PHD1 Inhibierung vermittelt Lungenprotektion im murinen ARDS Model über eine HIF-abhängige Induktion der microRNA miR-16 S. Högl1,2, K. S. Brodsky1, B. Zwißler2, H. K. Eltzschig1 1 Organ Protection Program, Department of Anesthesiology, University of Colorado, School of Medicine, Aurora, Colorado, USA 2 Klinik für Anaesthesiologie, LMU München Fragestellung Das Enzym Prolyl-Hydroxylase-Domäne 1 (PHD1) ist ein wichtiger Regulator des zellulären Sauerstoffmetabolismus, und vermittelt unter Normoxie die Hydroxylierung und darauf folgende Degradation des Transkriptionsfaktors „hypoxia-inducible factor“ HIF-1α. Wir stellten die Hypothese auf, dass beim beatmungsinduzierten Lungenschaden (VILI) die Inhibierung von PHD1 über eine Stabilisierung von HIF-1α zur Verbesserung der alveolären Barrierefunktion beitragen könnte 1,2. Methodik Alle Tierversuche wurden durch die zuständigen Behörden genehmigt. Zur VILIInduktion wurden Mäuse für 3h druckkontrolliert beatmet (pmax: 45 mbar, PEEP: 3 mbar, AF: 80/min, FiO2: 100%) 3. Folgende Mauslinien wurden verwendet: Wild-Typ (WT; C57/BL6), Transkriptionelle Proteinebene PHD1-/-, HIF-1α-/- Veränderungen mittels ELISA und wurden analysiert. Cre+-Kontrollen. korrespondierende mittels Um RT-PCR, potentielle Änderungen PHD1 auf regulierende microRNAs (miRNAs) zu identifizieren, führten wir eine in-silico Suche durch und verifizierten diese mittels RT-PCR. In einem In-vitro-Modell wurden pulmonale Epithelzellen (humane Tumorzelllinie Calu-3) zyklischem Stretch ausgesetzt. ProteinDNA-Interaktionen wurden mit Hilfe von Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP) untersucht. Zur statistischen Auswertung verwendeten wir die zweifaktorielle Varianzanalyse (Bonferroni Post-Hoc-Test) bzw. t-Tests, Ergebnisse als Mittelwert [SD]. Ergebnisse Mäuse mit genetischem PHD1 Knockout zeigten nach VILI eine geringere histologische Lungenschädigung und Durchlässigkeit der alveolo-kapillären Barriere (Albuminkonzentration (BAL): WT = 5431 [2166] µg/ml vs. PHD1-/- = 667 [184] µg/ml), die pulmonale mRNA-Expression inflammatorischer Zytokine war ebenfalls signifikant reduziert. Da WT-Mäuse nach VILI eine pulmonale PHD1-Repression zeigten, könnte dies über eine posttranskriptionelle Genregulation mittels miRNA vermittelt sein. Bei der RT-PCR Analyse potentieller Target-miRNAs für PHD1 kam es nur beim miR-15a/16 Cluster zu einer signifikanten Induktion im Lungengewebe nach VILI (A). In vitro Untersuchungen an Calu-3 zeigten eine frühe Induktion von miR-16 durch Zellstretch, welche für die beobachtete PHD1 Repression verantwortlich war (B, C). Wir konnten drei mögliche HIF-Bindungsstellen in der Promoterregion von miR-15a/16 identifizieren (hypoxia-response elements, HREs), über die eine HIF-bedingte Induktion vermittelt sein könnte. ChIP zeigte eine Bindung von HIF-1α an zwei HREs des Promoters. Nach Hypoxie zeigte sich in Calu-3 Zellen eine zeitlich abhängige Induktion von miR-16 mit entsprechender PHD1 Suppression (D, E). In Calu-3 Zellen mit siRNA vermittelter Repression von HIF-1α war die Hypoxie-abhängige miR-16 Induktion komplett geblockt (F). Im VILI Tiermodell machten wir ähnliche Beobachtungen, da HIF-1α-/- Mäuse nach VILI keine Induktion von miR-16 zeigten (G). B *** * mmu-miR-15a mmu-miR-23b Kontrolle VILI mmu-miR-15b mmu-miR-23a mmu-miR-322 0 C 6 4 PHD1 mRNA (fold change) mmu-miR-16 hsa-miR-16 (fold change) A *** * 2 0 1 2 3 4 5 Relative miRNA Expression (fold change) 1.5 1.0 0.5 0 2 4 6 8 16 24 Stretch [h] 2 0 0 1 2 4 6 8 1624 Hypoxie [h] 1.0 0.5 * ****** *** *** *** 0.0 G Kontroll siRNA HIF-1 siRNA 3 *** *** *** 2 1 0 0 1 2 4 6 8 1624 Hypoxie [h] 0 1 2 4 mmu-miR-16 (fold change) 4 F hsa-miR-16 (fold change) 6 E *** *** ** PHD1 mRNA (fold change) hsa-miR-16 (fold change) D 1.5 ** * 0.0 0 2 4 6 8 16 24 Stretch [h] 8 ** ****** *** 2.5 Kontrolle HIF-1 -/- * * 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0 Kontrolle VILI Hypoxie [h] (A) Screening von miRNAs mit PHD1 mRNA-Bindungsstellen (Lungenhomogenat). (B) Induktion von miR-16 durch Stretch (Calu-3). (C) Suppression von PHD1 durch Stretch (Calu-3). (D) Hypoxische Induktion von miR-16 (Calu-3). (E) Hypoxische Suppression von PHD1 (Calu-3). (F) Fehlende hypoxieabhängige miR-16 Induktion nach Repression von HIF-1α mittels siRNA (Calu-3). (G) Fehlende miR-16 Induktion nach VILI in HIF-1α-/- Mäusen (Lungenhomogenat). MW [SD]; n=5-7; * p< 0,05, ** p<0,01, *** p<0,005. Interpretation Eine verminderte Expression von PHD1 und Stabilisierung von HIF-1α schützt das Lungenepithel während VILI vor Schädigung. Dieser protektive Mechanismus wird über eine HIF-1α-abhängige Induktion von miR15a/16 im Lungenepithel vermittelt. Literatur 1. Hoegl S, Zwissler B, Eltzschig HK, Vohwinkel C. Acute respiratory distress syndrome following cardiovascular surgery: current concepts and novel therapeutic approaches. Curr Opin Anaesthesiol. 2016;29(1):94-100. 2. Schneider M, Van Geyte K, Fraisl P, et al. Loss or silencing of the PHD1 prolyl hydroxylase protects livers of mice against ischemia/reperfusion injury. Gastroenterology. 2010;138(3):1143-1154 e1141-1142. 3. Hoegl S, Brodsky KS, Blackburn MR, Karmouty-Quintana H, Zwissler B, Eltzschig HK. Alveolar Epithelial A2B Adenosine Receptors in Pulmonary Protection during Acute Lung Injury. J Immunol. 2015;195(4):1815-1824.
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