PHD1 Inhibierung vermittelt Lungenprotektion im murinen ARDS

PHD1 Inhibierung vermittelt Lungenprotektion im murinen ARDS Model über
eine HIF-abhängige Induktion der microRNA miR-16
S. Högl1,2, K. S. Brodsky1, B. Zwißler2, H. K. Eltzschig1
1
Organ Protection Program, Department of Anesthesiology, University of Colorado,
School of Medicine, Aurora, Colorado, USA
2
Klinik für Anaesthesiologie, LMU München
Fragestellung
Das Enzym Prolyl-Hydroxylase-Domäne 1 (PHD1) ist ein wichtiger Regulator des
zellulären Sauerstoffmetabolismus, und vermittelt unter Normoxie die Hydroxylierung
und darauf folgende Degradation des Transkriptionsfaktors „hypoxia-inducible factor“
HIF-1α. Wir stellten die Hypothese auf, dass beim beatmungsinduzierten
Lungenschaden (VILI) die Inhibierung von PHD1 über eine Stabilisierung von HIF-1α
zur Verbesserung der alveolären Barrierefunktion beitragen könnte 1,2.
Methodik
Alle Tierversuche wurden durch die zuständigen Behörden genehmigt. Zur VILIInduktion wurden Mäuse für 3h druckkontrolliert beatmet (pmax: 45 mbar, PEEP: 3
mbar, AF: 80/min, FiO2: 100%) 3. Folgende Mauslinien wurden verwendet: Wild-Typ
(WT;
C57/BL6),
Transkriptionelle
Proteinebene
PHD1-/-,
HIF-1α-/-
Veränderungen
mittels
ELISA
und
wurden
analysiert.
Cre+-Kontrollen.
korrespondierende
mittels
Um
RT-PCR,
potentielle
Änderungen
PHD1
auf
regulierende
microRNAs (miRNAs) zu identifizieren, führten wir eine in-silico Suche durch und
verifizierten diese mittels RT-PCR. In einem In-vitro-Modell wurden pulmonale
Epithelzellen (humane Tumorzelllinie Calu-3) zyklischem Stretch ausgesetzt. ProteinDNA-Interaktionen wurden mit Hilfe von Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP)
untersucht. Zur statistischen Auswertung verwendeten wir die zweifaktorielle
Varianzanalyse (Bonferroni Post-Hoc-Test) bzw. t-Tests, Ergebnisse als Mittelwert
[SD].
Ergebnisse
Mäuse mit genetischem PHD1 Knockout zeigten nach VILI eine geringere
histologische Lungenschädigung und Durchlässigkeit der alveolo-kapillären Barriere
(Albuminkonzentration (BAL): WT = 5431 [2166] µg/ml vs. PHD1-/- = 667 [184] µg/ml),
die
pulmonale
mRNA-Expression
inflammatorischer
Zytokine
war
ebenfalls
signifikant reduziert. Da WT-Mäuse nach VILI eine pulmonale PHD1-Repression
zeigten, könnte dies über eine posttranskriptionelle Genregulation mittels miRNA
vermittelt sein. Bei der RT-PCR Analyse potentieller Target-miRNAs für PHD1 kam
es nur beim miR-15a/16 Cluster zu einer signifikanten Induktion im Lungengewebe
nach VILI (A). In vitro Untersuchungen an Calu-3 zeigten eine frühe Induktion von
miR-16
durch
Zellstretch,
welche
für
die
beobachtete
PHD1
Repression
verantwortlich war (B, C). Wir konnten drei mögliche HIF-Bindungsstellen in der
Promoterregion von miR-15a/16 identifizieren (hypoxia-response elements, HREs),
über die eine HIF-bedingte Induktion vermittelt sein könnte. ChIP zeigte eine Bindung
von HIF-1α an zwei HREs des Promoters. Nach Hypoxie zeigte sich in Calu-3 Zellen
eine zeitlich abhängige Induktion von miR-16 mit entsprechender PHD1 Suppression
(D, E). In Calu-3 Zellen mit siRNA vermittelter Repression von HIF-1α war die
Hypoxie-abhängige miR-16 Induktion komplett geblockt (F). Im VILI Tiermodell
machten wir ähnliche Beobachtungen, da HIF-1α-/- Mäuse nach VILI keine Induktion
von miR-16 zeigten (G).
B
***
*
mmu-miR-15a
mmu-miR-23b
Kontrolle
VILI
mmu-miR-15b
mmu-miR-23a
mmu-miR-322
0
C
6
4
PHD1 mRNA (fold change)
mmu-miR-16
hsa-miR-16 (fold change)
A
***
*
2
0
1
2
3
4
5
Relative miRNA Expression (fold change)
1.5
1.0
0.5
0 2 4 6 8 16 24
Stretch [h]
2
0
0 1 2 4 6 8 1624
Hypoxie [h]
1.0
0.5
*
******
*** ***
***
0.0
G
Kontroll siRNA
HIF-1 siRNA
3
***
***
***
2
1
0
0 1 2 4 6 8 1624
Hypoxie [h]
0
1
2
4
mmu-miR-16 (fold change)
4
F
hsa-miR-16 (fold change)
6
E
***
***
**
PHD1 mRNA (fold change)
hsa-miR-16 (fold change)
D
1.5
** *
0.0
0 2 4 6 8 16 24
Stretch [h]
8
**
******
***
2.5
Kontrolle
HIF-1 -/-
*
*
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
Kontrolle
VILI
Hypoxie [h]
(A) Screening von miRNAs mit PHD1 mRNA-Bindungsstellen (Lungenhomogenat). (B) Induktion von miR-16 durch
Stretch (Calu-3). (C) Suppression von PHD1 durch Stretch (Calu-3). (D) Hypoxische Induktion von miR-16 (Calu-3).
(E) Hypoxische Suppression von PHD1 (Calu-3). (F) Fehlende hypoxieabhängige miR-16 Induktion nach
Repression von HIF-1α mittels siRNA (Calu-3). (G) Fehlende miR-16 Induktion nach VILI in HIF-1α-/- Mäusen
(Lungenhomogenat). MW [SD]; n=5-7; * p< 0,05, ** p<0,01, *** p<0,005.
Interpretation
Eine verminderte Expression von PHD1 und Stabilisierung von HIF-1α schützt das
Lungenepithel während VILI vor Schädigung. Dieser protektive Mechanismus wird
über eine HIF-1α-abhängige Induktion von miR15a/16 im Lungenepithel vermittelt.
Literatur
1. Hoegl S, Zwissler B, Eltzschig HK, Vohwinkel C. Acute respiratory distress syndrome following cardiovascular
surgery: current concepts and novel therapeutic approaches. Curr Opin Anaesthesiol. 2016;29(1):94-100.
2. Schneider M, Van Geyte K, Fraisl P, et al. Loss or silencing of the PHD1 prolyl hydroxylase protects livers of mice
against ischemia/reperfusion injury. Gastroenterology. 2010;138(3):1143-1154 e1141-1142.
3. Hoegl S, Brodsky KS, Blackburn MR, Karmouty-Quintana H, Zwissler B, Eltzschig HK. Alveolar Epithelial A2B
Adenosine Receptors in Pulmonary Protection during Acute Lung Injury. J Immunol. 2015;195(4):1815-1824.

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