reagenzflaschen: 12 mL (Code-Nr. SK201) oder 5 mL (Code-Nr. SK200)
für verdünntes Hämatoxylin)
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Laborausstattungen-/geräte:
Flusenfreies Tuch
Einstellbare Pipetten
Kalibriertes Thermometer, teileingetaucht (Bereich 37-100 °C)
Kalibriertes Thermometer, teileingetaucht (Bereich 37-100 °C)***
Deckgläser (22 mm x 22 mm zur Hybridisierung von 10 µL und ex. 50 mm x 24 mm
zum Eindecken)
Pinzette
Abzugshaube
Dako Hybridizer (Code-Nr. S2450 oder S2451)* + Humidity Control Strips
(Code-Nr. S2452)*
Feuchtkammer
Objektträger, Dako Silanized Slides, Code-Nr. S3003, oder mit Poly-L-Lysin beschichtete
Objektträger (siehe Abschnitt zur Probenvorbereitung)
Färbeschalen oder -bäder
Vortexer (oder vergleichbares Gerät) und Tischzentrifuge
Kurzzeitmesser (auf Zeitabstände zwischen 2-30 Minuten ausgelegt)
Wasserbad mit Deckel (muss Temperaturen zwischen 65 (±2) °C und 99 °C
beibehalten können)
Mikrowellenherd mit Temperatursensor, falls Vorbehandlung mit Mikrowellenherd erfolgt
(siehe B3. Färbeprotokoll, Schritt 1: Vorbehandlung, Methode B)
Lichtmikroskop
*** Heizblock oder Hybridisierungsofen für die Denaturierung (82 (±2) °C) und Hybridisierung (45 (±2) °C),
zusammen mit einer Feuchtkammer, können alternativ zum Dako Hybridizer verwendet werden.
Zusätzliche, für die automatische Färbung in Dako Autostainer/Autostainer
Plus-Geräten erforderliche Materialien:
Autostainer Reagent Vials (Code-Nr. S3425)
Vorsichtsmaßnahmen
1.
2.
Zur In-vitro-Diagnostik
Nur für Fachpersonal bestimmt.
3.
Fläschchen 1, Vorbehandlungslösung (20x), enthält 1-<20 %
2-Morpholinoethansulphonsäure;
Fläschchen 2, Pepsin, enthält 5-10 % Propan-2-ol;
Fläschchen 4, Stringenzwaschpuffer (20x), enthält 1-<5 % Octoxinol
4.
5.
Fläschchen 5, Waschpuffer (20x), enthält 1-<20% Trometamol
Fläschchen 7, Peroxidase-Block, enthält Natriumazid
Bei den in diesem Produkt verwendeten Konzentrationen benötigen diese Substanzen
keine Warnhinweise. Von fachlich qualifizierten Anwendern können MaterialSicherheitsdatenblätter (MSDS) angefordert werden.
Fläschchen 2, Pepsin, enthält Pepsin A, das eine allergische Reaktion hervorrufen kann.
Fläschchen 3, HER2/CEN-17 Sondenmischung enthält 45 % Formamid und ist wie folgt
gekennzeichnet:
Giftig.
R61 Kann das Kind im Mutterleib schädigen.
S45 Bei Unfall oder Unwohlsein sofort Arzt hinzuziehen
(wenn möglich, dieses Etikett vorzeigen).
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S53 Exposition vermeiden – vor Gebrauch besondere Anweisungen einholen.
S60 Dieser Stoff und/oder sein Behälter sind als gefährlicher Abfall zu entsorgen.
Personen unter 18 Jahren dürfen mit diesem Produkt grundsätzlich nicht arbeiten.
Alle Anwender müssen sorgfältig in das richtige Arbeitsverfahren, die gefährlichen
Eigenschaften des Produkts und die notwendigen Sicherheitsmaßnahmen
eingewiesen werden.
Weitere Angaben bitte dem Sicherheitsdatenblatt für das Material entnehmen.
6. Das Deckglas-Abdichtmittel enthält 60-100 % hydroraffiniertes Naphtha (Leichtpetroleum)
und ist wie folgt gekennzeichnet:
Hochentzündlich.
Umweltgefährlich.
R11 Leichtentzündlich.
R51/53 Giftig für Wasserorganismen, kann in Gewässern längerfristig schädliche
Wirkungen haben.
S9 Behälter an einem gut gelüfteten Ort aufbewahren.
S16 Von Zündquellen fernhalten – Nicht rauchen.
S35 Abfälle und Behälter müssen in gesicherter Weise beseitigt werden.
S57 Zur Vermeidung einer Kontamination der Umwelt geeigneten Behälter verwenden.
S61 Freisetzung in die Umwelt vermeiden. Besondere Anweisungen
einholen/Sicherheitsdatenblatt zu Rate ziehen. Weitere Informationen bitte dem
Material-Sicherheitsdatenblatt (MSDS) entnehmen.
7. Fläschchen 7, Peroxidase-Block, enthält Natriumazid (NaN3), eine in reiner Form äußerst
giftige Chemikalie. Ansammlungen von NaN3 können auch in Konzentrationen, die nicht
als gefährlich klassifiziert sind, mit Blei- und Kupferabflussrohren reagieren und
hochexplosive Metallazide bilden. Nach der Entsorgung stets mit viel Wasser
nachspülen, um Azidansammlungen in den Leitungen vorzubeugen.
8. Fläschchen 11, Red Chromogen, enthält Fast Red KL Salt und ist wie folgt gekennzeichnet:
Giftig
R45 Kann Krebs erzeugen.
S35 Abfälle und Behälter müssen in gesicherter Weise beseitigt werden.
S45 Bei Unfall oder Unwohlsein sofort Arzt hinzuziehen (wenn möglich, dieses Etikett
vorzeigen).
S53 Exposition vermeiden – vor Gebrauch besondere Anweisungen einholen.
Personen unter 18 Jahren dürfen mit diesem Produkt grundsätzlich nicht arbeiten.
Alle Anwender müssen sorgfältig in das richtige Arbeitsverfahren, die gefährlichen
Eigenschaften des Produkts und die notwendigen Sicherheitsmaßnahmen eingewiesen
werden (gemäß EU-Richtlinie 94/33/EG).
Weitere Informationen bitte dem Material-Sicherheitsdatenblatt (MSDS) entnehmen.
9. Fläschchen 12, Blaues Chromogen, enthält 5-amino-2-[3-[5-amino-1,3-dihydro-3,3dimethyl-1-(4-sulfobutyl)- 2H-indol-2-ylidene]-1-propenyl]-3,3-dimethyl-1-(4-sulfobutyl)-3HIndolium, ter trifluoroacetate.
Achtung: Dieses Produkt enthält eine Substanz, die noch nicht vollständig erforscht
wurde. Personen unter 18 Jahren dürfen mit diesem Produkt grundsätzlich nicht arbeiten.
Alle Anwender müssen sorgfältig in das richtige Arbeitsverfahren, die gefährlichen
Eigenschaften des Produkts und die notwendigen Sicherheitsmaßnahmen eingewiesen
werden (gemäß EU-Richtlinie 94/33/EG).
Weitere Informationen bitte dem Material-Sicherheitsdatenblatt (MSDS) entnehmen.
10. Fläschchen 13, CISH Eindeckmedium.
Sicherheitsdatenblatt für Fachpersonal auf Anfrage erhältlich.
11. Proben müssen ebenso wie alle ihnen ausgesetzten Materialien vor und nach dem
Fixieren in einer Weise behandelt werden, als seien sie zum Übertragen von Infektionen
befähigt. Außerdem muss die Entsorgung unter Beachtung der korrekten Vorsichtsmaßnahmen
erfolgen (13). Reagenzien nie mit dem Mund pipettieren und Haut- bzw. Schleimhautkontakt mit
Reagenzien und Proben vermeiden. Empfindliche Bereiche nach Kontakt mit den
Reagenzien mit reichlich Wasser waschen.
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12. Mikrobielle Kontamination von Reagenzien vermeiden, da dies falsche Ergebnisse
hervorrufen könnte.
13. Von den angegebenen Spezifikationen abweichende Inkubationszeiten, Temperaturen
oder Methoden können zu fehlerhaften Resultaten führen.
14. Verfahren der Gewebefixierung und Schnittdicken, die von den gemachten Angaben
abweichen, können die Gewebemorphologie und/oder die Signalintensität beeinträchtigen.
15. Während der Hybridisierung ein Verdunsten der HER2/CEN-17 Sondenmischung
vermeiden, indem für ausreichende Feuchtigkeit in der Hybridisierungskammer
gesorgt wird.
16. Die Reagenzien wurden zur Verwendung mit dem Eridan Staining System optimal
verdünnt. Eine weitergehende Verdünnung kann zu einem Leistungsverlust führen.
17. Nicht verwendete Lösung ist entsprechend örtlichen, bundesstaatlichen und staatlichen
Richtlinien zu entsorgen.
18. Um einen Kontakt mit Augen und Haut zu vermeiden, ist angemessene persönliche
Schutzausrüstung zu tragen. Auf Anfrage ist das Material-Sicherheitsdatenblatt (MSDS)
erhältlich.
19. Es wird empfohlen, der Standardverfahrensanweisung bezüglich Kundendienst und
Wartung des Dako Autostainer-Geräts zu folgen.
20. Menschen, die an einer Farbsehstörung leiden, sollten die Proben mit
Zurückhaltung bewerten.
21. Wie alle Produkte biologischen Ursprungs müssen auch diese entsprechend
gehandhabt werden.
22. Vor dem Ansetzen der blauen Chromogenlösung sollte das Blaue Chromogen
(Fläschchen 12) gründlich gemischt werden, um die vollständige Auflösung des
Chromogens sicherzustellen.
23. Es wird empfohlen, zwei Auftropfbereiche von je 200 µL (1 und 3) auf dem Dako
Autostainer-Gerät zu verwenden, um die ganze Objektträgerfläche abzudecken
und zu verhindern, dass größere Gewebeschnitte austrocknen.
Aufbewahrung
Das HER2 CISH pharmDx™ wird in zwei getrennten Packungseinheiten geliefert: SK109
Fläschchen 2 (Pepsin) in einem separaten Karton und die übrigen Reagenzien zusammen in
einem Kit-Karton. SK109 Fläschchen 2 (Pepsin) wird auf Trockeneis verpackt, der Kit-Karton
auf Kühl-Packs ausgeliefert. Um sicherzustellen, dass Fläschchen 2 (Pepsin) während des
Transports keinen hohen Temperaturen ausgesetzt wurden, muss bei Entgegennahme
des Kits immer noch Trockeneis vorhanden sein.
Alle Kit-Reagenzien, ausgenommen Fläschchen 13 (CISH Eindeckmedium) bei 2-8 °C
aufbewahren. Fläschchen 13 (CISH Eindeckmedium) ist bei Raumtemperatur aufzubewahren.
Fläschchen 3, 7 und 8 sind lichtgeschützt bei 2-8 °C aufzubewahren.
Pepsin und Red Chromogen (Fläschchen 2 und 11) können durch Wärmeeinwirkung
beeinträchtigt werden. Diese Kit-Komponenten dürfen nicht Raumtemperatur
ausgesetzt werden.
Das Kit darf nicht nach dem auf dem Außenkarton angegebenen Verfallsdatum verwendet
werden. Sollten die Reagenzien unter anderen Bedingungen als den in der Packungsbeilage
beschriebenen aufbewahrt werden, so muss die Reagenzienleistung vom Anwender verifiziert
werden (14).
Es gibt keine offensichtlichen Anzeichen für eine eventuelle Produktinstabilität. Folglich ist es
wichtig, dass die im untersuchten Gewebeschnitt vorliegenden gesunden Zellen bewertet
werden. Wenn ein unerwartetes Färbemuster beobachtet wird, welches durch Änderungen in
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den Labormethoden nicht erklärt werden kann, und falls Verdacht auf ein Problem mit dem
HER2 FISH pharmDx™ Kit besteht, ist Kontakt mit unserem technischen Kundendienst
aufzunehmen.
Vorbereitung der Probe
Die Handhabung von Biopsie-, Exzisions- oder Resektionsproben muss dergestalt erfolgen,
dass die Gewebe für die CISH-Analyse erhalten bleiben. Für alle Proben sollten
Standardmethoden der Gewebeverarbeitung für das immunhistochemische Anfärben
genutzt werden (15).
Paraffineingebettete Schnitte
Für die Verwendung sind nur in neutralem gepuffertem Formalin konservierte und
paraffineingebettete Schnitte geeignet. Von Proben sollten beispielsweise Präparatblöcke mit
einer Dicke von 3 mm oder 4 mm angefertigt werden, gefolgt von 18-24 Stunden Fixierung in
neutralem gepuffertem Formalin. Die Dehydrierung der Gewebeschnitte erfolgt dann in einer
abgestuften Reihe von Ethanol und Xylol, gefolgt von der Infiltration mit geschmolzenem
Paraffin, das auf einer Temperatur von nicht mehr als 60 °C gehalten wird. Sachgemäß fixierte
und eingebettete Gewebe sind vor dem Anfertigen der histologischen Schnitte und dem
Aufziehen auf Objektträgern bei kühler Lagerung (15-25 °C) unbegrenzt haltbar (15-16).
Andere Fixiermittel sind nicht geeignet.
Gewebeproben sollten in Schnitte von 4-6 µm Stärke geschnitten werden.
Es wird empfohlen, die histologischen Schnitte auf Dako Silanized Slides, Code-Nr.
S3003, oder auf mit Poly-L-Lysin beschichtete Objektträger aufzuziehen. Proben
sollten bei Aufbewahrung bei Raumtemperatur (20-25°C) innerhalb von 4-6 Monaten
nach Anfertigen der Schnitte analysiert werden.
GEBRAUCHSANWEISUNG
A. Vorbereitung der Reagenzien
Es wird empfohlen, die folgenden Reagenzien vor der Färbung anzusetzen:
Tag 1, Sondenhybridisierung:
A.1 Vorbehandlungslösung
In Fläschchen 1 kann Kristallbildung auftreten, Kristalle werden sich jedoch bei
Raumtemperatur auflösen. Vor Ansetzen des Reagenzes muss sichergestellt werden,
dass keine Kristalle vorliegen.
Aus Fläschchen 1 (Vorbehandlungslösung 20x) eine ausreichende Reagenzmenge ansetzen,
indem das Konzentrat im Verhältnis von 1:20 mit destilliertem oder entionisiertem Wasser
verdünnt wird. Nicht verbrauchte angesetzte Lösung kann einen Monat lang bei 2-8 °C
aufbewahrt werden. Getrübte verdünnte Lösung entsorgen.
A.2 Stringenzwaschpuffer
Aus Fläschchen 4 (Stringenzwaschpuffer 20x) eine ausreichende Reagenzmenge ansetzen,
indem das Konzentrat im Verhältnis von 1:20 mit destilliertem oder entionisiertem Wasser
verdünnt wird. Nicht verbrauchter angesetzter Puffer kann einen Monat lang bei 2-8 °C
aufbewahrt werden. Angesetzter Puffer mit getrübtem Aussehen muss entsorgt werden.
A.3 Waschpuffer 1
Aus Fläschchen 5 (Waschpuffer 1 20x) eine ausreichende Reagenzmenge ansetzen, indem
das Konzentrat im Verhältnis von 1:20 mit destilliertem oder entionisiertem Wasser verdünnt
wird. Nicht verbrauchter angesetzter Puffer kann einen Monat lang bei 2-8 °C aufbewahrt
werden. Angesetzter Puffer mit getrübtem Aussehen muss entsorgt werden.
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A.4 Ethanolreihe
Aus einer 96 %igen Ethanol-Lösung drei Gefäße mit jeweils 70 %igem, 85 %igem und
96 %igem Ethanol ansetzen. Abgedeckte Gefäße bei Raumtemperatur oder 2-8 °C
aufbewahren und für maximal 200 Objektträger verwenden. Angesetzte Lösungen mit
getrübtem Aussehen müssen entsorgt werden.
Tag 2, Immunhistochemische Färbung:
Alle Reagenzien für die immunhistochemische Färbung (Fläschchen 6-13), außer Red
Chromogen (Fläschchen 11), sind vor der Reagenzienvorbereitung auf Raumtemperatur
(20-25 °C) zu bringen. Während dieses Vorgangs sind die Reagenzien vor Licht
zu schützen.
A.5 Waschpuffer 2
Eine für das geplante Färbeverfahren ausreichende Menge Waschpuffer 2 (Fläschchen 6) ist
im Verhältnis 1:10 mit destilliertem oder entionisiertem Wasser zu verdünnen. Unverbrauchte
angesetzte Lösung kann bei 2-8 °C einen Monat lang aufbewahrt werden. Angesetzte Lösung
mit getrübtem Aussehen muss entsorgt werden Waschpuffer 2 kann durch Dako Waschpuffer,
Code-Nr. S3006 ausgetauscht werden.
A.6 Rote Chromogenlösung
Vor Entnahme einer Teilmenge Roten Chromogens aus Fläschchen 11 die Lösung kippen
oder mischen und kurz zentrifugieren. Eine ausreichende Menge rote Chromogenlösung
(mindestens 1 mL) ansetzen. Der Anteil beträgt 10 µL pro 1 mL, wobei durch folgendes
Verfahren 1,01 mL rote Chromogenlösung gewonnen wird:
1 mL roten Chromogenpuffer aus Fläschchen 9 in ein geeignetes, leeres Fläschchen geben.
10 µL rotes Chromogen aus Fläschchen 11 zugeben und gut mischen.
Hinweis: Die angesetzte rote Chromogenlösung innerhalb von 20 Minuten verbrauchen.
Um das bestmögliche Ergebnis zu erzielen, wird die Anfertigung von roter Chromogenlösung
unmittelbar vor Gebrauch empfohlen.
A.7 Blaue Chromogenlösung
Vor Entnahme einer Teilmenge Blaues Chromogen aus Fläschchen 12 das Chromogen
gründlich mischen und kurz zentrifugieren, um die Flüssigkeit vom Deckel zu entfernen.
Dann sofort mit der Vorbereitung der blauen Chromogenlösung fortfahren.
Eine ausreichende Menge blauer Chromogenlösung für einen kompletten Durchgang
vorbereiten.
Für die Vorbereitung von 1,075 mL blauer Chromogenlösung 1 mL blauen Substratpuffer aus
Fläschchen 10 in eine geeignete, leere Fläschchen geben. 75 µL blaues Chromogen aus
Fläschchen 12 zugeben und gut mischen.
Falls ein kleineres Volumen blaue Chromogenlösung ausreicht, kann die Größenordnung
entsprechend reduziert werden – z. B. werden für den Ansatz von 430 µL blauer
Chromogenlösung 30 µL gründlich gemischtes blaues Chromogen aus Fläschchen 12 in
400 µL blauen Substratpuffer aus Fläschchen 10 gegeben.
Hinweis: Es wird empfohlen, die blaue Chromogenlösung mindestens 30 Minuten vor der
Verwendung anzusetzen. Die blaue Chromogenlösung ist 8 Tagen lang verwendbar, wenn sie
lichtgeschützt bei 2-8 °C aufbewahrt wurde.
A.8 Gegenfärbung
Eine für das geplante Färbeverfahren ausreichende Menge Dako Hematoxylin (Code-Nr.
S3301) im Verhältnis 1:5 mit destilliertem oder entionisiertem Wasser verdünnen. Nicht
verwendetes, bereits verdünntes Hämatoxylin kann bei 20-25 °C einen Tag lang
aufbewahrt werden.
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B. Arbeitsablauf des Färbens
B.1 Verfahrenshinweise
Vor der Verwendung sind alle diese Anleitungen durchzuarbeiten und Benutzer sollten sich mit
allen Kit-Komponenten vertraut machen (siehe „Hinweise und Vorsichtsmaßnahmen“).
Alle Reagenzien sind vor ihrer Verwendung wie folgt auf die jeweilige Temperatur zu bringen:
Fläschchen 1:
Die verdünnte Vorbehandlungslösung wird 95-99 °C erwärmt, falls die
Vorbehandlung in einem Wasserbad erfolgt (B3. Färbeprotokoll, Schritt 1:
Vorbehandlung, Methode A). Falls ein Mikrowellenherd mit
Temperatursensor für die Vorbehandlung verwendet wird (B3.
Färbeprotokoll, Schritt 1: Vorbehandlung, Methode B), sollte die verdünnte
Vorbehandlungslösung auf Raumtemperatur
20-25 °C gebracht werden.
Fläschchen 2:
Fläschchen 3:
Pepsin sollte ständig kühl bei 2-8 °C aufbewahrt werden.
HER2/CEN-17 Sondenmischung kann bei jeder beliebigen Temperatur
zwischen 2-25 °C aufgebracht werden.
Der verdünnte Stringenzwaschpuffer sollte vor der Verwendung auf
Raumtemperatur bzw. 65 (±2) °C gebracht werden.
Fläschchen 4:
Fläschchen 5:
Den verdünnten Waschpuffer 1 Raumtemperatur 20-25 °C annehmen
lassen.
Fläschchen 6:
Den Waschpuffer 2 (10x) Raumtemperatur von 20-25 °C annehmen lassen,
bevor er mit auf Raumtemperatur gebrachtem destilliertem oder
entionisiertem Wasser verdünnt wird.
Fläschchen 7:
Peroxidase-Block ist auf Raumtemperatur 20-25 °C zu bringen.
Fläschchen 8:
CISH Antikörpermischung ist auf Raumtemperatur 20-25 °C zu bringen
Fläschchen 9:
Roter Substratpuffer ist auf Raumtemperatur 20-25 °C zu bringen.
Fläschchen 10: Blauer Substratpuffer ist auf Raumtemperatur 20-25 °C zu bringen.
Fläschchen 11: Rotes Chromogen sollte ständig kühl at 2-8 °C aufbewahrt werden.
Fläschchen 12: Blaues Chromogen ist auf Raumtemperatur 20-25 °C zu bringen.
Fläschchen 13: Das Fixiermittel sollte eine Raumtemperatur von 20-25 °C annehmen.
Deckglas-Abdichtmittel: Das Deckglas-Abdichtmittel kann bei jeder beliebigen Temperatur
zwischen 2 °C und 25 °C aufgebracht werden.
Alle Schritte müssen bei den angegebenen Temperaturbereichen durchgeführt werden.
Das Verfahren schließt eine Reihe von Dehydrierungsschritten ein, an die sich das Trocknen
der Gewebeschnitte anschließt. Das vollständige Trocknen der Gewebeschnitte muss
sichergestellt werden, bevor mit dem nächsten Schritt fortgefahren wird. Während weiterer
Schritte des Färbeverfahrens dürfen Gewebeschnitte nicht austrocknen.
Muss das Färbeverfahren unterbrochen werden, können Objektträger nach der
Entparaffinierung bis zu 1 Stunde lang bei Raumtemperatur (20-25 °C) in Waschpuffer 1
aufbewahrt werden, ohne dass es zu einer Beeinträchtigung der Färberesultate kommt.
Manuelle immunhistochemische Färbung:
Alle Inkubationen bei Raumtemperatur (20-25 °C) durchführen.
Automatische immunhistochemische Färbung:
Dako Autostainer/Autostainer Plus-Geräte:
Alle Inkubationen bei Raumtemperatur (20-25 °C) durchführen. Die entsprechenden Volumina
aus Fläschchen 7 (Peroxidase-Block) und Fläschchen 8 (CISH Antikörpermischung) sind in die
Dako Autostainer Reagent Vials (Code-Nr. S3425) überführt werden, wobei die übrigen
(120946-003)
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Reagenzien (rote und blaue Chromogenlösung, angesetztes Hämatoxylin und Waschpuffer 2
für die 5 Minuten Post-Gegenfärbungsinkubation) direkt in Autostainer Reagent Vials (CodeNr. S3425) angesetzt werden sollten. Zwei Tropfzonen (1 und 3) mit je 200 µL wählen, um
ungleichmäßige Färbung und Austrocknen der Objektträger zu vermeiden.
Dako Autostainer Link-Geräte:
Alle Inkubationen bei Raumtemperatur (20-25 °C) durchführen. Fläschchen 7 (PeroxidaseBlock) und Fläschchen 8 (CISH Antikörpermischung) können direkt auf dem Gerät geladen
werden, während rote bzw. blaue Chromogenlösung und die Hämatoxylin-Verdünnung in
befüllbaren Fläschchenn angesetzt werden sollten. Die im Kit enthaltenen Reagenzien reichen
für 20 Tests in 5 Einzeldurchgängen aus. Die Standardeinstellung ist eine Tropfzone mit
200 µL Reagenz. Manuell zwei Tropfzonen (1 und 3) mit je 200 µL wählen, um
ungleichmäßige Färbung und Austrocknen der Objektträger zu vermeiden.
Wenn 20 Proben in einem Färbedurchgang laufen, befüllbare 12-mL-Fläschchen für die
Ansätze der roten und blauen Chromogenlösung verwenden.
Auf die Inkompatibilität mit anderen Protokollen in demselben Autostainer-Durchgang aufgrund
der Stabilität der roten Chromogenlösung nach der Zubereitung achten. Um die kurze Stabilität
der roten Chromogenlösung auszugleichen, können maximal 30 Objektträger auf dem Gerät in
einem Färbedurchgang gefärbt werden.
B.2 Entparaffinierung
Entparaffinierung und Rehydrierung: Vor Durchführen der Analyse müssen Objektträger
mit Gewebeschnitten zum Entfernen des Einbettmediums entparaffiniert und rehydriert
werden. Das Paraffin muss vollständig entfernt werden. Überreste des Einbettmediums
können eine stärkere unspezifische Färbung zur Folge haben. Diesen Schritt bei
Raumtemperatur
(20-25 °C) durchführen.
1. Die Objektträger in ein Xylolbad stellen und 5 (±1) Minuten inkubieren. Den Vorgang in
einem frischen Bad wiederholen.
2. Überschüssige Flüssigkeit abklopfen und Objektträger 2 (±1) Minuten lang in 96%iges
Ethanol geben. Den Vorgang in einem frischen Bad wiederholen.
3. Überschüssige Flüssigkeit abklopfen und Objektträger 2 (±1) Minuten lang in 70%iges
Ethanol geben. Den Vorgang in einem frischen Bad wiederholen.
4. Überschüssige Flüssigkeit abklopfen und Objektträger mindestens 2 Minuten lang in
verdünnten Waschpuffer 1 geben (siehe GEBRAUCHSANLEITUNG, Abschnitt A.3).
Das Färbeverfahren, wie in Abschnitt B.3, Schritt 1, Vorbehandlung, erläutert, beginnen.
Muss die Färbung unterbrochen wird, können Objektträger nach der Entparaffinierung bis zu
1 Stunde lang bei Raumtemperatur (20-25 °C) in Wasc hpuffer 1 aufbewahrt werden, ohne
dass es zu einer Beeinträchtigung der Färberesultate kommt.
Xylol- und Alkohollösungen sind nach maximal 200 Objektträgern zu erneuern.
Es kann Xylol-Ersatz verwendet werden.
HINWEIS: Die in diesem Kit enthaltenen Reagenzien und Anweisungen wurden für eine
optimale Leistung konzipiert. Weitere Verdünnungen der Kit-Reagenzien oder Abänderungen
der Inkubationstemperaturen können zu fehlerhaften oder unstimmigen Ergebnissen führen.
Unterschiede bei der Gewebeverarbeitung und bei den technischen Verfahren im Labor des
Benutzers können die Ergebnisse des Assays hinfällig machen. Die regelmäßige Verwendung
eigener Kontrollobjektträger im Labor wird für die externe Qualitätskontrolle empfohlen.
B.3 Färbeprotokoll
TAG 1
Schritt 1: Vorbehandlung
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Die Vorbehandlung kann entweder in einem Wasserbad erfolgen, wie in der folgenden
Methode A) beschrieben, oder alternativ durch Verwendung eines Mikrowellenherds mit
Temperatursensor, wie anschließend unter Methode B) beschrieben.
Methode A) Vorbehandlung mit Wasserbad:
Färbebehältnisse, wie z. B. Coplin-Schalen, mit verdünnter Vorbehandlungslösung befüllen
(siehe GEBRAUCHSANLEITUNG, Abschnitt A.1). Vorbehandlungslösung enthaltende
Färbeschalen in ein Wasserbad stellen. Wasserbad und Vorbehandlungslösung auf 97-99°C
erwärmen. Temperatur in der Schale mit einem kalibrierten Thermometer messen, um die
korrekte Temperatur zu gewährleisten. Schalen mit Deckeln versehen, um eine
Temperaturstabilisierung zu erreichen und um Verdunsten zu vermeiden.
Die auf Raumtemperatur gebrachten entparaffinierten Schnitte in die vorgewärmte
Vorbehandlungslösung in den Färbeschalen einlegen. Temperatur erneut messen und
10 (±1) Minuten lang bei 95-99 °C inkubieren.
Gesamte Färbeschale samt Objektträger aus dem Wasserbad heben. Deckel abnehmen
und die Objektträger 15 Minuten lang in der Vorbehandlungslösung bei Raumtemperatur
abkühlen lassen.
Objektträger für 3 Minuten in eine Färbeschale mit verdünntem Waschpuffer 1 von
Raumtemperatur (20-25 °C) geben (siehe GEBRAUCHSANLEITUNG, Abschnitt A.3).
Waschpuffer 1 ersetzen und Gewebeschnitte weitere 3 Minuten einweichen lassen.
Methode B) Vorbehandlung durch Mikrowellenherd mit Temperatursensor:
Ein Plastikgefäß mit verdünnter Vorbehandlungslösung füllen (Raumtemperatur 20-25 °C). Die
entparaffinierten Schnitte in Vorbehandlungslösung tauchen, das Gefäß mit einem punktierten
Deckel abdecken und in den Mikrowellenherd stellen. Kochtemperatursensor auswählen und
ein Programm, das nach Erreichen der Kochtemperatur 10 Minuten lang weiterläuft.*
Nach der 10-minütigen Inkubation das Gefäß mit den Objektträgern aus dem Herd nehmen,
den Deckel entfernen und 15 Minuten bei Raumtemperatur abkühlen lassen. Die Objektträger
in ein Gefäß mit verdünntem Waschpuffer 1 transferieren und 3 Minuten bei Raumtemperatur
(20-25 °C) einweichen lassen. Waschpuffer 1 ersetzen und Gewebeschnitte weitere 3 Minuten
einweichen lassen.
*Verwendung eines Mikrowellenherds mit Temperatursensor heißt, der Herd muss mit einem Sensor
sowie mit einem Programm ausgestattet sein, das die Vorbehandlungslösung zunächst auf den
Siedepunkt erhitzt und danach die erforderliche Vorbehandlungstemperatur (über 95 °C) beibehält, bis
die voreingestellte Restzeit (10 (±1) Minuten) abgelaufen ist. Einige Mikrowellenherdmodelle mit
Temperatursensor bieten unter Umständen nicht die Möglichkeit, eine beliebige Restzeit einzustellen.
Falls das Modell lediglich voreingestellte Programme bietet, ist darauf zu achten, ein Programm
auszuwählen, das die erforderliche Vorbehandlungstemperatur (über 95 °C) mindestens 10 (±1) Minuten
lang beibehält, und das Programm nach 10 (±1) Minuten manuell zu stoppen.
HINWEIS: Die Vorbehandlungslösung ist ausschließlich für den Einmalgebrauch ausgelegt.
Nicht wiederverwenden.
Schritt 2: Pepsin, gebrauchsfertig
Die Pepsin-Inkubation kann entweder bei Raumtemperatur (20-25 °C), wie unter Methode A),
oder alternativ bei 37 °C erfolgen, wie unter Methode B) beschrieben.
Überschüssigen Waschpuffer 1 abklopfen. Mit einem flusenfreien Tuch (wie z. B. einem
saugfähigen Labortuch oder Gazetupfer) vorsichtig rund um die Probe alle verbleibende
Flüssigkeit abwischen und dafür sorgen, dass Reagenzien innerhalb des vorgeschriebenen
Bereichs verbleiben.
5-8 Tropfen (250 µL) kaltes (2-8 °C) Pepsin (Fläschchen 2) zum Bedecken der Probe
aufbringen. Pepsin immer bei 2-8 °C lagern.
Methode A) Inkubation bei Raumtemperatur:
8 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubieren (20-25 °C). Bei den meisten Proben ist eine
Inkubationszeit von 8 Minuten angemessen. Die optimale Inkubationszeit schwankt jedoch in
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Abhängigkeit von der Historie der Gewebefixierung und/oder Dicke des histologischen Schnitts
und muss vom Anwender bestimmt werden.
Pepsin abklopfen und Schnitte 3 Minuten lang bei Raumtemperatur (20-25 °C) in einer
Färbeschale mit verdünntem Waschpuffer 1 (siehe GEBRAUCHSANLEITUNG, Abschnitt A.3)
weichen lassen.
Verdünnten Waschpuffer 1 ersetzen und Schnitte weitere 3 Minuten lang einweichen. Weiter
mit Dehydrierung.
Methode B) Inkubation bei 37 °C:
Probe mit Pepsin auf einen Heizblock bei 37 °C stellen – z. B. Dako Hybridizer – und 2
Minuten lang inkubieren. Bei den meisten Proben ist eine Inkubationszeit von 2 Minuten
angemessen. Die optimale Inkubationszeit schwankt jedoch in Abhängigkeit von der
Gewebefixierung und/oder Dicke des histologischen Schnitts und muss vom Anwender
bestimmt werden.
Pepsin durch Abklopfen entfernen und Gewebeschnitte 3 Minuten lang in verdünntem
Waschpuffer 1 bei Raumtemperatur (20--25 °C) einweichen lassen.
Waschpuffer 1 ersetzen und Gewebeschnitte weitere 3 Minuten einweichen lassen.
Weiter mit Dehydrierung.
Gewebeschnitte in einer abgestuften Reihe von Ethanol dehydrieren (siehe
GEBRAUCHSANLEITUNG, Abschnitt A.4): 2 Minuten in 70 %igem Ethanol, 2 Minuten in
85 %igem Ethanol und 2 Minuten in 96 %igem Ethanol.
Gewebeschnitte an der Luft vollständig trocknen lassen.
Schritt 3: HER2/CEN-17 Sondenmischung, gebrauchsfertig
Der folgende Schritt sollte unter einer Abzugshaube durchgeführt werden.
10 µL HER2/CEN-17 Sondenmischung (Fläschchen 3) auf der Mitte des Gewebeschnitts
aufbringen. Sofort über der Sondenmischung ein Deckglas von 22 mm x 22 mm Größe
auflegen und Sondenmischung sich gleichmäßig unter dem Deckglas ausbreiten lassen.
Einschluss von Luftblasen vermeiden. Sollten Luftblasen festgestellt werden, werden sie mit
der Pinzette vorsichtig aus dem Gewebe herausgeklopft.
Deckglas mit Deckglas-Abdichtmitteln versiegeln, indem das Abdichtmittel rund um die
Peripherie des Deckglases aufgetragen wird. Das Deckglas-Abdichtmittel das Deckglas und
den Objektträger so überlappen lassen, dass es eine Abdichtung rund um das Deckglas bildet.
Das Deckglas-Abdichtmittel muss den gesamten Rand des Deckglases abdecken.
Dako Hybridizer* (Code-Nr. S2450 oder S2451) für einen Hybridisierungslauf vorbereiten.
Hybridizer starten und ein Programm wählen, das bei 82 °C 5 Minuten lang denaturiert, und über
Nacht (14-20 Stunden) bei 45 °C hybridisieren (weitere Einzelheiten siehe Dako HybridizerGebrauchsanweisung).
Objektträger in den Hybridizer legen. Humidity Control Strips (Code-Nr. S2452) müssen
gesättigt und optimal für den Gebrauch sein. Sicherstellen, dass der Deckel richtig geschlossen
ist, und das Programm starten.
* Für Denaturierung und Hybridisierung können Geräte eingesetzt werden, die Bedingungen
bereitstellen, die den oben beschriebenen ähnlich sind.
TAG 2
Schritt 4: Waschen mit Stringent Wash
Zwei Färbebehältnisse, wie z. B. Coplin-Schalen, mit verdünntem Stringenzwaschpuffer
befüllen (siehe GEBRAUCHSANLEITUNG, Abschnitt A.2). Für jede Schale wird ein
Mindestvolumen von 100 mL oder von 15 mL pro Objektträger empfohlen.
Eine Färbeschale mit verdünntem Stringenzwaschpuffer bei Raumtemperatur unter eine
Abzugshaube und die andere Färbeschale in ein Wasserbad stellen. Wasserbad und den
verdünnten Stringenzwaschpuffer auf 65 (±2) °C erwärmen. Die Temperatur muss sich
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stabilisiert haben. Schale mit Deckel versehen, um eine Temperaturstabilisierung zu erreichen
und um Verdunsten zu vermeiden. Temperatur innerhalb der Schale im Wasserbad mit einem
kalibrierten Thermometer messen, um die korrekte Temperatur zu gewährleisten. Der
Stringenzwaschpuffer enthält ein Detergens, das bei 65 °C ein getrübtes Aussehen annehmen
kann. Die Leistung wird hierdurch nicht beeinträchtigt.
Mit einer Pinzette oder mit den durch Handschuhe geschützten Händen die Objektträger aus
der Hybridisierungskammer nehmen. Vorsichtig Deckglas-Abdichtmittel ebenso wie das
Deckglas entfernen und die Objektträger jeweils einen nach dem anderen in die
Raumtemperatur aufweisende Schale für den Vorwaschschritt geben.
Sobald alle Deckel entfernt worden sind, die Objektträger wieder aus der Vorwasch-Schale mit
der raumwarmen Lösung herausnehmen und in die 65 (±2) °C warme Schale im Wasserbad
legen. Die Stringenzwaschung genau 10 Minuten lang vornehmen (NICHT warten, bis die
Temperatur wieder 65 (±2) °C erreicht hat, bevor die Inkubationszeit gestartet wird).
Objektträger aus dem verdünnten Stringenzwaschpuffer herausheben und Schnitte 3 Minuten
lang bei Raumtemperatur (20-25 °C) in verdünntem Waschpuffer 1 einweichen.
Verdünnten Waschpuffer 1 ersetzen und Schnitte 3 weitere Minuten lang einweichen.
B.3.1 Protokoll für manuelle immunchemische Färbung
Alle Schritte, mit Ausnahme des Trocknens, bei Raumtemperatur (20-25 °C)
durchführen.
Schritt 5: Waschen
Objektträger aus dem verdünnten Waschpuffer 1 nehmen und Schnitte 3 Minuten lang in
verdünntem Waschpuffer 2 einweichen (siehe GEBRAUCHSANLEITUNG, Abschnitt A.5).
Schritt 6: Peroxidase-Block
Überschüssigen Puffer abklopfen. Den Bereich um die Probe herum mit einem flusenfreien
Tuch sorgfältig abtupfen, um restliche Flüssigkeit zu entfernen und die Reagenzien an der
vorgesehenen Stelle zu belassen.
Probe mit 400 µL Peroxidase-Block bedecken.
5 (±1) Minuten inkubieren.
3 Minuten lang in verdünntem Waschpuffer 2 eintauchen.
Vorgang mit frischem Waschpuffer 2 wiederholen.
Schritt 7: CISH Antikörpermischung
Überschüssigen Puffer abklopfen und Objektträger, wie oben beschrieben, abwischen.
Probe mit 400 µL CISH Antikörpermischung bedecken.
30 (±1) Minuten in einer Feuchtkammer inkubieren.
3 Minuten lang in verdünntem Waschpuffer 2 eintauchen. Vorgang mit frischem Waschpuffer
2 wiederholen.
Schritt 8: Rote Chromogenlösung (direkt vor Gebrauch ansetzen, siehe
GEBRAUCHSANLEITUNG, Abschnitt A.6)
Überschüssigen Puffer abklopfen und Objektträger, wie oben beschrieben, abwischen.
Probe mit 400 µL roter Chromogenlösung bedecken.
10 Minuten in einer Feuchtkammer inkubieren.
3 Minuten lang in verdünntem Waschpuffer 2 eintauchen. Vorgang mit frischem Waschpuffer
2 wiederholen.
Schritt 9: Blaue Chromogenlösung (30 Minuten bis 8 Tage vor Gebrauch ansetzen, siehe
GEBRAUCHSANLEITUNG, Abschnitt A.7)
Überschüssigen Puffer abklopfen und Objektträger, wie oben beschrieben, abwischen.
Probe mit 400 µL blauen Chromogenlösung bedecken.
10 Minuten in einer Feuchtkammer inkubieren.
3 Minuten lang in verdünntem Waschpuffer 2 eintauchen. Vorgang mit frischem Waschpuffer
2 wiederholen.
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Schritt 10: Gegenfärbung
Probe mit 400 µL verdünntem Hämatoxylin (Dako Hematoxylin, Code-Nr. S3301 im Verhältnis
1:5 verdünnt, siehe GEBRAUCHSANLEITUNG, Abschnitt A.8) 5 Minuten lang bedecken.
Mit Waschpuffer 2 abspülen und Gewebeschnitte mindestens 5 Minuten lang in ein Bad mit
frischem Waschpuffer 2 eintauchen, um mit Hämatoxylin „blau“ gegenzufärben.
Mit destilliertem oder entionisiertem Wasser gründlich abspülen.
Gewebeschnitte 30 Minuten lang bei 37 °C auf dem Dako Hybridizer mit geöffnetem Deckel
trocknen. Vor dem Eindecken Gewebeschnitte auf Raumtemperatur abkühlen lassen.
Schritt 11: Fixierung
Mit CISH Eindeckmedium (Fläschchen 13) eindecken und das Fixiermittel bei Raumtemperatur
(20-25 °C) mindestens 30 Minuten, vorzugsweise 60 Minuten, vor der Kontrolle härten lassen.
Hinweis: Die Proben dürfen vor dem Fixieren nicht mit Alkohol oder Xylol in Berührung
kommen. Dies könnte die Empfindlichkeit der Reaktion beeinträchtigen und sich nachteilig auf
das Färbeergebnis auswirken.
B.3.2 Protokoll für automatische immunchemische Färbung
(Dako Autostainer-Geräte)
Protokoll für automatische Färbung
Schritt 1: Über den Protokollselektor das Protokoll HER2CISH unter pharmDx wählen. Bei
erstmaliger Verwendung sollte das Protokoll vor dem Färbeverfahren installiert werden. Bei
anderen Dako Autostainer-Plattformen sollte das Protokoll entsprechend dem Programm in
Abb. 1 eingerichtet werden. Alternativ fordern Sie beim Technischen Kundendienst von Dako
Unterstützung bei der Protokollinstallation für automatisierte Plattformen an.
Schritt 2: Laden von Reagenzien.
Schritt 3: Laden von Objektträgern. Die Gewebeschnitte dürfen während der Beladung in das
Dako Autostainer-Gerät und während des Färbeverfahrens nicht austrocknen. Ausgetrocknete
Gewebeschnitte können erhöhte Hintergrundfärbung und schwache Signale aufweisen.
Schritt 4: Durchgang starten. Bei Autostainer Link-Plattformen für den Abschluss „Air blow“
wählen.
Falls das HER2CISH-Protokoll auf Ihrer Autostainer Link-Plattform nicht vorliegt, setzen Sie sich
bitte mit dem Technischen Kundendienst von Dako in Verbindung.
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Abb. 1. Exemplarisches Programm für Dako Autostainer-Geräte
Hinweis: Zwei Tropfzonen (1 und 3) mit je 200 µl wählen.
Schritt 5: Objektträger nach Beendigung des Programms aus dem Dako Autostainer-Gerät
nehmen. Gewebeschnitte 30 Minuten lang bei 37 °C au f dem Dako Hybridizer mit geöffnetem
Deckel trocknen. Vor dem Eindecken Objektträger auf Raumtemperatur abkühlen lassen.
Schritt 6: Fixierung
Mit CISH Eindeckmedium (Fläschchen 13) eindecken und das Fixiermittel bei Raumtemperatur
(20-25 °C) mindestens 30 Minuten, vorzugsweise 60 Minuten, vor der Kontrolle härten lassen.
Hinweis: Die Proben dürfen vor dem Fixieren nicht mit Alkohol oder Xylol in Berührung
kommen. Dies könnte die Empfindlichkeit der Reaktion beeinträchtigen und sich nachteilig auf
das Färbeergebnis auswirken.
Verwendung des Lichtmikroskops
Zur optimalen Auswertung der Proben muss ein Objektiv von ausreichender Qualität und
Vergrößerung verwendet werden. Die Lichtintensität so einstellen, dass die rote und blaue
Färbung leicht zu unterscheiden ist. Auf- und abwärts fokussieren, um alle Signale im
jeweiligen Zellkern ausfindig zu machen.
Qualitätskontrolle
1. Die Signale müssen klar, mit ausgewogener Intensität, eindeutig und leicht auszuwerten
sein.
2. Gesunde Zellen in der Probe ermöglichen die interne Kontrolle des Färbedurchgangs.
• Gesunde Zellen sollten 1-2 deutlich sichtbare blaue Signale geben und darauf
hinweisen, dass die CEN-17 PNA-Sonde erfolgreich mit der Zentromerregion von
Chromosom 17 hybridisiert hat.
• Gesunde Zellen sollten außerdem 1-2 deutlich sichtbare rote Signale erbringen und
darauf hinweisen, dass die HER2-DNA-Sonde erfolgreich an das HER2-Amplicon
angelagert hat.
• Durch den Gewebeschnitt weisen einige der gesunden Zellen weniger als die
erwarteten 2 Signale jeder Farbe auf.
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• Werden bei gesunden Zellen keine Signale nachgewiesen, verweist dies auf AssayVersagen, und die Ergebnisse müssen als ungültig angesehen werden.
• Das Ergebnis der numerischen Auswertung der gesunden Zellen sollte dem zu
erwartenden Wert entsprechen.
3. Die Morphologie der Zellkerne muss intakt sein. Zahlreiche schemenhafte Schattenzellen
und eine generell schlechte Zellkernmorphologie verweisen auf übermäßige Andauung der
Probe, die in Signalverlust oder -fragmentierung resultiert. Solche Proben müssen als
ungültig angesehen werden.
4. Unterschiede bei der Gewebefixierung, -verarbeitung und -einbettung im Labor des
Anwenders können Variationen der Resultate hervorrufen und eine regelmäßige
Evaluation der laborinternen Kontrollobjektträger erforderlich machen.
Auswertung der Färbeergebnisse
Bewertbares Gewebe
Eine Untersuchung ist nur bei Proben von Patientinnen mit invasivem Karzinom vorzunehmen.
Sind in einer Probe sowohl ein Carcinoma in situa als auch ein invasives Karzinom vorhanden,
so ist nur die invasive Komponente zu bewerten. Nekrotische Bereiche sind ebenso wie Bereiche
mit nicht eindeutigen Zellkernrändern auszuklammern. Es dürfen keine Zellkerne einbezogen
werden, bei denen eine subjektive Bewertung vorgenommen werden muss. Zellkerne mit
schwacher Signalintensität und unspezifischer oder hoher Hintergrundanfärbung sind zu
übergehen.
Bewertung des HER2 CISH
Objektträgerbewertung:
Durchsuchen des Objektträgers, um eine mögliche Heterogenität der Tumorbereiche zu
erfassen. Bewertung des Objektträgers gemäß den folgenden Richtlinien vornehmen:
Signalzählung: Mehrere Tumorzellbereiche untersuchen, um mögliche Heterogenität zu
berücksichtigen. Einen Bereich mit einer guten Zellkernverteilung auswählen. Mit der Analyse
im linken oberen Quadranten des ausgewählten Bereichs beginnen, dabei von links nach
rechts vorgehen, entsprechend den untenstehenden Richtlinien die Anzahl der Signale
innerhalb der Zellkerngrenzen jedes ausgewerteten Zellkerns zählen.
-
-
-
Auf- und abwärts fokussieren, um alle Signale im jeweiligen Zellkern ausfindig zu machen.
Wenn ein Signal mehr als einen Entstehungspunkt hat und somit eine Form aufweist, die
von einem kreisrunden Punkt deutlich abweicht, wird dieses als zwei Signale gezählt
(siehe Zählanleitung weiter unten).
In Zellkernen mit hoher HER2-Genamplifikation können die HER2-Signale sehr nah
beieinander liegen und einen Cluster von Signalen bilden. In diesen Fällen kann die Anzahl
der HER2-Signale nicht gezählt, sondern muss geschätzt werden. Die blauen Signale
müssen besonders beachtet werden, da Cluster von HER2-Signalen die blauen Signale
überdecken können, so dass sie kaum sichtbar sind.
Falls Zweifel bestehen, werden die betroffenen Zellkerne aus der Auswertung genommen.
Zellkerne ohne Signale oder mit nur eine Farbe aufweisenden Signalen dürfen nicht in die
Zählung einbezogen werden. Nur solche Zellkerne bewerten, die ein oder mehrere Signale
jeder Farbe zeigen.
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Leitfaden für die Signalzählung
1
Nicht in die Zählung aufnehmen. Zellkerne
überschneiden sich, es sind nicht alle Bereiche
des Zellkerns sichtbar.
2
Zwei blaue Signale; Zellkerne mit nur einer
Signalfarbe dürfen nicht ausgewertet werden.
3
Es werden 3 blaue und 12 rote Signale gezählt
(Schätzung des Clusters).
4
Es werden 2 blaue Signale und 1 rotes Signal
gezählt. Signale, die mehr als einen
Entstehungspunkt zu haben scheinen, werden als
zwei Signale gezählt.
5
Nicht zählen (zu stark oder zu schwach
angedauter Zellkern). Fehlende Signale in der
Mitte des Zellkerns.
6
Es werden 2 blaue Signale und 5 rote Signale
gezählt. Signale, die mehr als einen
Entstehungspunkt zu haben scheinen, werden als
zwei Signale gezählt.
Es werden 1 blaues Signal und 5 rote
Signale gezählt.
7
8
Es werden 3 blaue Signale (1 blaues nicht im
Fokus) und 3 rote Signale gezählt.
9
Cluster von roten Signalen, die die blauen Signale
verbergen. Eine höhere Vergrößerung einstellen,
um das Vorhandensein oder Fehlen von blauen
Signalen zu bestätigen. Falls Zweifel bestehen,
nicht mitzählen.
Zahlen dokumentieren
Pro Gewebeprobe werden 20 Zellkerne ausgezählt, und zwar möglichst von deutlich
erkennbaren Tumorbereichen (17).
Das HER2/CEN-17-Verhältnis wie folgt berechnen: Dividieren der Gesamtzahl roter HER2Signale durch die Gesamtzahl blauer CEN-17-Signale.
Für Proben mit einem HER2/CEN-17-Verhältnis größer oder gleich 2 ist die Amplifikation des
HER2-Gens anzunehmen (18-19).
Ergebnisse am oder nahe des Cut-off-Werts (1,8-2,2) sind mit Vorsicht zu interpretieren.
Liegt das Verhältnis im grenzwertigen Bereich (1,8-2,2), sind 20 weitere Zellkerne
auszuzählen, und das Verhältnis wird auf der Basis von 40 Zellkernen erneut berechnet.
Im Zweifelsfall ist eine erneute Bewertung des Objektträgers vorzunehmen. Bei Grenzfällen
sollte eine Beratung zwischen dem Pathologen und dem behandelnden Arzt stattfinden.
Beschränkungen
1. Als zahlreiche Schritte umfassender diagnostischer Prozess erfordert das HER2 CISH
pharmDx™-Verfahren spezielle Schulung und Ausbildung in der Auswahl der angemessenen
Reagenzien, in der Selektion, Fixierung und Verarbeitung von Geweben, der Vorbereitung
des CISH-Objektträgers und in der Auswertung der Färbeergebnisse.
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2. Mit dem CISH-Verfahren erhaltene Resultate sind von der Handhabung und Verarbeitung des
Gewebes vor dem Färbeschritt abhängig. Unsachgemäßes Fixieren, falsches Waschen,
Trocknen, Erwärmen, Schneiden oder Kontamination mit anderen Geweben oder
Flüssigkeiten können die Sondenhybridisierung beeinflussen. Widersprüchliche Ergebnisse
können auf Unterschiede bei den Fixierungs- und Einbettungsmethoden oder auf
Unregelmäßigkeiten innerhalb des Gewebes zurückzuführen sein.
3. Die auf Objektträger aufgezogenen Gewebe müssen für optimale und reproduzierbare
Ergebnisse vollständig entparaffiniert werden. Diese Paraffinentfernung muss zu Beginn
des gesamten Färbeverfahrens abgeschlossen worden sein (siehe
GEBRAUCHSANLEITUNG, Abschnitt B.2).
4. Es sollte nur ein Wasserbad mit kalibrierter Temperatureinstellung eingesetzt werden. Zur
Denaturierung und Hybridisierung wird der Dako Hybridizer (Code-Nr. S2450 oder S2451)
empfohlen, jedoch müssen, falls Heizblöcke oder Hybridisierungsöfen verwendet werde, diese
eine kalibrierte Temperatureinstellung besitzen. Die Verwendung anderer Gerätetypen muss
vom Anwender validiert werden, da es hierbei während der Hybridisierung zum Verdunsten
der HER2/CEN-17 Sondenmischung kommen kann.
5. Übermäßige oder unvollständige Gegenfärbungen können die Auswertungsergebnisse
beeinträchtigen.
6. Das immunhistochemische Färbeverfahren sollte bei einer Umgebungstemperatur von
20-25 °C durchgeführt werden.
7. Die Reagenzien des Kits nicht durch Reagenzien mit anderen Chargennummern oder
Reagenzien anderer Hersteller ersetzen.
Leistungsmerkmale
Analytische Empfindlichkeit
Zur Bestätigung einer Gesamtabdeckung von 218 kb einschließlich des HER2 -Gens wurden
die HER2-DNA-Sonden im HER2/CEN-17 Sondenmischung der Endsequenzierung und
Kartierung unterzogen. Die CEN-17-PNA-Sonden in der HER2/CEN-17 Sondenmischung
wurden einzeln und in Kombination miteinander getestet, um ihre spezifische Hybridisierung
der Zentromerregion von Chromosom 17 zu bestätigen.
Um eine Kreuz-Anlagerung an andere Chromosomen als an Chromosom 17 auszuschließen,
wurden nach Maßgabe der von Dako genutzten Verfahren der Qualitätskontrolle Studien an
Metaphasen-Spreitungen durchgeführt. Insgesamt 250 Metaphasen-Spreitungen wurden auf
die spezifische Hybridisierung der HER2-DNA- und CEN-17 PNA-Sondenmischung bewertet.
In allen 250 Fällen erwies sich die Anlagerung als für Chromosom 17 spezifisch. In keinem der
250 Fälle wurde eine Kreuz-Anlagerung an Loci anderer Chromosomen beobachtet.
Weiterhin wurde die Empfindlichkeit an 18 normalen Proben von Brustepithelproben getestet,
um zu überprüfen, ob das HER2 CISH pharmDx™ Kit die Zielsubstanzen (HER2 und CEN-17)
entdeckte. Die HER2/CEN-17-Verhältniszahlen betrugen 0,97-1,09, d.h., sie lagen im
erwarteten Bereich für normale diploide Zellen.
Analytische Spezifität
Die analytische Spezifität wurde getestet, um die Eigenschaft des Tests zu bestimmen, allein
die Zielsubstanzen HER2/CEN-17 ohne Störung durch andere Substanzen zu identifzieren.
Es wurden gefärbte Objektträger auf das Vorliegen von Signalen hin in Abwesenheit der
HER2/CEN-17-Sondenmischung oder CISH Antikörpermischung ausgewertet. Es wurde keine
unspezifische Bindung des CISH Antikörpermischung oder der Chromogene beobachtet, die
zu Signalen geführt hätten, die entweder in FISH oder CISH sichtbar gewesen wären.
Studien zur Robustheit
Die Testung der Robustheit des HER2 CISH pharmDx™-Kit erfolgte durch Veränderung von
Zeit und Temperatur für die Inkubation bei CISH Antikörpermischung, roter Chromogenlösung,
blauer Chromogenlösung und Gegenfärbung. Alle anderen Parameter des Verfahrens wurden
als Teil der Studien auf Robustheit für das HER2 FISH pharmDx™ Kit getestet.
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Vorbehandlung für 7, 10 und 13 Minuten bei 95-99 °C.
Vorbehandlung für 10 Minuten bei 89, 92 und 95-99 °C.
Pepsin-Inkubationszeiten von 2, 5, 10, 15 und 18 Minuten bei Raumtemperatur.
Denaturierungstemperaturen von 72, 77, 82, 87 und 92 C.
Hybridisierungszeit von 17 Stunden bei 40 °C, 45 ° C und 50 °C.
Hybridisierungszeit von 10, 12 und 14 Stunden bei 45 °C.
Die stringente Waschung wurde 10 Minuten lang bei 60 °C, 65 °C und 70 °C getestet.
Stringenzwaschung wurde für 5, 10 and 15 Minuten bei 65 °C getestet. Stringenzwaschung
für 10 Minuten bei 70 °C und Stringenzwaschung für 15 Minuten bei 65 °C führten zu
einem Signalverlust, während man bei den übrigen Zeit-Temperatur-Kombinationen keine
signifikanten Unterschiede in den Ergebnissen beobachtete.
Folgende Verdünnungen des Stringenzwaschpuffer wurden getestet: 1:10, 1:15, 1:20, 1:30
und 1:40. Die Verdünnung 1:40 des Stringenzwaschpuffer führte zu einem Signalverlust,
während man bei den übrigen Verdünnungsstufen keine signifikanten Unterschiede in der
Signalintensität beobachtete.
Antikörperinkubationszeit: 25, 27, 30, 33 und 35 Minuten. Die Inkubation von 25 Minuten
mit der Antikörpermischung führte zu einem Intensitätsverlust bei den roten Signalen,
während man bei allen anderen Zeitpunkten keine signifikanten Unterschiede beobachtete.
Inkubationszeit für rote Chromogenlösung von 8, 9, 10, 11 und 12 Minuten
Inkubationszeit für blaue Chromogenlösung von 8, 9, 10, 11 und 12 Minuten
Inkubationszeit für Gegenfärbung von 4, 5 und 6 Minuten
Gegenfärbungskonzentration mit Verdünnung 1:4, 1:5 und 1:6
Hinweis: Bei den Studien auf Robustheit wurde beim Färbeverfahren jeweils nur ein
Parameter geändert, während alle anderen Parameter konstant blieben. Es wird empfohlen,
die im Färbeverfahren angegebene Zeit und Temperaturen einzuhalten.
Wiederholbarkeit
Die Wiederholbarkeit des HER2/CEN-17-Verhältnisses wurde untersucht beim HER2 CISH
pharmDx™ Kit mit Hilfe dreier konsekutiver Gewebeschnitte aus 9 unterschiedlicher
Brustkrebsproben. Es wurde ermittelt, dass der Variationskoeffizient bei 1-7% lag, wobei eine
höhere Verhältniszahl zu einem höheren VK führte.
Die Wiederholbarkeit bei konsekutiven Gewebeschnitten von Brustkrebsproben
unterschiedlicher Dicke (3-7 µm) wurde mit dem HER2 CISH pharmDx™ Kit getestet. In dieser
Studie betrug der Variationskoeffizient des HER2/CEN-17-Verhältnisses 3-6%, d. h., der
Koeffizient lag im selben Bereich wie bei Geweben gleicher Dicke.
Reproduzierbarkeit
Die Reproduzierbarkeit des HER2 CISH pharmDx™ Kit wurde unter dem Aspekt Tag-zu-Tag
sowie Zentrum-zu-Zentrum/Untersucher-zu-Untersucher geprüft. Die Gewebeschnitte von 9
unterschiedlichen Brustkrebsproben wurden an drei Tagen und an drei Zentren gefärbt und
analysiert.
In der Reproduzierbarkeitsstudie ergab die Analyse der Brustkrebsproben mittels HER2 CISH
pharmDx™ Kit zwischen den einzelnen Tagen und den einzelnen Laboren reproduzierbare
Ergebnisse. Nach Varianz-Komponenten-Modell differierten die an unterschiedlichen Zentren
und unterschiedlichen Tagen vorgenommenen Bestimmungen nur geringgradig mehr als
putative Bestimmungen, die am selben Tag und am selben Zentrum (Restfehler)
vorgenommen wurden (Table 1).
(120946-003)
SK109/EFG/JEN/2013.03 p. 82/96
Tabelle 1. Varianz-Komponenten-Schätzwerte (VK)
amplifiziert
IHC 2+
Nicht
amplifiziert
Zentrum-zu-Zentrum
15,8%
12,2%
9,0%
Tag-zu-Tag
13,6%
12,2%
8,4%
Restfehler
13,1%
12,2%
8,4%
Vergleichsstudie
Der klinische Nutzen des HER2 CISH pharmDx™ Kit wurde in einer klinischen Studie mit 365
Proben von invasiven Mammakarzinomgeweben geprüft, die mittels HER2 CISH pharmDx™
Kit und dem PathVysion HER-2 DNA Probe Kit (FISH) analysiert wurden. Die Proben wurden
konsekutiv entnommen, der Probenpool mit 60 Proben, die den Befund IHC 2+ gemäß
HercepTest™ aufwiesen, ergänzt und in einem US-amerikanischen Referenzlabor analysiert.
Die Testergebnisse von 350 Proben waren für die statistische Analyse auswertbar; die IHCWerte nach HercepTest™ sowie der entsprechende CISH HER2-Genstatus sind in der
folgenden Table 2 aufgeführt. Ein HER2/CEN-17-Quotient unterhalb 2,0 zeigt einen nicht
amplifizierten Fall, ein HER2/CEN-17-Quotient größer oder gleich 2,0 einen amplifizierten Fall
an.
Tabelle 2. Kontingenztabelle mit den IHC-Werten im HercepTest™ und dem CISH HER2-Genstatus
IHC-Wert im HercepTest
0
CISH HER2Genstatus
nicht amplifiziert
amplifiziert
Gesamt
1+
98
2+
Gesamt
3+
108
95
5
306
0
1
17
26
44
98
109
112
31
350
Die Gesamtübereinstimmung zwischen dem HER2-Status, den man mittels HER2 CISH
pharmDx™ Kit und PathVysion HER-2 DNA Probe Kit (FISH) erhielt, betrug 97,7%, wie in
Table 3 aufgeführt. Die positive und negative Übereinstimmung betrug 90,9% bzw. 98,7%. Der
McNemars-Test für den systematischen Fehler zwischen beiden Tests war nichtsignifikant
(p=1,00).
Tabelle 3. Kontingenztabelle mit CISH HER2-Genstatus vs. FISH HER2-Genstatus mittels PathVysion
PathVysion FISH
HER2-Genstatus
nicht amplifiziert
CISH HER2Genstatus
Gesamt
nicht amplifiziert
amplifiziert
Gesamt
amplifiziert
302
4
306
4
40
44
306
44
350
Gesamtübereinstimmung: (342/350 x 100) = 97,7%; (95%-KI: 95,7% – 98,9%)
Positive Übereinstimmung: (40/44 x 100) = 90,9%; (95%-KI: 79,8% – 96,9%)
Negative Übereinstimmung: (302/306 x 100) = 98,7%; (95%-KI: 96,9% – 99,6%)
Kappa: 0,90 (Standardfehler 0,04)
Nach einer explorativen Analyse der HER2/CEN-17-Quotienten, die man mit den beiden
Methoden ermittelte, wurden die Quotienten aufgetragen (Figure 1).
(120946-003)
SK109/EFG/JEN/2013.03 p. 83/96
Abb. 1. Darstellung der HER2/CEN-17-Quotienten für HER2 CISH pharmDx™ Kit von Dako und dem
PathVysion HER-2 DNA Probe Kit (FISH)
Die lineare Regression der logarithmisch transformierten HER2/CEN-17-Quotienten zeigte
einen Korrelationskoeffizienten von 0,90 und eine Steigung von 0,71.
Zeit für die Objektträgerbewertung
Die Durchschnittszeit für die Objektträgerbewertung für HER2 CISH pharmDx™ betrug 3:13
(min:s) und für das PathVysion HER2 DNA Probe Kit (FISH) 4:02 (min:s). In einem
zweiseitigen t-Test für gepaarte Stichproben betrug die mittlere Differenz in der Zeit für die
Objektträgerbewertung 0:49 (min:s) und hatte damit eine statistische Signifikanz gegenüber
Null (p<0,001).
Erfolgsrate bei CISH
Von insgesamt 364 CISH-Tests wurden 352 (96,7%) erfolgreich durchgeführt.
Prognostischer Wert des HER2 CISH pharmDx™ Kit
Um den prognostischen Wert des HER2 FISH pharmDx™ Kit mit dem HER2 CISH pharmDx™
Kit in Beziehung zu setzen, wurde die Konkordanz zwischen den Testergebnissen untersucht.
Der prognostische Wert des HER2 FISH pharmDx™ Kit wurde bereits früher in der DBCGStudie 89D (DBCG: Danish Breast Cancer Cooperative Group) nachgewiesen, in der der
HER2-Status mit Hilfe des HER2 FISH pharmDx™ Kit von Dako analysiert wurde. In der
Studie DBCG 89D waren die Testergebnisse von 649 Proben für die Multivarianzanalyse
verfügbar, 417 hatten einen HER2/CEN-17-Quotienten unter 2,0 (HER2-Genstatus normal
oder nicht amplifiziert) und 232 einen HER2/CEN-17-Quotienten größer oder gleich 2,0
(HER2-Genstatus amplifiziert).
Aus der Univarianzanalyse des prognostischen Werts der HER2-Amplifikation bei Patientinnen
mit Lymphknotenbefall (n=423) wurde ermittelt, dass die HER2 Genamplifikation, bestimmt
durch das HER2 FISH pharmDx™ Kit, einen signifikanten prognostischen Wert im Hinblick auf
das Gesamtüberleben hatte (Figure 2).
(120946-003)
SK109/EFG/JEN/2013.03 p. 84/96
Abb. 2. Kaplan-Meier-Kurve mit Gesamtüberleben (GÜ) in Abhängigkeit von der HER2-FISHAmplifikation bei Patientinnen mit Lymphknotenbefall (n=423)
Die weitere Multivarianzanalyse ergab, dass die HER2-FISH-Amplifikation einen unabhängigen
prognostischen Wert bei Patientinnen mit Lymphknotenbefall aufwies mit einer Hazard Ratio,
die der der HER2-Amplifikation für das Gesamtüberleben bei 1,40 entsprach (95%-KIGrenzwerte für HR: 1,07–1,85), p=0,015.
Die Konkordanz zwischen den Testergebnissen mit dem HER2 FISH pharmDx™ Kit und dem
HER2 CISH pharmDx™ Kit wurden in einer klinischen Studie mit 200 Proben von invasiven
Mammakarzinomgeweben untersucht. Die Testergebnisse von 189 Proben kamen für die
statistische Analyse des HER2-Status in Betracht; die Kontingenztabelle des HER2-Status, der
mit beiden Tests ermittelt wurde, findet sich in Tabelle 4. Die Konkordanzdaten zeigen eine
Gesamtübereinstimmung zwischen den Ergebnissen mit dem FISH und CISH pharmDx™ Kit
von Dako von 97,9% mit positiver bzw. negativer Übereinstimmung von 92,6% bzw. 98,8%.
Daher zeigen diese Daten, dass der prognostische Wert der Analyseergebnisse des HER2
FISH pharmDx™ Kit mit Hilfe des Tests mit dem HER2 CISH pharmDx™ Kit ermittelt werden
kann.
Tabelle 4. Kontingenztabelle mit dem HER2-Genstatus, ermittelt mit HER2 CISH pharmDx™ Kit und
HER2 FISH pharmDx™ Kit
HER2-Status mit Dako FISH
nicht amplifiziert
HER2-Status
mit Dako CISH
Gesamt
nicht amplifiziert
amplifiziert
amplifiziert
Gesamt
160
2
162
2
25
27
162
27
189
Gesamtübereinstimmung: (185/189 x 100) = 97,9%; (95%-KI: 95,0% – 99,3%)
Positive Übereinstimmung: (25/27 x 100) = 92,6%; (95%-KI: 78,3% – 98,4%)
Negative Übereinstimmung: (160/162 x 100) = 98,8%; (95%-KI: 96,1% – 99,7%)
Kappa: 0,91 (Standardfehler 0,04)
(120946-003)
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Fehlerbehebung
Problem
Mögliche Ursache
Empfohlene Maßnahme
1. Keine Signale oder
schwache Signale
1a. Kit wurde während
Transport oder
Aufbewahrung hohen
Temperaturen ausgesetzt
1a. Lagerungsbedingungen
überprüfen. Bei
Entgegennahme von
Fläschchen 2 (Pepsin)
muss Trockeneis
vorhanden gewesen sein.
Überprüfen, ob die KühlPacks bei Empfang des Kits
noch kalt waren.
Sicherstellen, dass das
gesamte Kit bei maximal
2-8 °C und lichtgeschützt
gelagert wird. Das
Fixiermittel (Fläschchen 13)
sollte bei Raumtemperatur
gelagert werden.
1b. Immer die empfohlene
Vorbehandlungstemperatur
und -zeit einhalten.
1c. In der
Hybridisierungskammer
muss ausreichend
Feuchtigkeit vorhanden sein.
1d. Andere
Mikroskopeinstellungen
ausprobieren. Im
Zweifelsfall Kontakt mit
dem Mikroskoplieferanten
aufnehmen.
1e. Die angesetzte rote
Chromogenlösung muss
innerhalb von 20 Minuten
verbraucht werden.
Blaue Chromogenlösung
muss 30 Minuten vor
dem Gebrauch angesetzt
und innerhalb von 8 Tagen
verbraucht werden (falls sie
lichtgeschützt bei 2-8 °C
aufbewahrt wurde).
1f. Vor Beginn des Durchgangs
Programmierungsraster,
Objektträger- und
Reagenzpositionierungsschema überprüfen.
1b. Falsche
Vorbehandlungsbedingungen
1c. Verdunsten der
Sondenmischung während
der Hybridisierung
1d. Mikroskopeinstellungen
nicht optimal
- Unzureichendes Licht
- Höhere Vergrößerung
(Objektiv 40x oder 60x)
1e. Rote bzw. blaue
Chromogenlösung wurde(n)
nicht innerhalb der
angegebenen Zeit
verwendet
1f. Automatisches
Färbeverfahren
- Reagenzien in falscher
Reihenfolge verwendet
- Unzureichendes
Reagenzienvolumen
- Unzureichende
Inkubationszeiten
- Falsche Tropfzone
1g. Austrocknen von
Objektträgern
(120946-003)
1g. Gewebeschnitte dürfen
während der Färbung
niemals austrocknen.
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2. Keine blaue Signale
2a. Falsche Bedingungen bei
der Stringenzwaschung
2b. Falsche Verdünnung von
Blue Chromogen
2b. Falsche Verdünnung von
Blue Chromogen
2c. Probleme beim Ansetzen
der blauen
Chromogenlösung
3. Keine roten Signale
3a. Falsche Vorbehandlungsbedingungen
3b. Verwendung der roten
Chromogenlösung nicht
korrekt
3c. Falsche Verdünnung von
Red Chromogen
4. Bereiche ohne Signal
4a. Zu geringes
Sondenvolumen
4b. Einschluss von Luftblasen
während des Auftragens
der Sondenmischung oder
beim Aufziehen
4c. Zu geringes
Reagenzvolumen
4d. Lufteinschlüsse während
der Fixierung
(120946-003)
2a. Für den Waschschritt mit
Stringent Wash muss die
korrekte Temperatur und
Zeit eingehalten werden,
und vor diesem
Waschschritt müssen die
Deckgläser entfernt werden.
2b. Blaue Chromogenlösung
durch Mischen von 75 µL
blauem Chromogen
(Fläschchen 12) in 1 mL
blauem Substratpuffer
(Fläschchen 10) ansetzen
2b. Blaue Chromogenlösung
durch Mischen von 75 µL
blauem Chromogen
(Fläschchen 12) in 1 mL
blauem Substratpuffer
(Fläschchen 10) ansetzen
2c. Blaues Chromogen
(Fläschchen 12) wurde vor
dem Ansetzen der blauen
Chromogenlösung
nicht gemischt.
3a. Immer die empfohlene
Vorbehandlungstemperatur
und -zeit einhalten.
3b. Die angesetzte rote
Chromogenlösung sollte
innerhalb von 20 Minuten
(einschl. Inkubationszeit)
gebraucht werden.
3c. Rote Chromogenlösung
durch Mischen von
10 µL rotem Chromogen
(Fläschchen 11) in 1 mL
rotem Substratpuffer
(Fläschchen 9) ansetzen.
4a. Das Sondenvolumen muss
zum Abdecken des
Bereichs unter dem
Deckglas ausreichen.
4b. Einschluss von Luftblasen
vermeiden. Falls
vorhanden, vorsichtig mit
Pinzette wegklopfen.
4c. Reagenzvolumen muss
ausreichend groß sein, um
den Gewebebereich
abzudecken.
4d. Einschluss von Luftblasen
vermeiden. Das im Kit
mitgelieferte Fixiermittel
verwenden.
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5. Übermäßige
Hintergrundfärbung
4e. Drop Zone (Auftropfzone)
4e. Dafür sorgen, dass sich
die Auftropfzone nach der
Stelle des Gewebeschnitts
orientiert. Zwei
Auftropfzonen
(1 und 3) benutzen.
5a. Falsche Gewebefixierung
5a Es dürfen nur
formalinfixierte
paraffineingebettete
Schnitte verarbeitet werden.
5b. Die Verfahren für
Entparaffinierung und
Rehydrierung in Abschnitt
B.2 durchführen.
5c. Die Temperatur der
Stringenzwasch-Lösung
muss 65 (±2) °C betragen.
5d. Für ausreichende
Feuchtigkeit in der
Hybridisierungskammer
sorgen.
Feuchtigkeitskontrollstreifen verwenden.
5e. Frisch angesetzten
Waschpuffer verwenden.
Der Autostainer muss vor
dem Durchlauf
vorschriftsmäßig vorgefüllt
sein. Prüfen, ob
ausreichend Puffer für den
gesamten Durchlauf
vorhanden ist.
5f. Feuchtkammer verwenden.
Nur drei bis vier
Objektträger auf einmal
abwischen, bevor das
Reagenz zugegeben wird.
5g. Sicherstellen, dass die
Schnitte während des
Ladens in das Gerät und vor
Starten des Durchgangs mit
Puffer befeuchtet bleiben.
5h. Überprüfen, ob den
Schnitten das korrekte
Reagenzvolumen
zugegeben wurde. Der
Autostainer darf nur mit
Abzugshaube und bei
geschlossenem Deckel
betrieben werden und nicht
extremer Hitze
ausgesetzt sein.
5b. Paraffin nicht vollständig
entfernt
5c. Zu niedrige Temperatur der
Stringenzwasch-Lösung
5d. Verdunsten der
Sondenmischung während
der Hybridisierung
5e. Objektträger wurden
unzureichend gespült
5f. Schnitte sind während des
manuellen Färbeverfahrens
ausgetrocknet
5g. Schnitte trockneten
während des Einsetzens in
den Autostainer aus
5h. Schnitte sind während des
automatisierten
Färbeverfahrens
ausgetrocknet.
6. Schlechte
Gewebemorphologie
(120946-003)
6a. Falsche PepsinBehandlung
6a. Die empfohlenen PepsinInkubationszeiten befolgen.
Siehe Abschnitt B.3,
Schritt 2.
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6b. Zu stark angedautes
Gewebe
6c. Falsche
Vorbehandlungsbedingung
en können zu unklarem
oder getrübtem Aussehen
führen.
6d. Zu lange PepsinBehandlung oder sehr
dünne Schnitte können zum
Auftreten von Schattenoder bikonkaven
„Doughnut“-Zellen führen.
Pepsin muss bei der
korrekten Temperatur
gehandhabt werden. Siehe
Abschnitt B.1
6b. Inkubationszeit mit Pepsin
beim Dako FISHFärbeverfahren verkürzen.
Bei Gewebe, das mit neutral
gepuffertem Formalin (24
Stunden) und
paraffineingebettet wurde,
ist eine Inkubationszeit von
2 Minuten mit Pepsin bei
37 °C ein guter
Ausgangspunkt.
Die Abhängigkeit der
Signalstärke bzw.
-qualität von der
Gewebemorphologie sollte
dem Anwender bewusst
sein, wenn ein
Pepsingradient im FISHVerfahren erstellt wird, da
sich sowohl eine zu geringe
als auch eine zu starke
Andauung der
Gewebeproben auf die
Signalstärke bzw. -qualität
auswirkt.
6c. Immer die empfohlene
Vorbehandlungstemperatur
und -zeit einhalten.
6d. Pepsin-Inkubationszeit
verkürzen. Siehe Abschnitt
B.3, Schritt 2.
Die Schnittstärke muss
4–6 µm betragen.
7. Die HämatoxylinGegenfärbung erschwert
das Erkennen der
spezifischen HER2- und
CEN-17-Signale.
7a. Hämatoxylin-Gegenfärbung
zu stark
7a. Es ist eine weitere
Hämatoxylin-Verdünnung
oder eine kürzere
Inkubationszeit erforderlich.
8. Übermäßig starke
spezifische Färbung.
8a. Reagenzien zu lange
inkubiert
8a. Anleitung für das
Färbeverfahren erneut
überprüfen.
8b. Nur den mit dem Kit
empfohlenen Waschpuffer
(Waschpuffer 2, im Kit
enthalten, oder Dako Wash
Buffer, Code-Nr. S3006)
verwenden.
8b. Falsche Waschlösung
verwendet
(120946-003)
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Anhang 1
HER2 CISH pharmDxTM Kit, Code-Nr. SK109
Protokoll-Checkliste
Logbuch-ID des Färbelaufs: _________________
Datum (Tag 1) des Färbelaufs: ______________
HER2 CISH pharmDx™ Kit, SK109 Charge: _____________
Proben-ID(s):_________________________________________________________
Geräte-ID(s):_________________________________________________________
Fixierung des Gewebes in neutralem gepuffertem Formalin
Ja
Nein
Datum des Ansetzens / Verfallsdatum des 1 x Waschpuffer 1
(Fläschchen 5, Verdünnung 1:20):
/
Datum des Ansetzens / Verfallsdatum des 1 x Waschpuffer 2
(Fläschchen 6, Verdünnung 1:10):
/
TAG 1
Schritt 1: Vorbehandlung
Datum des Ansetzens / Verfallsdatum der Vorbehandlungslösung
(Fläschchen 1, Verdünnung 1:20)
Gemessene Temperatur der Vorbehandlungslösung (95-99 °C), falls im
Wasserbad (Methode A) erhitzt wird
Falls im Mikrowellenherd (Methode B) erhitzt wird, mit einem Strich
markieren.
Vorbehandlung (10 Minuten) und Abkühlen (15 Minuten)
Waschen in Waschpuffer 1 (Fläschchen 5, Verdünnung 1:20) (2 x 3 Minuten)
Schritt 2: Pepsin
Dauer der Behandlung mit Pepsin (Fläschchen 2) bei 37 °C oder
Dauer der Behandlung mit Pepsin (Fläschchen 2) bei Raumtemperatur
Waschen in Waschpuffer 1 (Fläschchen 5, Verdünnung 1:20) (2 x 3 Minuten)
Dehydrieren der Objektträger (3 x 2 Minuten) in abgestufter Reihe von
Ethanol-Bädern und Lufttrocknung
Schritt 3: HER2/CEN-17 Sondenmischung
Auftrag der Sondenmischung (Fläschchen 3), Eindecken und Versiegeln mit
Deckglas-Abdichtmittel
Gemessene Denaturierungstemperatur (82 °C), falls a nderes Gerät als Dako
Hybridizer verwendet wird
Denaturierung über einen Zeitraum von 5 Minuten
Gemessene Hybridisierungstemperatur (45 °C), falls anderes Gerät als Dako
Hybridizer verwendet wird
Hybridisierung über Nacht (lichtgeschützt)
TAG 2
Schritt 4: Waschen mit Stringent Wash
Datum des Ansetzens / Verfallsdatum des Stringent Wash Buffer
(Fläschchen 4, Verdünnung 1:20)
Gemessene Temperatur des Stringent Wash Buffer (65 °C)
(120946-003)
/
°C
Minuten
Minuten
°C
°C
Stunden
/
°C
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Waschen mit Stringent Wash Buffer (10 Minuten) nach Entfernen
des Deckglases
Waschen in Wash Buffer 1 (Fläschchen 5, Verdünnung 1:20) (2 x 3 Minuten)
Schritt 5: Peroxidase-Block
Waschen in Wash Buffer 2 (Fläschchen 6, Verdünnung 1:10) (2 x 3 Minuten)
Peroxidase-Block (Fläschchen 7) 5 Minuten
Waschen in Wash Buffer 2 (Fläschchen 6, Verdünnung 1:10) (2 x 3 Minuten)
Schritt 6: CISH Antikörpermischung
CISH Antikörpermischung, (Fläschchen 8) 30 Minuten
Waschen in Wash Buffer 2 (Fläschchen 6, Verdünnung 1:10) (2 x 3 Minuten)
Schritt 7: Rote Chromogenlösung
Rote Chromogenlösung aus rotem Substratpuffer (Fläschchen 9) und rotem
Chromogen (Fläschchen 11) mischen. Innerhalb 20 Minuten zu verbrauchen.
Rote Chromogenlösung für 10 Minuten.
Waschen in Wash Buffer 2 (Fläschchen 6, Verdünnung 1:10) (2 x 3 Minuten)
Schritt 8: Blaue Chromogenlösung
Blaue Chromogenlösung aus blauem Substratpuffer (Fläschchen 10) und
blauem Chromogen (Fläschchen 12) mischen. Sollte 30 Minuten vor dem
Gebrauch angesetzt und in 8 Tagen verbraucht werden (falls bei 2-8 °C licht
geschützt aufbewahrt).
Blaue Chromogenlösung für 10 Minuten.
Waschen in Wash Buffer 2 (Fläschchen 6, Verdünnung 1:10) (2 x 3 Minuten)
Schritt 9: Gegenfärbung
Hämatoxylin-Gegenfärbung für 5 min (nicht mit im Kit enthalten.
1:5 Verdünnung aus Dako Hematoxylin, Code-Nr. S3301 in
entionisiertem Wasser)
Waschen in Wash Buffer 2 (Fläschchen 6, Verdünnung 1:10) (2 x 3 Minuten)
Waschen in Wash Buffer 2 (Fläschchen 6, Verdünnung 1:10) (2 x 5 Minuten)
Gründlich mit entionisiertem Wasser spülen
Schritt 10: Fixierung
30 Minuten bei 37 °C trocknen, auf Raumtemperatur a bkühlen, dann
Fixiermittel (Fläschchen 13) aufbringen und eindecken
mindestens 30-60 Minuten vor der Kontrolle abwarten
Kommentare:_________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________________
__________________________________________________________________
Datum und Unterschrift Laborant/in:
(120946-003)
SK109/EFG/JEN/2013.03 p. 91/96
Anhang 2
HER2 CISH pharmDx™ Kit, Code-Nr. SK109
Bewertungsschema
Logbuch-ID des Färbelaufs: ___________
Datum (Tag 1) des Färbelaufs: ______________
HER2 CISH pharmDx™ Kit, SK109 Charge: ________
Proben-ID(s):__________
Signale von 20 Zellkernen auszählen
Zellkern
Nr.
HER2
Wert
(rot)
CEN-17
Wert
(blau)
Zellkern
Nr.
1
11
2
12
3
13
4
14
5
15
6
16
7
17
8
18
9
19
10
20
Gesamt (1-10)
Gesamt (11-20)
HER2
Wert
(rot)
CEN-17
Wert
(blau)
Zur Bestimmung des HER2/CEN-17-Verhältnisses wird bei diesen 20 Zellkernen die Anzahl
der HER2-Signale und die Anzahl der CEN-17-Signale gezählt, danach die Gesamtzahl der
HER2-Signale durch die Gesamtzahl der CEN-17-Signale dividiert. Liegt das HER2/CEN-17Verhältnis im grenzwertigen Bereich (1,8-2,2), werden 20 weitere Zellkerne ausgezählt und
das Verhältnis erneut berechnet.
Ergebnisse am oder nahe des Cut-off-Werts (1,8-2,2) sind mit Vorsicht zu interpretieren (siehe
Leitfaden für die Signalzählung).
HER2
CEN-17
HER2/CEN-17-Verhältnis
Gesamtwert (1-20)
Verhältnis < 2: HER2-Genamplifikation wurde nicht beobachtet
Verhältnis ≥ 2: HER2-Genamplifikation wurde beobachtet
Datum und Unterschrift Laborant/in:
Datum und Unterschrift Pathologe/Pathologin:
Leitlinien für die Punktvergabe: siehe Auswertung der Färbeergebnisse
(120946-003)
SK109/EFG/JEN/2013.03 p. 92/96
References/ Bibliographie/ Literatur
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
Muleris M, Almeida A, Malfoy B, Dutrillaux B. Assignment of v-erb-b2 avian erythroblastic
leukemia viral oncogene homolog 2 (ERBB2) to human chromosome band 17q21.1 by in
situ hybridization. Cytogenet Cell Genet. 1997;76:34-5.
Coussens L, Yang-Feng TL, Liao YC, Chen E, Gray A, McGrath J, et al. Tyrosine kinase
receptor with extensive homology to EGF receptor shares chromosomal location with neu
oncogene. Science. 1985;230:1132-9.
King CR, Kraus MH, Aaronson SA. Amplification of a novel v-erbB-related gene in a
human mammary carcinoma. Science. 1985;229:974-6.
Schwab M. Oncogene amplification in solid tumors. Semin Cancer Biol. 1999;9:319-25.
Kallioniemi OP, Kallioniemi A, Kurisu W, Thor A, Chen LC, Smith HS, et al. ERBB2
amplification in breast cancer analyzed by fluorescence in situ hybridization. Proc Natl
Acad Sci U S A. 1992;89:5321-5.
Persons DL, Bui MM, Lowery MC, Mark HF, Yung JF, Birkmeier JM, et al. Fluorescence in
situ hybridization (FISH) for detection of HER-2/neu amplification in breast cancer: a
multicenter portability study. Ann Clin Lab Sci. 2000;30:41-8.
Slamon DJ, Clark GM, Wong SG, Levin WJ, Ullrich A, McGuire WL. Human breast
cancer: correlation of relapse and survival with amplification of the HER-2/neu oncogene.
Science. 1987;235:177-82.
Rennstam K, Baldetorp B, Kytola S, Tanner M, Isola J. Chromosomal rearrangements and
oncogene amplification precede aneuploidization in the genetic evolution of breast cancer.
Cancer Res. 2001;61:1214-9.
Borg A, Tandon AK, Sigurdsson H, Clark GM, Ferno M, Fuqua SA, et al. HER-2/neu
amplification predicts poor survival in node-positive breast cancer. Cancer Res.
1990;50:4332-7.
Nichols DW, Wolff DJ, Self S, Metcalf JS, Jacobs D, Kneuper-Hall R, et al. A testing
algorithm for determination of HER2 status in patients with breast cancer. Ann Clin Lab
Sci. 2002;32:3-11.
Bilous M, Dowsett M, Hanna W, Isola J, Lebeau A, Moreno A, et al. Current perspectives
on HER2 testing: a review of national testing guidelines. Mod Pathol. 2003;16:173-82.
Nielsen PE, Egholm M, editors. Peptide Nucleic Acids: Protocols and Applications. Norfolk
NR18 0EH, England: Horizon Scientific Press. 1999.
Clinical and Laboratory Standards Institute (formerly NCCLS). Protection of laboratory
workers from instrument biohazards and infectious disease transmitted by blood, body
fluids, and tissue; Approved guideline. NCCLS document M29-A. 940 West Valley Road,
Suite 1400, Wayne, Pennsylvania 19087-1898 USA: NCCLS. 1997.
Clinical Laboratory Improvement Amendments of 1988: Final Rule, FR 7163, February 28.
1992.
Sheehan DC, Hrapchak BB. Theory and practice of histotechnology. St. Louis: CV Mosby
Company. 1980.
Kiernan JA. Histological and histochemical methods: theory and practice. New York:
Pergamon Press. 1981.
Tsuda H, Akiyama F, Terasaki H, Hasegawa T, Kurosumi M, Shimadzu M, et al. Detection
of HER-2/neu (c-erb B-2) DNA amplification in primary breast carcinoma. Interobserver
reproducibility and correlation with immunohistochemical HER-2 overexpression. Cancer.
2001;92:2965-74.
Ellis IO, Bartlett J, Dowsett M, Humphreys S, Jasani B, Miller K, et al. Best Practice No
176: Updated recommendations for HER2 testing in the UK. J Clin Pathol. 2004;57:233-7.
Wolff AC, Hammond ME, Schwartz JN, Hagerty KL, Allred DC, Cote RJ, et al. American
Society of Clinical Oncology/College of American Pathologists guideline recommendations
for human epidermal growth factor receptor 2 testing in breast cancer. J Clin Oncol.
2007;25:118-45.
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