Molekulare Mikrobiologie - Martin-Luther-Universität Halle

Mol.Microb.
Molekulare Mikrobiologie Martin-Luther-Universität
Halle-Wittenberg
Biologie-Mikrobiologie-Molekulare Mikrobiologie
Mol.Microb.
Übersicht
Stunde 1: Allgemeines, Genome, DNA
Stunde 2: Replikation
Stunde 3: Transkription.
Stunde 4: Transkription -> Translation.
Stunde 5: Translation.
Stunde 6: Translation
Stunde 7: Mutation.
Stunde 8: Reparatur.
Stunde 9: Rekombination.
Stunde 10: Phagen und Transduktion.
Stunde 11: Transformation.
Stunde 12: Plasmide und Konjugation.
Stunde 13: Regulation
Wiederholung Stunde 8
Mol.Microb.
MUTATION
• Definitionen
• Arten der Mutation (Punkt, Transition, Transversion, Insertion, Deletion).
• Folgen (still, missense, leaky, nonsense, frame shift, polare Effekte).
• Gründe, zufällige Mutationen zu erzeugen (prä- und post-Sequenzphase).
• Rückmutation, Reversion, Suppression (intra-, intergenisch).
• Substanzen zur Auslösung von Mutationen und ihre Funktion.
• Gewinn- und Verlustmutanten durch Positiv- oder Negativ-Selektion.
• Selektions-Proceduren für Gewinn- und Verlust-Mutanten (pin point, Penicillin/
Cycloserin/Tritium, Farbscreening, Picken und Stempeln),
• Ames-Test.
Copyright Brock
Open reading frames und frame-shifts:
1. ORFs: In beiden Richtungen sagt ein Computer-Programm für alles drei Leseraster STOPP voraus
(ganze Balken) und Start-Codone (ATGs = halbe Balken).
-> Ein „ORF“ ist in einem Leseraster ein Bereich > 50 bp, in dem kein STOPP ist.
2. Der ORF wird im Computer translatiert und das putative Protein ge-BLASTET. Keine ähnlichen
Proteine in der Bank: hm. Ähnliche Proteine: Putatives Protein könnte existieren.
3. Ein Gen sollte auch eine vernünftige RBS haben
4. Translations-Kopplungen: STOPP-Codon und downstream RBS überlappen, z. B. „ATGA“.
-> POLARE Effekte.
5. Kleine Deletionen oder Insertionen out-of-frame: frame-shift-Mutationen!
- Definitionen,
- Prä-Genomisch:
- Mutationsarten
- Transposon-tagging
- Mutationsfolgen
- Screening-Stamm
- Gründe, Mutanten herzustellen
- Post-Genomisch:
- Mutationsauslösung
- Random/reverse genetics
- Mutantenselektion
- interaction
- Anwendungen
- Reparatur
- Definitionen,
- Spontan
- Mutationsarten
- Chemische Mutagene
- Mutationsfolgen
- 5-Bromuracil
- Gründe, Mutanten herzustellen
- EMS
- Mutationsauslösung
- Mutantenselektion
- Anwendungen
- Reparatur
Basenanaloga:
5-Bromuracil
2-Aminopurin
Chemische Reagenzien:
Salpetrige Säure (HNO2)
Hydroxylamin
Alkylierende Agenzien:
Ethyl-Methane-Sulfonate (EMS)
Nitrosogunanidine, Mitomycin
Interkalierende Farbstoffe:
Akridine, Ethidium-Bromid
Strahlung:
UV
Ionisierende Strahlung wie X-rays
Copyright Brock
Guanin
Thymin
(enol)
Adenin
Thymin
Hypoxanthin
(imino)
Thymin
Hypoxanthin
(keto)
Adenin
(imino)
Thymin
Cytosin
Hypoxanthin
(keto)
Hypoxanthin
(keto)
Guanin
Cytosin
Cytosin
Cytosin
- Definitionen,
- Spontan
- Mutationsarten
- Chemische Mutagene
- Mutationsfolgen
- 5-Bromuracil
- Gründe, Mutanten herzustellen
- EMS
- Mutationsauslösung
- Mutantenselektion
- Anwendungen
- Reparatur
- Physikalische Mutagene
Copyright Brock
- Definitionen,
- Spontan
- Mutationsarten
- Chemische Mutagene
- Mutationsfolgen
- 5-Bromuracil
- Gründe, Mutanten herzustellen
- EMS
- Mutationsauslösung
- Physikalische Mutagene
- Mutantenselektion
- Wahre Rückmutation
- Anwendungen
- Suppression/second site reversion
- Intragenische Suppression
- Reparatur
- Extragenische Suppression
- Definitionen,
- Mutationsarten
- Mutationsfolgen
- Gründe, Mutanten herzustellen
- Mutationsauslösung
- Mutantenselektion
- Anwendungen
- Reparatur
- Gewinn-Mutation:
- Positive selection
Farbstoff-Screening
Einfach Phänotypänderung
Positiv-Selektion
Gewinn-Mutationen
Copyright Brock
- Definitionen,
- Mutationsarten
- Mutationsfolgen
- Gewinn-Mutation:
- Positive selection
- Verlust-Mutation:
- Gründe, Mutanten herzustellen
- Negative selection
- Mutationsauslösung
- Segregation
- Mutantenselektion
- Pin Point Selektion
- Anwendungen
- Penicillinanreicherung
- Färbungen
- Reparatur
- Replica plating
Copyright Brock
Copyright Brock
- Definitionen,
- Mutationsarten
- Mutationsfolgen
- Gewinn-Mutation:
- Positive selection
- Verlust-Mutation:
- Gründe, Mutanten herzustellen
- Negative selection
- Mutationsauslösung
- Segregation
- Mutantenselektion
- Pin Point Selektion
- Anwendungen
- Penicillinanreicherung
- Färbungen
- Reparatur
- Replica plating
- Katabolisch konstitutiv
- Anabolisch konstitutiv
- Definitionen,
- Ames-Test
- Mutationsarten
- Salmonella enterica pv
Typhimurium, His-auxotrophe
Mutante, Reversionsrate 10-7
- Mutationsfolgen
- Gründe, Mutanten herzustellen
- Mutationsauslösung
- Mutantenselektion
- Anwendungen
- Reparatur
Mutagenität
Carcinogenität
Testsubstanz:
• direkt
• Leberextrakt
• DNA nach Transfektion
Copyright Brock
- Definitionen,
- Ames-Test
- Mutationsarten
- Salmonella enterica pv
Typhimurium, His-auxotrophe
Mutante, Reversionsrate 10-7
- Mutationsfolgen
- Gründe, Mutanten herzustellen
- Mutationsauslösung
- 10 bis 20 spontane Revertanten
pro Platte, 84% Treffer
- Mutantenselektion
- E. coli Trp-Sytem: 91%
- Anwendungen
- Leberextrakte und andere
Abwandlungen
- Reparatur
Single event Zeiten
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Bedingung: dsDNA/ssDNA, 37°C, pH 7.4, 2 Mb DNA
Depurination: 10 h / 2.5 h
Depyrimidierung: 200 h / 51 h
Deaminierung von C: 700 h / 2.8 h
Deaminierung von A: nicht messbar / 140 h
(Lebenszeit von E. coli: 20 min minimal, 16 h normal)
Reparatur-Ebenen:
1.  Damage Reversal: WT, kein Fehler.
2.  Excision, mismatch repair: Fehler = Replikationsfehler
von PolI
3.  Rekombinations-Reparatur: teilweise FehlerKonservierung
4.  „Fehler-Polymerasen“ wie UmuCD. TLS = translesion
synthesis.
Verhältnis Reparatur zu Rekombination zu Replikation zur Verdopplungszeit
Reparatur-Ebenen:
1.  Damage Reversal: WT, kein Fehler: DNA-Ligase,
Photoreaktivierung, spore photoproduct repair,
Ada-System.
2.  Excision, mismatch repair: Fehler = Replikationsfehler
von PolI
3.  Rekombinations-Reparatur: teilweise FehlerKonservierung
4.  „Fehler-Polymerasen“ wie UmuCD. TLS = translesion
synthesis.
Structural images of LigA bound to nicked DNA, NAD+, or a small molecule inhibitor
Shuman, S. J. Biol. Chem. 2009;284:17365-17369
Three-step pathway of nick sealing by DNA ligase
Shuman, S. J. Biol. Chem. 2009;284:17365-17369
Thymin-Dimere
Damage Reversal
Cyclobutyl-Dipyrimidine: light-activated flavoenzyme, +40 mV, sensitiv to DNA pertubations
Complete photocycle of CPD repair by photolyase.
Liu Z et al. PNAS 2011;108:14831-14836
©2011 by National Academy of Sciences
Enzyme-substrate complex structure and one sequential repair mechanism with all
elementary reactions.
Liu Z et al. PNAS 2011;108:14831-14836
©2011 by National Academy of Sciences
Spore photoproduct: 5-thymine-5,6-dihydrothymine: SP-Lyase, SAM-dependent FeS-Protein
Chandor-Proust, A. et al. J. Biol. Chem. 2008;283:36361-36368
Damage Reversal
Spore photoproduct: 5-thymine-5,6-dihydrothymine: SP-Lyase, SAM-dependent FeS-Protein
Chandor-Proust, A. et al. J. Biol. Chem. 2008;283:36361-36368

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