低分子量 G-蛋白質 Ras の光応答性ナノデバイスを用いた光制御

低分子量 G-蛋白質 Ras の光応答性ナノデバイスを用いた光制御
Photo-regulation of Small G-protein Ras using photoreactive nano-device
12D5602
岩田聖悟
指導教授名
SYNOPSIS
丸田晋策
The lipid-anchored small G-protein Ras is an essential central regulator of cellular signal transduction
processes as a molecular switch. Ras localized on the plasma membrane is assembled into cluster and then forms
dimer. Many proteins are bio-molecular machines and are enabled a physiological function by the regulation
of multimerization. Interestingly, the core nucleotide-binding motif of Ras is considerably conserved with
the ATP driven motor proteins, myosin and kinesin. It is believed that these bio-molecular machines share
common molecular mechanism utilizing nucleotide hydrolysis cycle. Previously, it has been demonstrated that
the ATPase activity of kinesin modified with photochromic molecules, 4-phenylazophenyl maleimide (PAM) was
regulated reversibly upon visible light (VIS) and ultra-violet (UV) light irradiation. Therefore, it is
strongly expected that the function of Ras might be also regulated by the photoreactive nano-devices. In this
study, first, we synthesized a novel fluorescent ribose-modified GTP analogue, 2'(3')-O-{6-(N-(7-nitrobenz2-oxa-l,3-diazol-4-yl)amino)hexanoic}-GTP (NBD-GTP) in order to monitore the photoregulation of Ras using
PAM. Second, we demonstrated the ability to photocontrol the GTPase activity of Ras and its interaction with
regulatory factors by using a photochromic azobenzene derivative. This strategy may also be applicable to
the photocontrol of the interaction of Ras with its effectors. Third, we demonstrated the possible application
of a caged compound, 2-Nitrobenzyl bromide (NBB), in photoregulating the multimerization of Ras. In this study,
it is demonstrated that the function of small G-protein Ras is successfully photoregulated using photoreactive
nano-devices.
Keywords: Ras; GEF; NBD-GTP; photochromic molecule; caged compound; Multimerization
1. 緒言
低分子量 G タンパク質 Ras は、機能的にも構造的にも酵
母から哺乳類まで極めて高度に保存されている分子量が
21 kDa の膜タンパク質であり、機械的生体分子スイッチ
として細胞の増殖,分化,アポトーシスなどを制御する
Ras-MAP キナーゼ経路、PI3 キナーゼ経路、PLCγ 経路な
どの広範な情報伝達系経路の分岐点に位置し、時間・空間
的に情報伝達の経路選択を担う膜タンパク質である(1-3)。
その機械的制御機構には、GTP の加水分解で生じたヌクレ
オチド結合ドメインの構造変化を GTPase サイクル調節タ
ンパク(GAPs: GTPase 活性タンパク, GEFs: グアニンヌク
レオチド交換因子)やエフェクターと相互作用するエフェ
クタードメインの構造変化に伝達するという GTPase とし
ての機構(4)と膜上で形成したクラスター中で二量体化し、
ヌクレオチド結合ドメインの構造変化を二量体の構造変
化に伝達するという膜タンパクとしての機構があること
がわかってきた(5-6)。Ras に点変異が生じることで機械
的制御機構が狂うと、通常不活性状態である GDP 結合型で
も活性状態になり、恒常的に情報伝達が活性化されるよう
になる。これまでにコステロ症候群やヌーナン症候群など
の遺伝病や 30%以上の癌から点変異が見つかっており、阻
害剤などの開発が積極的に行われてきている(7,8)。
Ras のようにヒトの生体内には、多量体を形成し、機械
的制御機構を持つ生体分子機械と呼ばれるタンパク質が
多数存在する(9-11)。分子生物学的研究や結晶構造解析な
どによりこれらの機械的制御機構が外部刺激に応答して
働くことが明らかになってきたことから、人工的な外部刺
激によってその機械的制御機構を人工的に制御できるこ
とが示唆されている。人工的な外部刺激によって低分子量
G タンパク質 Ras の情報伝達を制御することができれば、
細胞機能の人工的制御や人工細胞への応用、癌やヌーナン
症候群などの遺伝病のメカニズムの解明などが可能にな
ると考えられる。人工的な外部刺激の１つである光刺激に
よって制御する方法には、フォトクロミック分子を用いる
方法、ケージド化合物を用いる方法、オプトジェネティッ
クスを用いる方法がある(12)。
GTP 駆動型生体分子スイッチである G タンパク質は、ヌ
クレオチド結合ドメイン(P-loop, Switch I, Switch II)
を持つことから Nucleotide Binder から機能部位や活性部
位を保存したまま進化をしたことが提唱されており、一方
で ATP 駆動型生体分子モーター(キネシンやミオシンな
ど)も共通の祖先である Nucleotide Binder から機能部位
や活性部位を保存したままそれぞれ独自の進化をしたと
考えられている(13)。これまでの当研究室の研究で光刺激
によって ATP 駆動型生体分子モーターであるキネシン
(kif5a, Eg5)の機能をアゾベンゼン誘導体やスピロピラ
ン誘導体のフォトクロミック分子を導入することで人工
的に光制御することに成功している(14-16)。従って、ATP
駆動型生体分子モーターと同じ機械的制御機構を持つこ
とから、低分子量 G タンパク質 Ras の機能も同様に外部刺
激によって制御できると考えられる。また二量体形成を外
部刺激によって人工的に制御することで活性を制御する
ことに成功している報告がなされている(17)ことから低
分子量 G タンパク質 Ras の多量体形成も同様に外部刺激に
よって制御できると考えられる。
本研究では、まずフォトクロミック分子修飾を行った
Ras の光制御を速度論的に測定するために、フォトクロミ
ック分子の光異性化に影響を与えない励起波長をもつ蛍
光標識 GTP 誘導体 NBD-GTP を新規に合成とその有用性の確
認を試みた。次に、ヌクレオチド結合ドメインにシステイ
ン残基を一つ持つ Ras 変異体を調製し、フォトクロミック
分子でありチオール反応性官能基を持つアゾベンゼン誘
導体 4-phenylazophenyl maleimide (PAM)を化学修飾し、
光照射によって GTPase 活性の可逆的光制御と Ras と GEF
の相互作用の可逆的光制御を試みた。さらに、ケージド化
合物であるチオール反応性官能基を持つニトロベンジル
誘導体 2-Nitrobenzyl bromide (NBB)を Hypervariable
region (HVR)にある Cys に化学修飾することで Ras に多量
体を形成させ、光照射によって多量体形成の光制御を試み
た。
2. 新規蛍光標識 GTP 誘導体 NBD-GTP の合成と特徴付け
新規蛍光標識 GTP アナログ誘導体 NBD-GTP (図 1)の合成
に用いた NBD 基は疎水性の強く、周囲の環境の変化に影響
を受け大きく蛍光強度を変化させる分子である。Guillory
等の方法(18)に基づいて NBD-X と GTP を CDI によりアミド
縮合させ、
未反応の NBD-X と GTP を逆相カラム(ODP50-10E)
を用いて HPLC(High performance liquid chromatography)
で精製し、TLC(Thin-layer chromatography)で精製確認を
行った。TLC では不純物は確認できず、収率は 5%前後であ
った。吸収スペクトラムには、GTP の吸収波長(260 nm)と
NBD 基の吸収波長(485 nm)に吸収のピークが確認でき、蛍
光光度計で測定したところ励起波長は 480 nm で、蛍光波
長は 535 nm であった(図 2)。NBD-GTP の Ras への親和性と
生理活性が GTP とほぼ同じであり、正常体と癌性変異体
(G12S、A59T、G1S/A59T) (図 3)の GTPase 活性測定結果及
び NBD-GTP を用いたヌクレオチド交換速度の測定結果を
これまでに放射性同位体や Mant-GTP を用いて報告された
癌性変異体の特徴(19-22)と比較検討することで NBD-GTP
が低分子量 G タンパク質 Ras の生化学的特徴付けに有用で
あることを明らかにした(表 1)。さらに GEF の一種である
SOS1 との相互作用の測定結果から NBD-GTP が Ras と
GTPase サイクル調節因子との相互作用の測定にも有用で
あることを明らかにした(表 2)。また Mant 基よりも NBD
基がヌクレオチド結合ドメインの構造変化を感度よく捉
えることを明らかにした。
以上のことより新規蛍光標識 GTP 誘導体 NBD-GTP は低分
子量 G タンパク質 Ras の生化学的特徴付けに有用なことが
明らかになった。また、Ras だけでなく他の G タンパク質
でも生化学的特徴付けに有用であることが期待される。
図 1 NBD-GTP の構造
図 2 trans-,cis-PAM の吸収スペクトラムと Mant-GTP と
NBD-GTP の励起スペクトラムと蛍光スペクトラム
3. フォトクロミック分子 PAM 修飾による Ras の光制御
まずチオール基反応性官能基であるマレイミド基を持
つフォトクロミック分子アゾベンゼン誘導体 PAM(図 4)を
修飾するためにヌクレオチド結合ドメインにシングルシ
ステインを持つ変異体(G12C, Y32C, I36C, Y64C) (図 5)
を正常体と癌性変異体(G12S/A59T)を基にして作製した。
図 3 Ras の癌性変異部位
表 1 The GTPase 活性
表 2 GEF 存在下,非存在下のヌクレオチド交換速度
紫外線(366 nm)と可視光照射によって光異性化させるこ
とによって、Ras に化学修飾した PAM を GTPase 活性が可
逆的に光制御され、修飾部位によって異なる方向性の光制
御ができたことから選択的に GTPase サイクルを活性化す
ることが可能であることが示された(図 6)。GTPase 活性は、
Youngburg 法(23)で定量した。さらに NBD-GTP を用いて
PAM-Ras のヌクレオチド交換速度が光制御されることで
GTPase 活性が可逆的に光制御されていることを明らかに
した(図 7)。次に Ras に修飾した PAM の光異性化させるこ
とによって Ras と GEF (SOS1)との相互作用を可逆的に光
制御できることを明らかにした(図 8)。
以上のことより光応答性ナノデバイスであるフォトク
ロミック分子を用いることで Ras の GTPase 活性、GTPase
サイクル調節タンパク(GAPs, GEFs)との相互作用を光制
御し GTPase サイクルを光制御できることが示唆された。
GTPase サイクル調節タンパクと同様にエフェクター
(c-Raf, RalGDS など)との相互作用を光制御することで
Ras の情報伝達を光制御が可能であることも期待される。
また Ras ではなく GTPase サイクル調節タンパク(GAPs,
GEFs)やエフェクター(c-Raf, RalGDS など)にフォトクロ
ミック分子を修飾することによって GTPase サイクルを光
制御できることも示唆された。
図 4 PAM の光異性化概略図
図 5 PAM を修飾した Ras のアミノ酸部位
図 8 GEF 存在下 PAM-(A) I36C,
(B) Y64C のヌクレオチド交換速度光制御
図 6 (A)正常体 PAM-Ras の GTPase 活性光制御
(B)癌性変異体 PAM-Ras の GTPase 活性光制御
成に必須な NBB 修飾 Cys 部位の特定のための変異体を作製
し、多量体形成のメカニズムを推察した。NBB の化学修飾
された個数依存的に多量体形成率が上昇し、NBB が化学修
飾された NBB-Ras のみに EDC 架橋によって分子内架橋が観
察されたことから、まず NBB が化学修飾されることで疎水
性が上昇した HVR が Conserved domain に張り付き、さら
に SAXS の P(r)関数の結果とイオン強度依存的に多量体形
成率が変化したことから球状になった NBB-Ras は静電相
互作用によって球状の 5 量体を形成すると考えられた(表
3, 図 11)。
以上のことより光応答性ナノデバイスであるケージド
化合物を用いることで Ras の多量体形成を光制御できる
ことが明らかになった。予備的な実験でフォトクロミック
分子アゾベンゼン誘導体 PAM を Ras に化学修飾すると NBB
同様に多量体を形成したが光照射によって多量体形成を
光制御することはできなかった。また二価架橋性アゾベン
ゼン誘導体試薬である 4,4'-azobenzene-dimaleimide
(ABDM)を Ras に化学修飾すると二量体を形成したが光照
射によって多量体形成を光制御することはできなかった。
この予備的実験からも光応答性ナノデバイスを用いるこ
とで Ras の二量体化を光制御し、Ras の情報伝達の光制御
が可能になることが期待される。
図 7 PAM-Ras のヌクレオチド交換速度光制御
4. ケージド化合物 NBB 修飾による Ras の光制御
まずチオール反応性官能基を持つケージド化合物であ
るニトロベンジル誘導体である NBB(図 9)を Ras の HVR に
修飾することで、多量体形成が起きることを高速サイズ排
除クロマトグラフィー(SEC-HPLC)で確認した。さらにこの
多量体 NBB-Ras に対して紫外線照射(366 nm)または紫光照
射(400 nm)することによって NBB を解離させ、多量体
NBB-Ras が単量体 Ras に分離することを確認した(図 10)。
次に多量体形成のメカニズムを解明するために多量体形
図 9 ケージド化合物 NBB の光分解スキーム
4.
5.
6.
7.
8.
図 10 多量体形成の光制御(SEC-HPLC)
表 3 SAXS の解析値
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
図 11 NBB-Ras 多量体形成と光制御モデル
16.
4. 結語
本研究で開発した新規蛍光標識 GTP 誘導体 NBD-GTP を用
いることで、光応答性スイッチであるフォトクロミック分
子を導入した Ras の光制御を測定することが可能となり、
GTPase サイクルを可逆的に光制御することが可能である
ことを明らかにした。また光応答性化合物であるケージド
化合物を導入することで、Ras の多量体形成を光制御する
ことが可能であることを明らかにした。これらの結果は、
調節タンパク質との相互作用や情報伝達の標的タンパク
質との相互作用を光制御し、Ras の関与する情報伝達を光
制御できる可能性を示唆している。また、機能的にも構造
的にも極めて高度に保存されている他の Ras スーパーフ
ァミリーである Rho, Rab, Ran, Sar/Arf に応用すること
で Ras の関与する情報伝達だけでなく低分子量 G タンパク
質の関与する情報伝達も同様に光制御できる可能性を示
唆している。
17.
18.
19.
20.
21.
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