Chemie in der Biomedizin Strukturanalyse und biochemische Funktionen von Vitamin C Chemische Struktur von L-Ascorbinsäure (Vitamin C) Novartis Schullabor, Kurs BioChemie 2015 Beachten Sie die Laborregeln! Inhalt Vorbereitungen 1 ......................................................................................................................... 3 Vorbereitungen 2 ......................................................................................................................... 4 Vorbereitungen 3 ......................................................................................................................... 5 Experiment 1: Enzymatische Oxidation ....................................................................................... 6 Methode: Kinetik mit einem Enzym als Bio-Katalysator ........................................................ 6 Laboranleitung ..................................................................................................................... 7 Experiment 2: Konzentrationsbestimmung von Ascorbinsäure .................................................. 10 Methode: Quantifizierung .................................................................................................. 10 Laboranleitung ................................................................................................................... 10 Experiment 3: Absorptionsspektrum von Ascorbinsäure ............................................................ 13 Methode: Wavelength Scan (Wellenlängen Scan) .............................................................. 13 Laboranleitung: .................................................................................................................. 14 Herausgeber: Novartis Pharma AG, CH-4002 Basel Gesche Standke Version 1-2015 Kontaktadresse: Novartis Pharma AG Dr. Gesche Standke WKL-122.2.26A Postfach CH-4002 Basel Tel. 061/696 13 72 E-Mail: [email protected] Internet: www.novartis.ch/de/ueber-uns/unser-engagement/learn-life/schullabor 2 Beachten Sie die Laborregeln! Vorbereitungen 1 Phosphatpuffer System 1. Lösen Sie 3,55 g Na2HPO4 (*Mw = 142g/mol) in 500ml destilliertem Wasser. 2. Lösen Sie 3,4 g KH2PO4 (*Mw = 136g/mol) in 500ml destilliertem Wasser. Sie erhalten jeweils eine 0,05 M Lösung. Beschriften Sie 3 Flaschen mit P1 bis P3. Durch Mischung der beiden Lösungen erhalten Sie folgende Puffer: P Na2HPO4 0,05 M KH2PO4 0,05 M Volumen pH Vernier 1 0.5 ml 99.5 ml 100 ml 2 10 ml 190 ml 200 ml 3 100 ml 100 ml 200 ml Messen 1. 2. 3. 4. 5. 6. Schrauben Sie die kleine Flasche vom Sensor auf. Ziehen Sie die Flasche und auch den Deckel von der Glaskugel des Sensors. Stellen Sie die Flasche mit Deckel sicher ins Regal! Spülen Sie die Sonde mit einer Spritzflasche über einem Becherglas ab. Spülen Sie dabei nur den Glasteil der Sonde! Schliessen Sie die Sonde an LabQuest2 an. Die Sonde wird automatisch erkannt. Die Messung sollte mindestens 20 Sekunden dauern bis ein stabiler Wert erreicht ist. Messen Sie nacheinander die pH-Werte der Lösungen. Spülen Sie nach jeder Messung die Sonde mit Wasser. Für Experiment 3 messen Sie in einem Reagenzglas den pH-Wert von: Puffer P2 2,4 ml 7. 8. 9. 0,2 M HCl 0,3 ml pH Die gespülte Sonde kann anschliessend wieder in der kleinen Flasche mit Salzlösung aufbewahrt werden. Ziehen Sie erst den Deckel über die Sonde und schrauben Sie dann die Flasche an. Leeren Sie das Reagenzglas am Spültisch und legen Sie es dann in den Korb. Für Experiment 1 füllen Sie 6 Reagenzgläser mit Puffer P3 und beschriften diese mit P3! Die drei Flaschen mit P1 – P5 stellen Sie für die nächsten Versuche zentral hin. *Definition: 1 M = das Mw in g pro 1 Liter Wasser/Puffer Verdünnung 1:10 heisst 1 Teil Konzentrat plus 9 Teile Wasser/Puffer ergibt 10 Teile 3 Beachten Sie die Laborregeln! Vorbereitungen 2 Ascorbinsäure-Lösungen Ascorbinsäure ist in Lösung labil. In saurer Lösung ist das Molekül stabiler, aber bei Raumtemperatur nicht lange haltbar. Bereiten Sie für die Experimente eine frische, hochkonzentrierte Stammlösung vor. *L-Ascorbinsäure Mw = 176 g/mol *D-Isoascorbinsäure Mw = 176 g/mol Puffer P2 und P3 erhalten Sie von Gruppe 1! 1. Wiegen Sie auf einem neuen Wägeschälchen mit der Analysenwaage 88 mg Ascorbinsäure ab. 2. Pipettieren Sie 10 ml Phosphatpuffer P2 in ein 15 ml-Falcon-Röhrchen (blauer Deckel) und geben Sie die Ascorbinsäure hinzu. . Schliessen Sie den Deckel und schütteln Sie gut, damit sich das Pulver vollständig löst. Beschriften Sie das Röhrchen mit „Asc-Konz“. 3. Messen Sie im Messzylinder 50ml Phosphatpuffer P2 ab und füllen Sie damit das 50 mlFalcon-Röhrchen (blauer Deckel). Pipettieren Sie 0,5 ml des Konzentrats aus dem 15 ml-Falcon-Röhrchen „Konz“ hinzu. Schliessen Sie den Deckel und schütteln Sie gut. Beschriften Sie das Röhrchen mit „Asc“. 4. Wiederholen Sie Punkt 1-2 mit Isoascorbinsäure! Beschriften Sie die Röhrchen mit „Isoasc-Konz“ bzw. „Isoasc“. 5. Stellen Sie alle Lösungen ins Eis! 6. Für Experiment 1 beschriften Sie je 6 Reagenzgläser mit L-Asc bzw. D-Isoasc und pipettieren Sie jeweils: L-Asc D-Isoasc Asc 2 ml Isoasc 2 ml Puffer P3 10 ml 10 ml *Definition: 1 M = das Mw in g pro 1 Liter Wasser/Puffer Verdünnung 1:10 heisst 1 Teil Konzentrat plus 9 Teile Wasser/Puffer ergibt 10 Teile 4 Beachten Sie die Laborregeln! Vorbereitungen 3 Enzympräparation als Rohextrakt 1. Schälen Sie von der grünen Schale eines Zucchini ca. ein 5cm Stück ab. 2. Wiegen Sie 20g der Zucchinischale im Becher des Stabmixers ab. 3. Messen Sie im Messzylinder 100ml Puffer P3 ab. Giessen Sie die 100ml Puffer P3 zu den Zucchinistücken. 4. Pürieren Sie die Mischung mindestens 60 Sekunden auf höchster Stufe bis ein homogener Extrakt entsteht. 5. Schneiden Sie die Spitze einer blauen Pipettenspitze ab, damit sie nicht verstopft. Pipettieren Sie in 3 der 2ml-Röhrchen je 2 ml des Safts. Werfen Sie gebrauchten Spitzen in den Entsorgungsbeutel ab. 6. Zentrifugieren Sie die Röhrchen 5 Minuten bei 13.400 rpm. Achten Sie darauf, dass der Rotor austariert ist! 7. Inzwischen beschriften Sie 6 Röhrchen auf dem Deckel mit A und weitere 6 Röhrchen auf dem Deckel mit B. 8. Pipettieren Sie 1 ml Überstand der zentrifugierten Proben in 3 grüne Röhrchen. Werfen Sie die Röhrchen mit den Zucchiniresten in den Entsorgungsbeutel. 9. Pipettieren Sie in die 12 Röhrchen je 0,2 ml Enzymlösung aus den grünen Röhrchen. 10. Stellen Sie die Röhrchen mit A für 15 Minuten bei 95°C in den Heizblock. Die Röhrchen mit B bleiben auf Eis. Nach 15 Minuten bei 95°C stellen Sie auch Röhrchen A auf Eis. 11. Inzwischen räumen Sie auf! Werfen Sie die Zucchinireste in den blauen Eimer. Spülen Sie das gebrauchte Geschirr ab und legen Sie es auf den Spütisch. 5 Beachten Sie die Laborregeln! Experiment 1: Enzymatische Oxidation Methode: Kinetik mit einem Enzym als Bio-Katalysator Das Kupfer-Enzym Ascorbat Oxidase (EC 1.10.3.3) katalysiert spezifisch und effizient die Oxidation der L-Ascorbinsäure (Asc) zur Dehydroascorbinsäure (DHAsc). Es ist in vielen Pflanzen vorhanden und reguliert das Verhältnis von oxidiertem und reduziertem Glutathion und NADPH in der Pflanzenzelle. Asc + ½ O2 → DHAsc + H2O Enzyme sind oft stereospezifisch und beschleunigen eine Reaktion enorm. Die enzymatische Katalyse, das heisst die Aktivität des Enzyms, kann durch die Messung der Reaktionsgeschwindigkeit bestimmt werden als Stoffumsatz pro Zeiteinheit: -ΔAbs 265nm/Δt = relative Enzymaktivität Es wird photometrisch die Abnahme von Ascorbinsäure als Abnahme der Absorption bei 265nm gemessen. DHAsc hat bei 265nm keine Absorption. Material Holen Sie sich von der Vorbereitung Je ein Reagenzglas mit: Phosphatpuffer P3 L-Asc D-Isoasc und die Enzymlösungen: Röhrchen mit A Röhrchen mit B 6 Beachten Sie die Laborregeln! Laboranleitung Einrichten des Photometers 1. Das Photometer muss 20 Minuten vor Messbeginn eingeschaltet werden. Auf dem Laptop ist das Programm UV Professional aktiv. Starten Sie mit New File > Kinetics, siehe Abbildung 1. 2. Überprüfen Sie die Einstellungen (Abbildung 2): Test Mode Absorbancy Data (Abs) Wavenlength Setup 265.0 nm Scale Setup Top: 1.500 Abs Bottom:0.000 Abs Start Time 0 s End Time 60 s Interval 2 Second Display Setup: Tick Scale Grid und Data Table Abbildung 1 3. Klicken Sie dann OK. Abbildung 2 4. Pipettieren Sie 3 ml Puffer P3 in die Quarz Küvette. Fassen Sie die Küvette nur an den matten Seiten an. Stellen Sie die Küvette dann in den vorderen Probenhalter des Photometers. Eine matte Seite zeigt zu Ihnen, die klaren Seiten befinden sich dann im Lichtstrahl. Schliessen Sie den Deckel und starten Sie am Laptop das Programm mit dem „Set blank“ button: Damit setzten Sie die Absorption von Lösemittel und Küvette auf 0.000 Abs. 5. Giessen Sie den Küvetteninhalt in ein Becherglas und kehren Sie die leere Küvette zum Abtupfen auf ein Papiertuch. Wischen Sie nicht! 7 Beachten Sie die Laborregeln! Messen 1. Pipettieren Sie in die Quarz Küvette 3ml aus Reagenzglas L-Asc. 2. Stellen Sie die Quarz Küvette in den vorderen Probenhalter des Photometers. Fassen Sie die Küvette nur an den matten Seiten an. Die matte Seite zeigt zu Ihnen. Schliessen Sie den Deckel. Machen Sie den nächsten Schritt zu zweit! Lesen Sie erst! 3. Schnell: Nehmen Sie mit der Pipette 0,1ml Probe A auf. Starten Sie am Laptop das Messprogramm . Öffnen Sie das Photometer und pipettieren Sie jetzt 0,1 ml Probe A in die Küvette. Rühren Sie einmal gut um. Schliessen Sie den Deckel wieder und warten Sie, bis das Messprogramm abgelaufen ist. Die Messung sieht anfangs etwa so aus: Die Absorption bei t=0 zeigt die Ausgangskonzentration der Ascorbinsäurelösung. Der Extrakt enthält Substanzen, die ebenfalls bei 265nm absorbieren. Daher steigt die Absorption nach Zugabe des Extrakts und Schliessen des Deckels. Deckel auf 4. Nach Beenden der Messung speichern Sie entsprechend der Aufforderung die Messung mit Datum, Ihren Initialen und Probennummer, z. B. 19-7-2015 GR A 5. Giessen Sie den Küvetteninhalt in ein Becherglas. Kehren Sie die leere Küvette zum Abtupfen auf ein Papiertuch. Wischen Sie nicht! 6. Messen Sie nacheinander von Punkt 2-4. 1 2 3 4 L-Asc 3ml L-Asc 3ml D-Isoasc 3ml D-Isoasc 3ml Probe A 0,1ml Probe B 0,1ml Probe A 0,1ml Probe B 0,1ml 7. Die Dateien benötigen Sie für die Auswertung des Versuchs. Spülen Sie gebrauchte Reagenzgläser kurz aus und legen Sie in den Korb am Spültisch. 8 Beachten Sie die Laborregeln! Auswertung 1. Woher wissen Sie, dass Sie eine enzymatische Katalyse anschauen? 2. Welche Probe ist eine Kontrolle und welche Probe zeigt Ihnen die katalytische Aktivität des Enzyms? Werten Sie diese Probe bei 3. aus. 3. Ermitteln Sie aus der Messung die Anfangsgeschwindigkeit: Suchen Sie auf dem Graph einen möglichst linearen Bereich der steilsten Kurve aus. Lesen Sie in der Time Scan Record List, siehe unten, die Absorbance-Werte für Zeitpunkt t1 und Zeitpunkt t2 ab, dabei sollten t1 und t2 mindestens 10 s auseinander liegen. Da die Aktivität des Enzyms proportional der Abnahme der Absorption ist, beachten Sie das Vorzeichen. Enzym Probe Abs t1 Abs t2 Δ t in min ΔAbs t2-t1 = Abs t2 - Abs t1 - ΔAbs /min = Geschwindigkeit Beispiel Probe X 0,947 0,518 10:60=0,167 - 0,43 2,57 9 Beachten Sie die Laborregeln! Experiment 2: Konzentrationsbestimmung von Ascorbinsäure Methode: Quantifizierung Das Lambert-Beer’schen Gesetz stellt den Zusammenhang zwischen Konzentration und Absorption einer Lösung her: A = c ελ d c- Konzentration der Lösung, ελ – Extinktionskoeffizient, d - Schichtdicke In diesem Versuch stellen Sie eine möglichst genaue Verdünnungsreihe von Ascorbinsäure her. Von den Verdünnungen mit bekannter Konzentration messen Sie die Absorption. Tragen Sie in einem Diagramm die Absorptionen gegen die Konzentrationen auf, erhalten Sie, wenn Sie die Punkte verbinden, eine Gerade. Diese Eichgerade gestattet Ihnen, die Konzentrationen an Ascorbinsäure in den anderen Versuchen zu bestimmen, vgl. Seite 5. Konzentrationen werden in der Chemie in der Regel in Molaritäten (Mol/Liter) angegeben. Vitamin C Gehalte in Lebensmitteln findet man hingegen in mg/100g. Beides lässt sich einfach ineinander umrechnen. Der Vitamin C Gehalt eines Pflanzenextrakts lässt sich mit der hier beschriebenen Methode nicht bestimmen, da Proteine und DNA im Pflanzenextrakt ebenfalls bei 260- 280nm absorbieren. Material Puffer P2 L-Ascorbinsäure Laboranleitung Herstellen einer Konzentrationsreihe 1. Berechnen Sie wieviel mg Ascorbinsäure in 100ml Puffer P2 gelöst werden muss, um eine 0,01 M Ascorbinsäurelösung zu bekommen: ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ ______________________________________________________________________ 2. Stellen Sie die Lösung in einem 100ml Messkolben her. Das wird nur EINMAL gemacht! 3. Jedes Team: Scheiben Sie auf ein Reagenzglas „Asc“. Verdünnen Sie 1: 100, das heisst 0,1 ml der 0,01 M Ascorbinsäurelösung in 9,9 ml P2. Die Asc-Lösung hat eine Konzentration von 0,1 mM. Arbeiten Sie genau! 10 Beachten Sie die Laborregeln! 5. Beschriften Sie 5 Reagenzgläser mit 1-5. 6. Pipettieren nach der Tabelle die Konzentrationsreihe: Nr. Konzentration Asc P2 1 (0.01 mM) 0,4ml 3,6ml 2 (0.02 mM) 0,8ml 3,2ml 3 (0.03 mM) 1,2ml 2,8ml 4 (0.04 mM) 1,6ml 2,4ml 5 (0.05 mM) 2ml 2ml Einrichten des Photometers 1. Das Photometer muss 20 Minuten vor Messbeginn eingeschaltet werden. Auf dem Laptop ist das Programm UV Professional aktiv. Starten Sie mit New File > Quantitation, siehe Abbildung 1 Abbildung 1 Überprüfen Sie die Einstellungen (Abbildung 2): Method: First-order-zero Standard Sample No.: 5 Conc.Unit:mM/L Wavelength No.: Single Wavelength Wavelength WL.1 = 265.0 nm 5 265.0 Abbildung 2 2. Pipettieren Sie 3 ml Puffer P2 in die Quarz Küvette. Fassen Sie die Küvette nur an den matten Seiten an. Stellen Sie die Küvette dann in den vorderen Probenhalter des Photometers. Eine matte Seite zeigt zu Ihnen, die klaren Seiten befinden sich dann im Lichtstrahl. Schliessen Sie den Deckel und starten Sie am Laptop das Programm mit „Set blank“. Damit setzten Sie die Absorption von Lösemittel und Küvette auf 0.000 Abs. 3. Giessen Sie den Küvetteninhalt in ein Becherglas und kehren Sie die leere Küvette zum Abtupfen auf ein Papiertuch. Wischen Sie nicht! 11 Beachten Sie die Laborregeln! Messen 1. Messen Sie die fünf Konzentrationen der Reihe nach. Pipettieren Sie für jede Messung 3 ml in eine Quarz Küvette. 2. Stellen Sie die Quarz Küvette mit der Probe in den vorderen Probenhalter des Photometers. Fassen Sie die Küvette nur an den matten Seiten an. Die matte Seite zeigt zu Ihnen. Schliessen Sie den Deckel. 3. Mit einem Doppelklick auf Absorbance der Tabelle unter der Graphik nehmen Sie die Messung in die Tabelle auf. Mit einem Doppelklick fügen Sie die Konzentration der Probe ins Feld „Conc.“ ein. Achtung: Schreibweise 0.1 und nicht 0,1! 4. Pipettieren Sie den Küvetteninhalt zurück in das Reagenzglas. Es sollen keine Reste in der Küvette bleiben! 5. Wiederholen Sie die Messung mit allen Konzentrationen. 6. Mit einem Doppelklick in die Graphik wird Ihre Eichgerade erstellt. 7. Speichern Sie die gesamte Messung. Sie können mit der Eichkurve einfach für alle Absorptionswerte die Konzentration ablesen. Spülen Sie gebrauchte Reagenzgläser kurz aus und legen Sie in den Korb am Spültisch. Auswertung 1. Warum müssen Sie für dieses Experiment besonders exakt arbeiten? 2. Rechnen Sie nach: Zucchini enthält ca. 150 mg Vitamin C pro kg. Rechnen Sie mit 1kg =1l. Sie haben 20g Zucchini mit 80ml P3 gemixt, d.h. Verdünnung ist 1:5. Sie haben 0,1 ml des Extrakts in 3ml P3 gemessen; Verdünnung 1:31 Wie hoch ist der Verdünnungsfaktor?_____0,0065________________ Wieviel mg/l Vitamin C sind enthalten: 150 x 0,0065 = 0,97 mg/l Wieviel mM/l sind das? 0,97 / 176 = 0,0055 mM/l Wie hoch wäre die Absorption bei 265nm für den frischen Extrakt: Xxxx finden Sie bei Ihrer Eichkurve A= Conc./(xxxx) = 12 Beachten Sie die Laborregeln! Experiment 3: Absorptionsspektrum von Ascorbinsäure Methode: Wavelength Scan (Wellenlängen Scan) Die chemische Struktur der Ascorbinsäure lässt sich von Hexose-Zuckern ableiten. Die charakteristische konjugierte Endiol-Carbonyl Gruppe ist ein interessantes chemisches System. Die Elektronen sind in dem konjugierten System delokalisiert, d.h. über den Bereich der alternierenden Doppelbindungen verteilt. Dieser Bereich kann durch negativ geladene Reste im Molekül erweitert werden. Je grösser die Elektronenwolke des konjugierten Systems ist, desto grösser ist die Wellenlänge, die absorbiert wird. Ascorbinsäure absorbiert nicht sichtbares UVLicht und ist für unser Auge farblos. Die Spektralanalyse findet im UV-Bereich statt (10). Ascorbinsäure reagiert sauer in Wasser. Es gibt eine Strukturformel für die protonierte Form und zwei Strukturformeln für die deprotonierte Form. - H+ L-Ascorbinsäure Mesomerie von L- Monoascorbat pKs1 = 4,2 In diesem Versuch wird die Änderung des Absorptionsmaximums der protonierten und deprotonierten Form der Ascorbinsäure photometrisch gemessen. Die Absorption von Ascorbinsäure-Lösungen mit verschiedenen pH-Werten wird mittels eines Wellenlängen Scans im UV-Bereich aufgezeichnet. Ascorbinsäure-Lösung wird eine Quarz Küvette übertragen und mit Hilfe des Photometers vermessen. Die Absorptionsmaxima sind für die chemische Struktur einer Substanz charakteristisch. Wird die Struktur der zu untersuchenden Substanz durch die Umgebung, hier durch den pH-Wert, des Lösungsmittels beeinflusst, lässt sich der Effekt in der Spektralanalyse zeigen. Material: 0,2 M HCl Puffer P2 Ascorbinsäure-Lösung: Verdünnung 1/100 von Stammlösung „ Asc-Konz“ d.h. 0,1 ml „ Asc-Konz“ in 9,9 ml P2 13 Beachten Sie die Laborregeln! Laboranleitung: Einrichten des Photometers 1. Das Photometer muss 20 Minuten vor Messbeginn eingeschaltet werden. Auf dem Laptop ist das Programm UV Professional aktiv. Starten Sie mit New File > Wavelength Scan, siehe Bild 1. 2. Überprüfen Sie die Einstellungen (Bild 2): Scale Setup Top: 0.900 Abs Bottom:0.000 Abs Test Mode Absorbancy Start WL 220.0 nm End WL 280 nm Intervall 1.0 nm Slow Speed Bild 1 3. Klicken Sie dann OK. 4. Set System Baseline: Klicken Sie auf das Symbol Wählen Sie „open“ Bild 2 Es öffnet sich ein Fenster. schliessen Sie dann das Fenster mit OK. 5. Pipettieren Sie 3 ml Puffer P2 in die Quarz Küvette. Fassen Sie die Küvette nur an den matten Seiten an. Stellen Sie die Küvette dann in den vorderen Probenhalter des Photometers. Eine matte Seite zeigt zu Ihnen, die klaren Seiten befinden sich dann im Lichtstrahl. Schliessen Sie den Deckel und starten Sie am Laptop das Programm mit „Set blank“: 6. Damit setzten Sie die Absorption von Lösemittel und Küvette auf 0.000 Abs. 7. Giessen Sie den Küvetteninhalt in ein Becherglas und kehren Sie die leere Küvette zum Abtupfen auf ein Papiertuch. Wischen Sie nicht! 14 Beachten Sie die Laborregeln! Vorbereiten der Proben 1. Nummerieren Sie 2 Reagenzgläser für die Proben. 2. Pipettieren Sie nach folgendem Schema: Probe Puffer P2 0,2 M HCl 1 2 2,4 ml 2,7 ml 0,3 ml - 0,5 mM Ascorbinsäure-Lösung (Asc 1:100) 0,3 ml 0,3 ml Messen 1. Giessen Sie den Inhalt von Reagenzglas 1 in die Quarz Küvette. Fassen Sie die Küvette nur an den matten Seiten an. Stellen Sie die Küvette in den vorderen Probenhalter des Photometers. Die matte Seite zeigt zu Ihnen. Schliessen Sie den Deckel und starten Sie am Laptop das Messprogramm. 2. Nach Beenden des Scans, speichern Sie entsprechend der Aufforderung die Messung mit Datum, Ihren Initialen und Probennummer, z. B. 19-7-2015 GJR 1 3. Verfahren Sie mit Probe 2 analog wie Probe 1. Spülen Sie gebrauchte Reagenzgläser kurz aus und legen Sie in den Korb am Spültisch. 15 Beachten Sie die Laborregeln! Auswertung Tragen Sie in die Tabelle die Werte Ihrer zwei Wellenlängen Scans ein. Die pH-Werte wurden bei Vorbereitung 1 ermittelt. Probe pH Maximum bei Wellenlänge (nm) 1 2 1. Warum reagiert Ascorbinsäure in wässriger Lösung sauer? 2. Welche der Strukturformeln der Ascorbinsäure ordnen Sie welchem pH-Wert zu? A B C 3. Zeichnen Sie das delokalisierte Elektronensystem als Elektronenwolke über die Strukturformeln. 16
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